Báo cáo tiểu luận nhóm 11 chiều thứ 4

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN Chọn tạo các dòng ngô được chuyển gen kháng sâu CryIAc thông qua vi khuẩn Ag

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN Chọn tạo các dòng ngô được chuyển gen kháng sâu

(CryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

KS Trương Quang Toản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN Chọn tạo các dòng ngô được chuyển gen kháng sâu

(CryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

KS Trương Quang Toản Nhóm sinh viên thực hiện : Nhóm 11

: Võ Thị Kim Chi - 21126291 : Nguyễn Duy Hiển - 21126340 : Ngô Thị Thu Ngân - 21126415

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

2 Tổng quan 2

2.1 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2

2.2 Gen kháng sâu CryIAc 4

2.3 Kỹ thuật chuyển gen 5

3 Vật liệu và phương pháp thực hiện 7

3.1 Vật liệu 7

3.2 Phương pháp thực hiện 7

4 Kết quả và kết luận 11

4.1 Kết quả 11

4.2 Kết luận 11

Tài liệu tham khảo 12

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hình ảnh dưới kính hiển vi của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2

Hình 2.2 Hình ảnh nhuộm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2

Hình 2.3 Tạo khối u bằng Agrobacterium tumefaciens 3

Hình 2.4 Ti plasmid của Agrobacterium tumefaciens 4

Hình 2.5 Cấu trúc tinh thể CryIAc 5

Hình 2.6 Sơ đồ kỹ thuật chuyển gen 6

Hình 3.1 Tách Ti plasmid ra khỏi tế bào vi khuẩn 7

Hình 3.2 Tách gen ngoại lai (CryIAc) 8

Hình 3.3 Tạo DNA tái tổ hợp 8

Hình 3.4 Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào 9

Hình 3.5 Lây nhiễm tế bào vi khuẩn với tế bào ngô 9

1 Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Ngô là một trong 3 cây ngũ cốc quan trọng (lúa mì, lúa nước, ngô) của thế giới Ở nước ta, ngô là cây lương thực quan trọng thứ 2 sau cây lúa và là cây hoa màu quan trọng nhất với diện tích 902,3 nghìn ha; sản lượng 4,43 triệu tấn (năm 2021-2022) Trên toàn cầu, thất thoát mùa màng do các loài sâu bệnh gây ra được ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng gây ra chiếm từ 13-16% (Oerke & đồng nghiệp, 1994) Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học trong một thời gian dài tiêu tốn nhiều chi phí và có tác động không tốt đối với sức khỏe của con người, động vật nuôi và môi trường Đến nay hàng loạt gen mã hóa protein

có họat tính diệt côn trùng gây hại (gen kháng côn trùng) như gen cry của vi khuẩn

Bacillus thuringiensis, gen mã hóa các chất ức chế proteaza và α - amylaza được

chuyển vào thực vật nhờ các phương pháp thích hợp với sản phẩm là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiên cứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn

đất Agrobacterium tumefaciens và được ứng dụng rộng rãi là nhờ những ưu điểm không

đòi hỏi dụng cụ đặc biệt, số lượng bản copy thấp và ổn định ở thế hệ con cháu, dễ thao tác invitro, dễ làm Vì vậy, việc phát triển kỹ thuật chuyển gen (gen transfer) để tạo

dòng ngô kháng sâu (CryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là một

trong những cách tiếp cận hiệu quả vừa kiểm soát sự phát triển của sâu bệnh, vừa ngăn chặn hiện tượng khối u ở thân cây, đem lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần đảm bảo an toàn sức khỏe và góp phần trong việc bảo vệ môi trường

1.2 Mục tiêu

Nghiên cứu và phát triển tạo ra giống Ngô được chuyển gen kháng sâu (CryIAc)

thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có khả năng kháng côn trùng, sâu bệnh

hại đem lại hiệu quả kinh tế cao và đảm bảo an toàn sức khỏe cho người sử dụng

2 Tổng quan

2.1 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là một vi khuẩn không bào tử, có dạng hình que, gram

âm, khả năng di chuyển rất cao và có lông roi chiếu theo mọi hướng Vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens có khả năng chuyển một phần nhỏ DNA vào tế bào thực vật và qua đó kích thích tạo khối u (callus) Khối u được tạo nên là do hai loại phytohormone (auxin và cytokinin) được tạo ra ở trong tế bào thực vật bị nhiễm, chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo nên mô không phân hóa (callus) Những khối u này là không gian sống của vi khuẩn Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn cũng được tạo ra trong những khối u này, được vi khuẩn sử dụng làm nguồn carbon, do đó vi khuẩn tự tạo ra nguồn cung cấp thức ăn cho mình trong cây

Hình 2.1 Hình ảnh dưới kính hiển vi của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Hình 2.2 Hình ảnh nhuộm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa một Ti plasmid, là một phân tử DNA

mạch vòng, trong tế bào Ti plasmid tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập Ti-plasmid

có hai vùng chính liên quan đến sự hình thành u, vùng T được chuyển vào tế bào thực vật trong quá trình hình thành u, còn vùng vir (virulence region) xúc tiến và quyết định cho việc giải phóng sợi T-DNA khỏi Ti plasmid đến tế bào thực vật Trên Ti plasmid,

chỉ có duy nhất vùng T-DNA được chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium sang tế bào thực

vật

Hình 2.3 Tạo khối u bằng Agrobacterium tumefaciens

T-DNA là một phần của Ti plasmid, được chuyển vào thực vật Trên đó định vị những gen tạo khối u và tổng hợp opine T-DNA được giới hạn bởi hai vùng, bờ trái và

bờ phải (LB: left border và RB: right border) Các bờ này gồm một trình tự lặp lại của

25 bp, là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA T-DNA được đưa vào DNA trong nhân

tế bào thực vật Vị trí gắn vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiên thường là những vùng có khả năng sao chép

Hình 2.4 Ti plasmid của Agrobacterium tumefaciens

2.2 Gen kháng sâu CryIAc

CryIAc là một protein tinh thể được tạo ra bởi vi khuẩn gram dương, Bacillus

thuringiensis (Bt) trong quá trình hình thành bào tử CryIAc là một trong những nội độc

tố delta do vi khuẩn này tạo ra, có tác dụng như thuốc trừ sâu, có khả năng giết chết sâu bệnh hại, như sâu bướm, sâu cuốn lá và nhiều loại sâu khác Vì lý do này, các gen của chúng đã được đưa vào các loại cây trồng quan trọng về mặt thương mại bằng kỹ thuật

di truyền (như bông và ngô) để tạo ra khả năng kháng sâu bệnh cho những cây trồng đó

Hình 2.5 Cấu trúc tinh thể CryIAc

2.3 Kỹ thuật chuyển gen

Chuyển gen là quá trình đưa vật chất di truyền ngoại lai từ tế bào này vào tế bào khác Vật chất di truyền này thường là DNA, hoặc có thể là RNA

▪ Tách DNA và plasmid của vi khuẩn bằng cùng một loại enzyme cắt

DNA có thể được tách ra khỏi tế bào bằng cách ly tâm nhờ đó các thành phần nặng hơn như nhân được tách ra Gen quan tâm sau đó có thể được khuếch đại đặc hiệu thông qua phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Trình tự gen cũng có thể được tạo ra từ mRNA bằng cách sử dụng enzyme phiên mã ngược những trình tự DNA (cDNA) này thiếu intron

Vector là một phân tử DNA được sử dụng làm phương tiện để mang gen quan tâm vào tế bào lạ Plasmid vi khuẩn thường được sử dụng làm vectơ vì chúng có khả năng

tự sao chép và biểu hiện tự động Các plasmid này có thể được sửa đổi để có thêm chức năng (ví dụ: các dấu hiệu chọn lọc, gen báo cáo, chất kích thích biểu hiện cảm ứng)

▪ Sử dụng enzyme nối gắn gen của tế bào cho vào plasmid tạo DNA tái tổ hợp

Gen quan tâm được chèn vào một vectơ plasmid đã được cắt bằng các enzyme giới hạn tương tự Điều này xảy ra do các đầu dính của gen và vector trùng nhau thông qua việc ghép cặp bazơ bổ sung Sau đó gen và vectơ được ghép lại với nhau nhờ enzyme ligase để tạo thành cấu trúc tái tổ hợp, enzyme ligase nối vectơ và gen bằng cách kết hợp các khung đường photphat của chúng với nhau bằng liên kết cộng hóa trị phosphodiester

▪ Phân lập dòng tế bào có chứa DNA tái tổ hợp bằng các kỹ thuật nhất định nhận biết được sản phẩm đánh dấu (gen phát sáng, gen kháng sinh )

Hình 2.6 Sơ đồ kỹ thuật chuyển gen

3 Vật liệu và phương pháp thực hiện

3.1 Vật liệu

▪ Hai dòng ngô nhập nội: HR8, HR9

▪ Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và vector biến nạp

▪ Các dụng cụ, thiết bị trong phòng thí nghiệm

3.2 Phương pháp thực hiện

Bước 1: Tách plasmid ra khỏi tế bào vi khuẩn

Plasmid từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens lấy ra khỏi tế bào để làm vector mang gen (Ti Plasmid) Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid được nuôi

cấy trong môi trường LB lỏng (trypton 1%, Yeast extract 0,5%, NaCl 1%) ở 37o, tốc độ lắc 200 rpm Dịch huyền phù vi khuẩn sau 16 giờ nuôi cấy (nuôi qua đêm) được sử dụng

để ly trích plasmid

Hình 3.1 Tách Ti plasmid ra khỏi tế bào vi khuẩn

Bước 2: Tách gen ngoại lai (CryIAc)

Tách gen CryIAc ra khỏi DNA của vi khuẩn Bacillus thuringiensis bằng cùng

enzyme giới hạn Enzyme giới hạn có thể xác định vị trí một chuỗi DNA cụ thể và phá

vỡ sợi ngay tại đó Sau phản ứng cắt, thu được nhiều mảnh DNA khác nhau trong mẫu, bao gồm các gen chứa CryIAc Sau đó tiến hành điện di để xác định được CryIAc trên gel agarose, sau khi xác định được vị trí CryIAc trên gel tiến hành tách CryIAc ra khỏi

Hình 3.2 Tách gen ngoại lai (CryIAc)

Bước 3: Tạo DNA tái tổ hợp

DNA CryIAc và plasmid đã được xử lý được trộn chung với nhau trong một tube

Mở vòng Ti plasmid bằng enzyme cắt giới hạn và chèn đoạn gen CryIAc vào vùng T-DNA, tạo thành DNA tái tổ hợp nhờ enzyme nối ligase DNA ligase nối vectơ và gen bằng cách kết hợp các khung đường photphat của chúng với nhau bằng liên kết cộng hóa trị phosphodiester

Hình 3.3 Tạo DNA tái tổ hợp

Bước 4: Plasmid tái tổ hợp được đưa trở lại tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

bằng phương pháp xung điện hoặc sốc nhiệt

Hình 3.4 Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào

Bước 5: Lây nhiễm tế bào vi khuẩn vào tế bào ngô

Ngô non được thu từ các cây ngô mẹ trồng trong nhà lưới Ngay sau khi thu, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng Phôi non sau đó được đưa vào môi trường IM

có bổ sung AS và dịch huyền phù vi khuẩn trong 30-60 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ 21℃, trong điều kiện tối

Hình 3.5 Lây nhiễm tế bào vi khuẩn với tế bào ngô

Bước 6: Nuôi cấy tế bào

Sau khi chuyển gen, cây ngô chuyển gen được nuôi cấy trong điều kiện thích hợp với nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng cần thiết để đảm bảo sự phát triển và phân tích các đặc

Bước 7: Đánh giá sự xuất hiện gen ngoại lai có trong cây

Sau khi cây ngô đã phát triển, tiến hành sàng lọc để xác định những cây mang gen CryIAc Quá trình sàng lọc có thể bao gồm phân tích kiểu gen (sử dụng PCR hoặc Southern blot) hoặc phân tích kiểu hình (xem xét các đặc điểm của cây như khả năng chống sâu bệnh)

4 Kết quả và kết luận

4.1 Kết quả

Sau khi áp dụng kỹ thuật chuyển gen (gen transfer) ta đã thành công tạo được dòng

ngô chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có khả năng chống được sâu

bệnh hại (CryIAc)

4.2 Kết luận

Các phương pháp chuyển gen sẽ tiếp tục phát triển trở thành một trong nhiều công

cụ phục vụ cho sự phát triển của xã hội Ngô kháng côn trùng không cần sử dụng các loại thuốc hóa học nên rất đảm bảo về vấn về sức khỏe và góp phần giải quyết được phần nào vấn đề ô nhiễm môi trường

Tài liệu tham khảo

Hwang, H H và ctv(2017) Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications Arabidopsis Book, 15, e0186 https://doi.org/10.1199/tab.0186

Quý, V V CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO https://tinyurl.com/3jdnj8px

Đồng, N V (2010) TẠO DÒNG NGÔ BIẾN ĐỔI GEN KHÁNG SÂU/KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ https://tinyurl.com/y64azx8t

Đại cương về Công nghệ DNA Tái tổ hợp, https://tinyurl.com/4ua5uspy

Dang, N (2017) Các phương thức chuyển gene https://tinyurl.com/4y5n7bsh

Công nghệ DNA tái tổ hợp (2021) https://tinyurl.com/yc4y5hhs

Gustavo A và ctv (1998) Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation https://tinyurl.com/46fjthtb

https://doi.org/https://doi.org/10.1007/3-540-33774-1_3

Gordon, J E., & Christie, P J (2014) The <i>Agrobacterium</i> Ti Plasmids

https://doi.org/doi:10.1128/microbiolspec.plas-0010-2013

Wang, C., và ctv(2018) Safety of the Bacillus thuringiensis-derived Cry1A.105 protein: Evidence that domain exchange preserves mode of action and safety Regulatory

https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2018.09.003

Lương, Đ T (2002) Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens góp phần tạo vật liệu chọn giống cải bắp kháng sâu ở Việt Nam https://tinyurl.com/kb7ak6h4

Sản lượng ngô năm 2021, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn https://www.mard.gov.vn/Pages/bao-cao-thong-ke.aspx#