Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN Chọn tạo các dòng ngô được chuyển gen kháng sâu CryIAc thông qua vi khuẩn Ag
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN Chọn tạo dịng ngơ chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Ngành : Công Nghệ Sinh Học Lớp : DH21SM Môn : Thiết bị kĩ thuật công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Huỳnh Văn Biết KS Trương Quang Toản Nhóm thực : Nhóm 11 TP HỒ CHÍ MINH, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN Chọn tạo dịng ngơ chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Ngành : Công Nghệ Sinh Học Môn : Thiết bị kĩ thuật công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Huỳnh Văn Biết KS Trương Quang Toản Nhóm sinh viên thực : Nhóm 11 : Võ Thị Kim Chi - 21126291 : Nguyễn Duy Hiển - 21126340 : Ngô Thị Thu Ngân - 21126415 TP HỒ CHÍ MINH, 10/2023 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC HÌNH ii Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu Tổng quan 2.1 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2.2 Gen kháng sâu CryIAc 2.3 Kỹ thuật chuyển gen Vật liệu phương pháp thực 3.1 Vật liệu 3.2 Phương pháp thực Kết kết luận 11 4.1 Kết 11 4.2 Kết luận 11 Tài liệu tham khảo 12 i DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Hình ảnh kính hiển vi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Hình 2.2 Hình ảnh nhuộm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Hình 2.3 Tạo khối u Agrobacterium tumefaciens Hình 2.4 Ti plasmid Agrobacterium tumefaciens Hình 2.5 Cấu trúc tinh thể CryIAc Hình 2.6 Sơ đồ kỹ thuật chuyển gen Hình 3.1 Tách Ti plasmid khỏi tế bào vi khuẩn Hình 3.2 Tách gen ngoại lai (CryIAc) Hình 3.3 Tạo DNA tái tổ hợp Hình 3.4 Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào Hình 3.5 Lây nhiễm tế bào vi khuẩn với tế bào ngô ii Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Ngô ngũ cốc quan trọng (lúa mì, lúa nước, ngơ) giới Ở nước ta, ngô lương thực quan trọng thứ sau lúa hoa màu quan trọng với diện tích 902,3 nghìn ha; sản lượng 4,43 triệu (năm 2021-2022) Trên toàn cầu, thất mùa màng lồi sâu bệnh gây ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng nơng nghiệp hàng năm, thiệt hại côn trùng gây chiếm từ 13-16% (Oerke & đồng nghiệp, 1994) Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học thời gian dài tiêu tốn nhiều chi phí có tác động khơng tốt sức khỏe người, động vật nuôi môi trường Đến hàng loạt gen mã hóa protein có họat tính diệt trùng gây hại (gen kháng trùng) gen cry vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hóa chất ức chế proteaza α - amylaza chuyển vào thực vật nhờ phương pháp thích hợp với sản phẩm trồng có khả tự kháng sâu bệnh Trên giới, nhiều phương pháp chuyển gen thực vật nghiên cứu áp dụng thành công, phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao sử dụng rộng rãi phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens ứng dụng rộng rãi nhờ ưu điểm khơng địi hỏi dụng cụ đặc biệt, số lượng copy thấp ổn định hệ cháu, dễ thao tác invitro, dễ làm Vì vậy, việc phát triển kỹ thuật chuyển gen (gen transfer) để tạo dòng ngô kháng sâu (CryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cách tiếp cận hiệu vừa kiểm soát phát triển sâu bệnh, vừa ngăn chặn tượng khối u thân cây, đem lại hiệu kinh tế cao, góp phần đảm bảo an tồn sức khỏe góp phần việc bảo vệ môi trường 1.2 Mục tiêu Nghiên cứu phát triển tạo giống Ngô chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có khả kháng côn trùng, sâu bệnh hại đem lại hiệu kinh tế cao đảm bảo an toàn sức khỏe cho người sử dụng Tổng quan 2.1 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens vi khuẩn không bào tử, có dạng hình que, gram âm, khả di chuyển cao có lơng roi chiếu theo hướng Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có khả chuyển phần nhỏ DNA vào tế bào thực vật qua kích thích tạo khối u (callus) Khối u tạo nên hai loại phytohormone (auxin cytokinin) tạo tế bào thực vật bị nhiễm, chúng kích thích phân chia tế bào tạo nên mơ khơng phân hóa (callus) Những khối u không gian sống vi khuẩn Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn tạo khối u này, vi khuẩn sử dụng làm nguồn carbon, vi khuẩn tự tạo nguồn cung cấp thức ăn cho Hình 2.1 Hình ảnh kính hiển vi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Hình 2.2 Hình ảnh nhuộm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa Ti plasmid, phân tử DNA mạch vòng, tế bào Ti plasmid tồn đơn vị chép độc lập Ti-plasmid có hai vùng liên quan đến hình thành u, vùng T chuyển vào tế bào thực vật trình hình thành u, cịn vùng vir (virulence region) xúc tiến định cho việc giải phóng sợi T-DNA khỏi Ti plasmid đến tế bào thực vật Trên Ti plasmid, có vùng T-DNA chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium sang tế bào thực vật Hình 2.3 Tạo khối u Agrobacterium tumefaciens T-DNA phần Ti plasmid, chuyển vào thực vật Trên định vị gen tạo khối u tổng hợp opine T-DNA giới hạn hai vùng, bờ trái bờ phải (LB: left border RB: right border) Các bờ gồm trình tự lặp lại 25 bp, trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA T-DNA đưa vào DNA nhân tế bào thực vật Vị trí gắn vào thường ngẫu nhiên, nhiên thường vùng có khả chép Hình 2.4 Ti plasmid Agrobacterium tumefaciens 2.2 Gen kháng sâu CryIAc CryIAc protein tinh thể tạo vi khuẩn gram dương, Bacillus thuringiensis (Bt) trình hình thành bào tử CryIAc nội độc tố delta vi khuẩn tạo ra, có tác dụng thuốc trừ sâu, có khả giết chết sâu bệnh hại, sâu bướm, sâu nhiều loại sâu khác Vì lý này, gen chúng đưa vào loại trồng quan trọng mặt thương mại kỹ thuật di truyền (như ngô) để tạo khả kháng sâu bệnh cho trồng Hình 2.5 Cấu trúc tinh thể CryIAc 2.3 Kỹ thuật chuyển gen Chuyển gen trình đưa vật chất di truyền ngoại lai từ tế bào vào tế bào khác Vật chất di truyền thường DNA, RNA ▪ Tách DNA plasmid vi khuẩn loại enzyme cắt DNA tách khỏi tế bào cách ly tâm nhờ thành phần nặng nhân tách Gen quan tâm sau khuếch đại đặc hiệu thơng qua phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Trình tự gen tạo từ mRNA cách sử dụng enzyme phiên mã ngược trình tự DNA (cDNA) thiếu intron Vector phân tử DNA sử dụng làm phương tiện để mang gen quan tâm vào tế bào lạ Plasmid vi khuẩn thường sử dụng làm vectơ chúng có khả tự chép biểu tự động Các plasmid sửa đổi để có thêm chức (ví dụ: dấu hiệu chọn lọc, gen báo cáo, chất kích thích biểu cảm ứng) ▪ Sử dụng enzyme nối gắn gen tế bào cho vào plasmid tạo DNA tái tổ hợp Gen quan tâm chèn vào vectơ plasmid cắt enzyme giới hạn tương tự Điều xảy đầu dính gen vector trùng thơng qua việc ghép cặp bazơ bổ sung Sau gen vectơ ghép lại với nhờ enzyme ligase để tạo thành cấu trúc tái tổ hợp, enzyme ligase nối vectơ gen cách kết hợp khung đường photphat chúng với liên kết cộng hóa trị phosphodiester ▪ Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận : Dùng muối CaCl2 xung điện cao áp làm dãn màng sinh chất tế bào để DNA tái tổ hợp dễ dàng qua màng ▪ Phân lập dịng tế bào có chứa DNA tái tổ hợp kỹ thuật định nhận biết sản phẩm đánh dấu (gen phát sáng, gen kháng sinh ) Hình 2.6 Sơ đồ kỹ thuật chuyển gen Vật liệu phương pháp thực 3.1 Vật liệu ▪ Hai dịng ngơ nhập nội: HR8, HR9 ▪ Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vector biến nạp ▪ Các dụng cụ, thiết bị phịng thí nghiệm 3.2 Phương pháp thực Bước 1: Tách plasmid khỏi tế bào vi khuẩn Plasmid từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens lấy khỏi tế bào để làm vector mang gen (Ti Plasmid) Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid nuôi cấy môi trường LB lỏng (trypton 1%, Yeast extract 0,5%, NaCl 1%) 37o, tốc độ lắc 200 rpm Dịch huyền phù vi khuẩn sau 16 nuôi cấy (ni qua đêm) sử dụng để ly trích plasmid Hình 3.1 Tách Ti plasmid khỏi tế bào vi khuẩn Bước 2: Tách gen ngoại lai (CryIAc) Tách gen CryIAc khỏi DNA vi khuẩn Bacillus thuringiensis enzyme giới hạn Enzyme giới hạn xác định vị trí chuỗi DNA cụ thể phá vỡ sợi Sau phản ứng cắt, thu nhiều mảnh DNA khác mẫu, bao gồm gen chứa CryIAc Sau tiến hành điện di để xác định CryIAc gel agarose, sau xác định vị trí CryIAc gel tiến hành tách CryIAc khỏi gel dao sắc mỏng ống nạp mẫu sau làm để tránh tạp chất tiến hành PCR Hình 3.2 Tách gen ngoại lai (CryIAc) Bước 3: Tạo DNA tái tổ hợp DNA CryIAc plasmid xử lý trộn chung với tube Mở vòng Ti plasmid enzyme cắt giới hạn chèn đoạn gen CryIAc vào vùng TDNA, tạo thành DNA tái tổ hợp nhờ enzyme nối ligase DNA ligase nối vectơ gen cách kết hợp khung đường photphat chúng với liên kết cộng hóa trị phosphodiester Hình 3.3 Tạo DNA tái tổ hợp Bước 4: Plasmid tái tổ hợp đưa trở lại tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phương pháp xung điện sốc nhiệt Hình 3.4 Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào Bước 5: Lây nhiễm tế bào vi khuẩn vào tế bào ngô Ngô non thu từ ngô mẹ trồng nhà lưới Ngay sau thu, phôi non tách điều kiện vô trùng Phơi non sau đưa vào mơi trường IM có bổ sung AS dịch huyền phù vi khuẩn 30-60 phút, lắc nhẹ nhiệt độ 21℃, điều kiện tối Hình 3.5 Lây nhiễm tế bào vi khuẩn với tế bào ngô Bước 6: Nuôi cấy tế bào Sau chuyển gen, ngô chuyển gen ni cấy điều kiện thích hợp với nhiệt độ, độ ẩm ánh sáng cần thiết để đảm bảo phát triển phân tích đặc tính chuyển gen Bước 7: Đánh giá xuất gen ngoại lai có Sau ngô phát triển, tiến hành sàng lọc để xác định mang gen CryIAc Quá trình sàng lọc bao gồm phân tích kiểu gen (sử dụng PCR Southern blot) phân tích kiểu hình (xem xét đặc điểm khả chống sâu bệnh) 10 Kết kết luận 4.1 Kết Sau áp dụng kỹ thuật chuyển gen (gen transfer) ta thành cơng tạo dịng ngơ chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có khả chống sâu bệnh hại (CryIAc) 4.2 Kết luận Các phương pháp chuyển gen tiếp tục phát triển trở thành nhiều công cụ phục vụ cho phát triển xã hội Ngô kháng côn trùng không cần sử dụng loại thuốc hóa học nên đảm bảo vấn sức khỏe góp phần giải phần vấn đề ô nhiễm môi trường 11 Tài liệu tham khảo Hwang, H H ctv(2017) Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications Arabidopsis Book, 15, e0186 https://doi.org/10.1199/tab.0186 Quý, V V CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO https://tinyurl.com/3jdnj8px Đồng, N V (2010) TẠO DỊNG NGƠ BIẾN ĐỔI GEN KHÁNG SÂU/KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ https://tinyurl.com/y64azx8t Đại cương Công nghệ DNA Tái tổ hợp, https://tinyurl.com/4ua5uspy Dang, N (2017) Các phương thức chuyển gene https://tinyurl.com/4y5n7bsh Công nghệ DNA tái tổ hợp (2021) https://tinyurl.com/yc4y5hhs Gustavo A ctv (1998) Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation https://tinyurl.com/46fjthtb Docampo, R (2006) Acidocalcisomes and Polyphosphate Granules https://doi.org/https://doi.org/10.1007/3-540-33774-1_3 Gordon, J E., & Christie, P J (2014) The Agrobacterium Ti Plasmids Microbiology Spectrum, 2(6), 10.1128/microbiolspec.plas-0010-2013 https://doi.org/doi:10.1128/microbiolspec.plas-0010-2013 Wang, C., ctv(2018) Safety of the Bacillus thuringiensis-derived Cry1A.105 protein: Evidence that domain exchange preserves mode of action and safety Regulatory Toxicology and Pharmacology, 99, 50-60 https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2018.09.003 Lương, Đ T (2002) Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens góp phần tạo vật liệu chọn giống cải bắp kháng sâu Việt Nam https://tinyurl.com/kb7ak6h4 Sản lượng ngô năm 2021, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn https://www.mard.gov.vn/Pages/bao-cao-thong-ke.aspx# 12