báo cáo tiểu luận nhóm 10 sáng thứ 7

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA 18S rRNA CỦA NẤM Branchiomyces sanguinis GÂY BỆNH NẤM MANG Ở CÁ TRONG VI KHUẨN Escherichia coliNhó

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA 18S rRNA CỦA

NẤM Branchiomyces sanguinis GÂY BỆNH

NẤM MANG Ở CÁ TRONG VI KHUẨN

Escherichia coli Nhóm 10

Môn học: Thiết bị và kỹ thuật CNSH BÁO CÁO TIỂU LUẬN

THÀNH VIÊN NHÓM

Vũ Đình Bình

21126285

Diệp Hoàng Quân

21126478

NỘI

DUNG

CHÍNH

Chương 1 Đặt vấn

đề

Chương 2 Tổng quan

Chương 3 Phương pháp

Chương 4 Kết quả

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

 Nấm mang là bệnh cấp tính ở mang gây

ra bởi loài nấm Branchiomyces sanguinis

ảnh hưởng đến nhiều loài cá nước ngọt

 Tỉ lệ nhiễm bệnh là 92% ở cá nuôi vào

mùa hè

 Cá nhiễm bệnh bị suy nhược, hôn mê và

suy hô hấp (do tổn thương mô mang)

 Màu sắc của mang bắt đầu chuyển thành

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về nấm Branchiomyces sanguinis

 Là một loài nấm hại, gây bệnh nấm

mang ở cá nước ngọt

 Nấm có dạng sợi ít phân nhánh không

có vách ngăn, sinh bào tử

 Đường kính sợi nấm 8 – 30µm, đường

kính bào tử tương đối lớn 5 – 9µm

 Nấm sinh trưởng ở nhiệt độ trong

khoảng 14 – 35 °C, phát triển mạnh

khi nhiệt độ trên 20 °C, độ pH trong

khoảng 5,5 – 6,5 (Plumb, 1997)

Hình 2.1 Nấm Branchiomyces sanguinis

dưới kính hiển vi (A) Sợi nấm 40X; (B)

Bào tử nấm 100X (Mohammed et al.,

2019)

2.2 Tổng quan về 18S rRNA

• Là một thành phần của tiểu đơn vị nhỏ ribosome của

sinh vật nhân chuẩn (40S)

• Tương đồng 16S rRNA ở sinh vật nhân sơ và lạp thể,

cũng như 12S rRNA trong ty thể

• Gen 18S rRNA có nhiều trình tự được bảo tồn cao

được sử dụng thường xuyên trong nghiên cứu phát sinh gen

• Gen 18S rRNA là dấu hiệu quan trọng cho phản

ứng chuỗi polymerase mục tiêu ngẫu nhiên (PCR) trong sàng lọc đa dạng sinh học môi trường

Hình 2.2 18S rRNA.

2.3 Tổng quan về kỹ thuật tạo dòng gen

Hình 2.3 Kỹ thuật tạo dòng

gen

 Phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm

hay gene mã hóa cho protein

 DNA tồn tại và tự sao chép độc lập trong

tế bào vật chủ được sử dụng để mang, tăng sinh hoặc biểu hiện số bản sao của đoạn DNA quan tâm gọi là vector

 Gắn đoạn DNA quan tâm vào vector tạo

nên vector tái tổ hợp

 Các dòng tế bào này khi mang DNA tái

tổ hợp được gọi là dòng tái tổ hợp

(recombinant clone)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP

3.1 Ly trích DNA tổng số

 Tại vùng mang cá bị nấm, ta lấy mẫu rồi tiến hành mang đi ly trích DNA tổng số

 Bằng cách đồng nhất mẫu trong hỗn hợp Tris – EDTA – NaCl - SDS, ly tâm, gây kết

tủa các thành phần không cần thiết bằng PCI, kết tủa DNA bằng ethanol 99° và

tinh sạch bằng ethanol 70° ta thu được DNA tổng số Sau đó hòa tan trong dung

dịch TE

3.2 Khuếch đại đoạn gen mã hóa 18S rRNA bằng PCR

Sản phẩm DNA

sau khi ly trích

được sử dụng làm

khuôn để khuếch

đại đoạn DNA mã

hóa 18S rRNA

bằng kỹ thuật

PCR

Bổ sung lần lượt các thành phần vào ống Eppendorf bao gồm:

primer xuôi, primer ngược, buffer, các dNTP, nước cất 2 lần, enzyme

Taq polymerase và DNA

khuôn

Sau khi thực hiện phản ứng PCR bằng máy luân nhiệt trong

2 giờ thu được dung dịch chứa các đoạn DNA mã hóa cho

18S rRNA

Tiến hành điện

di trên gel agarose ở 100 V trong 30 phút

Xử lý bằng hỗn hợp phenol/chloroform

nhằm loại bỏ polysaccharide và các thành phần lẫn tạp

DNA mục tiêu được

thu nhận bằng cách

kết tủa với ethanol

tuyệt đối trong điều

kiện lạnh.

3.3 Xử lý DNA mục tiêu và nối vào vector

Hình 3.2 Vector pGEM-T

Easy.

• Chọn vector pGEM-T Easy vì để tránh

sự tái tổ hợp không đúng, dễ sàng lọc

Vector pGEM-T Easy mang 3

trình tự quan trọng

trình tự khởi đầu sao chép f1 ori

trình tự mã hóa gen kháng ampicilline

trình tự gen lacZ mã hóa cho tiểu phần

α của β – galactosidase

• Trộn vector pGEM-T Easy và dung dịch

chứa DNA mục tiêu, bổ sung enzyme ligase hỗn hợp có chứa DNA tái tổ

3.4 Xử lý tế bào vi khuẩn Escherichia coli ( E coli ) và sàng lọc bằng hệ thống xanh – trắng

Trong operon lac của vi khuẩn E coli

Tiến hành gây đột biến bằng cách loại bỏ một trình tự khoảng

33 nucleotide mã hóa cho tiểu phần α của β - galactosidase

Biến nạp hỗn hợp chứa DNA tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa

18S rRNA vào các tế bào vi khuẩn E coli đã được xứ lý bằng

phương pháp sốc nhiệt

Các tế bào vi khuẩn E coli sau khi được biến nạp bằng sốc nhiệt

sẽ được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung IPTG, X-gal và

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ

 β – galactosidase sẽ thủy phân đường đôi tạo

màu xanh

 DNA tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa 18S

rRNA sẽ bị mất trình tự gen lacZ mã hóa

tiểu phần α dẫn đến bất hoạt β –

galactosidase không thủy phân được X-gal

(khuẩn lạc trắng)

 Chọn những khuẩn lạc có màu trắng, đó là

khuẩn lạc phát triển từ tế bào vi khuẩn E

coli chứa DNA tái tổ hợp mang đoạn gen mã

xanh - trắng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

• Cohen S.N., Chang A.C.Y., Boyer H.W., Helling R.B (1973) Construction of Biologically

Functional Bacterial Plasmids In Vitro Proceedings of the National Academy of Sciences

70:3240-3244 DOI: 10.1073/pnas.70.11.3240

• Field K.G., Olsen G.J., Lane D.J., Giovannoni S.J., Ghiselin M.T., Raff E.C., Pace N.R., Raff

R.A (1988) Molecular Phylogeny of the Animal Kingdom Science 239:748-753 DOI:

10.1126/science.3277277

• Meyer A., Todt C., Mikkelsen N.T., Lieb B (2010) Fast evolving 18S rRNA sequences from

Solenogastres (Mollusca) resist standard PCR amplification and give new insights into mollusk

substitution rate heterogeneity BMC Evolutionary Biology 10:70 DOI:

10.1186/1471-2148-10-70

• Mohammed I., Abed A., Al - Nuaimi A (2019) A COMPARATIVE STUDY BETWEEN THE

POLLUTION OF EUPHRATES RIVER WATER AND THE DRAINAGE WATER AND

THEIR EFFECTS ON BRANCHIOMYCES SANGUINIS GROWTH Pollution Research

38:86-92

Cảm ơn

vì đã lắng

nghe!