báo cáo tiểu luận nhóm 10 sáng thứ 7

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA 18S rRNA CỦA NẤM Branchiomyces sanguinis GÂY BỆNH NẤM MANG Ở CÁ TRONG VI KHUẨN Escherichia coliNhó

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA 18S rRNA CỦA

NẤM Branchiomyces sanguinis GÂY BỆNH

NẤM MANG Ở CÁ TRONG VI KHUẨN

Escherichia coliNhóm 10

Môn học: Thiết bị và kỹ thuật CNSH

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

 Nấm mang là bệnh cấp tính ở mang gây ra bởi loài nấm Branchiomyces sanguinis

ảnh hưởng đến nhiều loài cá nước ngọt  Tỉ lệ nhiễm bệnh là 92% ở cá nuôi vào

mùa hè

 Cá nhiễm bệnh bị suy nhược, hôn mê và suy hô hấp (do tổn thương mô mang).

 Màu sắc của mang bắt đầu chuyển thành

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về nấm Branchiomyces sanguinis

 Là một loài nấm hại, gây bệnh nấm mang ở cá nước ngọt

 Nấm có dạng sợi ít phân nhánh không có vách ngăn, sinh bào tử

 Đường kính sợi nấm 8 – 30µm, đường kính bào tử tương đối lớn 5 – 9µm.

 Nấm sinh trưởng ở nhiệt độ trong khoảng 14 – 35 °C, phát triển mạnh khi nhiệt độ trên 20 °C, độ pH trong khoảng 5,5 – 6,5 (Plumb, 1997).

Hình 2.1 Nấm Branchiomyces sanguinis

dưới kính hiển vi (A) Sợi nấm 40X; (B)

Bào tử nấm 100X (Mohammed et al.,

2019).

2.2 Tổng quan về 18S rRNA

• Là một thành phần của tiểu đơn vị nhỏ ribosome của sinh vật nhân chuẩn (40S)

• Tương đồng 16S rRNA ở sinh vật nhân sơ và lạp thể, cũng như 12S rRNA trong ty thể.

• Gen 18S rRNA có nhiều trình tự được bảo tồn cao được sử dụng thường xuyên trong nghiên cứu phát sinh gen

• Gen 18S rRNA là dấu hiệu quan trọng cho phản ứng chuỗi polymerase mục tiêu ngẫu nhiên (PCR) trong sàng lọc đa dạng sinh học môi trường

Hình 2.2 18S rRNA.

2.3 Tổng quan về kỹ thuật tạo dòng gen

Hình 2.3 Kỹ thuật tạo dòng

 Phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm hay gene mã hóa cho protein.

 DNA tồn tại và tự sao chép độc lập trong tế bào vật chủ được sử dụng để mang, tăng sinh hoặc biểu hiện số bản sao của đoạn DNA quan tâm gọi là vector

 Gắn đoạn DNA quan tâm vào vector tạo nên vector tái tổ hợp.

 Các dòng tế bào này khi mang DNA tái tổ hợp được gọi là dòng tái tổ hợp

(recombinant clone)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP

3.1 Ly trích DNA tổng số

 Tại vùng mang cá bị nấm, ta lấy mẫu rồi tiến hành mang đi ly trích DNA tổng số  Bằng cách đồng nhất mẫu trong hỗn hợp Tris – EDTA – NaCl - SDS, ly tâm, gây kết

tủa các thành phần không cần thiết bằng PCI, kết tủa DNA bằng ethanol 99° và tinh sạch bằng ethanol 70° ta thu được DNA tổng số Sau đó hòa tan trong dung dịch TE.

3.2 Khuếch đại đoạn gen mã hóa 18S rRNA bằng PCR máy luân nhiệt trong

2 giờ thu được dung kết tủa với ethanol tuyệt đối trong điều

kiện lạnh.

3.3 Xử lý DNA mục tiêu và nối vào vector • Trộn vector pGEM-T Easy và dung dịch

chứa DNA mục tiêu, bổ sung enzyme ligase hỗn hợp có chứa DNA tái tổ

3.4 Xử lý tế bào vi khuẩn Escherichia coli ( E coli ) và sàng lọc bằng hệ thống xanh – trắng

Trong operon lac của vi khuẩn E coli

Tiến hành gây đột biến bằng cách loại bỏ một trình tự khoảng 33 nucleotide mã hóa cho tiểu phần α của β - galactosidase

Biến nạp hỗn hợp chứa DNA tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa

18S rRNA vào các tế bào vi khuẩn E coli đã được xứ lý bằng

phương pháp sốc nhiệt

Các tế bào vi khuẩn E coli sau khi được biến nạp bằng sốc nhiệt

sẽ được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung IPTG, X-gal và

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ

 β – galactosidase sẽ thủy phân đường đôi tạo màu xanh.

 DNA tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa 18S rRNA sẽ bị mất trình tự gen lacZ mã hóa

tiểu phần α dẫn đến bất hoạt β –

galactosidase không thủy phân được X-gal (khuẩn lạc trắng).

 Chọn những khuẩn lạc có màu trắng, đó là

khuẩn lạc phát triển từ tế bào vi khuẩn E

coli chứa DNA tái tổ hợp mang đoạn gen mã

xanh - trắng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

• Cohen S.N., Chang A.C.Y., Boyer H.W., Helling R.B (1973) Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids In Vitro Proceedings of the National Academy of Sciences 70:3240-3244 DOI: 10.1073/pnas.70.11.3240.

• Field K.G., Olsen G.J., Lane D.J., Giovannoni S.J., Ghiselin M.T., Raff E.C., Pace N.R., Raff R.A (1988) Molecular Phylogeny of the Animal Kingdom Science 239:748-753 DOI:

• Meyer A., Todt C., Mikkelsen N.T., Lieb B (2010) Fast evolving 18S rRNA sequences from Solenogastres (Mollusca) resist standard PCR amplification and give new insights into mollusk substitution rate heterogeneity BMC Evolutionary Biology 10:70 DOI:

• Mohammed I., Abed A., Al - Nuaimi A (2019) A COMPARATIVE STUDY BETWEEN THE POLLUTION OF EUPHRATES RIVER WATER AND THE DRAINAGE WATER AND

THEIR EFFECTS ON BRANCHIOMYCES SANGUINIS GROWTH Pollution Research 38:86-92.

Cảm ơn vì đã lắng nghe!