Báo cáo tiểu luận chiều t4 nhóm 4

GÂY BỆNH THỐI RỄ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực hiện : NHÓM 4 Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM Fusarium spp GÂY BỆNH

THỐI RỄ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

Nhóm thực hiện : NHÓM 4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM Fusarium spp GÂY BỆNH

THỐI RỄ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

TS HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN THỊ LAN ANH 21126014

ĐỖ NGỌC BẢO CHÂN 21126287 PHẠM THỊ MỸ HẠNH 21126054

Tp Thủ Đức, 10/2023

T M TẮT

Nghiên cứu được tiến hành để xác định sự hiện diện của các gene TEF1 trên

chủng Fusarium spp được phân lập từ đất bằng phương pháp PCR Để tìm kiếm loại

nấm mang các gene này, 30 mẫu đất đã được thu thập từ các xã khác nhau ở huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An Phương pháp PCR được thiết kế với các primer xuôi ở dạng primer chung Kết quả phân tích phát hiện được Fusarium trong 9/30 mẫu Kích thước sản phẩm khuếch đại hoàn toàn trùng khớp với kết quả PCR trên mẫu đối chứng

dương Fusarium spp Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ đặc hiệu của các cặp mồi

đã sử dụng trong nghiên cứu là tương đối cao để phát hiện các gene TEF1 trên chi nấm

Fusarium spp

Từ khóa: Fusarium spp, gene TEF1, PCR

ABSTRACT

Research was conducted to determine the presence of the TEF1 gene in Fusarium spp

isolated from soil by PCR method To search for fungi carrying these genes, 30 soil samples were collected from different communes in Quy Hop district, Nghe An province The PCR method is designed for drift primers in a general form Analytical

results Fusarium was detected in sample 9/30 The size of the monetized product completely coincided with the PCR results on the positive control sample Fusarium

spp The research results show that the specificity of the target pairs used in the study

is relatively high to detect the TEF1 gene on the pink genus Fusarium spp

Keyword: Fusarium spp, gene TEF1, PCR

MỤC LỤC

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nấm Fusarium 3

2.1.1 Phân loại nấm Fusarium 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học 3

2.1.3 Hình thức sinh sản 3

2.2 Tình hình bệnh hại của Fusarium lên cây trồng 4

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5

3.1 Vật liệu 5

3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm 5

3.1.2 Dụng cụ 5

3.1.3 Hóa chất 5

3.1.4 Thiết bị 5

3.2 Bố trí thí nghiệm 5

3.2.1 Tiến hành phân lập mẫu nghi ngờ nhiễm Fusarium 5

3.2.2 Định dạng nấm Fusarium trong mẫu bằng cách phân lập trên môi trường PDA 6

3.2.3 Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR 6

3.2.4 Tiến hành điện di trên gel Agarose 7

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 8

4.1 Tiến hành phân lập mẫu nghi ngờ nhiễm Fusarium 8

4.2 Định dạng nấm Fusarium trong mẫu bằng cách phân lập trên môi trường PDA 8

4.3 Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR 8

4.4 Tiến hành điện di trên gel Agarose 8

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nông nghiệp là một ngành sản xuất góp phần bảo đảm an ninh lương thực, là điều kiện tiên quyết để bảo đảm quyền sống của con người Việt Nam xác định nông nghiệp là trụ đỡ của nền kinh tế Bệnh cây trồng gây tổn thất thu nhập nghiêm trọng cho nhiều nông dân ở Việt Nam, do làm giảm năng suất cây trồng và chất lượng sản phẩm cây trồng Những thiệt hại kể trên là do mầm bệnh tồn tại trong đất bao gồm các tác nhân vi sinh như vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng Theo thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) thiệt hại về bệnh cây trong những năm 90 thế kỷ XX ước tính do nấm gây hại chiếm đến 11,6%, điều này cho thấy tầm quan trọng trong kiểm soát nấm bệnh gây hại cây trồng

Kiểm soát bệnh thành công phụ thuộc vào việc xác định chính xác mầm bệnh

và căn bệnh này Một số bệnh thông thường có thể chẩn đoán chính xác tại vườn bằng

mắt thường như bệnh than đen do nấm Ustilago maydis, bệnh héo rũ mốc trắng do nấm Sclerotinia sclerotiorum, Tuy nhiên, có nhiều bệnh có triệu chứng không đặc

hiệu tương tự nhau như cây héo, còi cọc, vàng lá gây ra bởi các loại nấm hoặc vi khuẩn Các tác nhân vi sinh này có thể được xác định chính xác trong phòng thí

nghiệm bằng cách phân lập trên môi trường nuôi cấy in vitro và kiểm tra các mẫu bằng

kính hiển vi, sau đó nhận dạng bằng cách sử dụng các phương pháp sinh học phân tử

Fusarium spp là loại nấm sợi gây bệnh thường thấy ở thực vật, chúng có mặt ở khắp

nơi trong môi trường sinh sống của con người và một số chủng có khả năng gây bệnh

cho thực vật do sản xuất độc tố mycotoxin (Tsutomu Arie, 2019) Bệnh do Fusarium

là trở ngại đáng kể cho sản xuất cây lương thực và rất khó kiểm soát Chi Fusarium

bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây trồng như bệnh héo do tắc mạch, thối rễ, thân và lõi ngô, thối cổ cây con và thối củ (Burgess và ctv, 2008) Nhiều loài Fusarium khác là loài hoại sinh thường xuất hiện trong đất Các loài hoại sinh thường xâm chiếm rễ và thân bị bệnh Những loài hoại sinh này phát triển nhanh chóng trên môi trường phân lập và có thể dễ dàng phân lập được từ rễ và thân bị bệnh (Burgess và ctv, 2008)

Xuất phát từ lý do trên, nghiên cứu “Phân lập và định danh nấm Fusarium spp

gây bệnh thối rễ bằng phương pháp sinh học phân tử” nhằm nhận dạng loại nấm gây hại cho cây trồng

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và định danh chi nấm Fusarium spp trong điều kiện in vitro và đánh

giá khả năng gây hại cho cây trồng

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Phân lập nấm Fusarium trên môi trường nuôi cấy PDA từ vườn

cam ở huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An

Nội dung 2: Định danh loài nấm Fusarium đã được phân lập dựa vào đặc điểm

hình thái

Nội dung 3: Giải trình tự loài nấm đã được định danh bằng kỹ thuật PCR và điện di

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nấm Fusarium

2.1.1 Phân loại nấm Fusarium

Theo hệ thống phân loại của Michielse và ctv (2009), nấm Fusarium được phân

loại như sau:

Giới : Mycetae (Fungi)

Ngành : Ascomycota

Lớp : Sordariomycetes

Bộ : Hypocreales

Họ : Nectriaceae

Chi : Fusarium

Hình 2.1 Fusarium spp trên

môi trường nuôi cấy invitro

2.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học

Fusarium là một chi nấm lớn phân bố rộng rãi trong đất và gắn liền với thực vật Fusarium được tìm thấy trong đất, thực vật, nước và cả không khí Phần lớn các loài trong fusarium là hoại sinh Một số loài Fusarium spp là những loại nấm gây

bệnh thực vật quan trọng gây thiệt hại kinh tế to lớn trong nông nghiệp do thiệt hại và lãng phí cây trồng trên toàn thế giới trong chăn nuôi Một số loài khác tạo ra độc tố khi chúng xâm nhập và gây hại cho sức khỏe con người và động vật Các độc tố chính phải kể đến là trichothecenes và fumonisins Độc tố có thể gây tổn hại cho các cơ quan

và đặc biệt là cơ chế bảo vệ của vật chủ và có thể tăng cường sự xâm lấn của nấm

Fusarium spp là các nấm sợi có hình thái cấu trúc phức tạp đặc trưng bởi các

sợi nấm phát triển tốt, có vách ngăn, không có sắc tố (Hof, 2020) Sợi nấm mang hình dạng một mạng lưới gồm các sợi phát triển theo kiểu phân nhánh, có màu từ trắng đến hồng nhạt hoặc hơi đỏ

2.1.3 Hình thức sinh sản

Fusarium spp có hai hình thức sinh sản là sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô

tính bằng bào tử Đối với hình thức sinh sản sinh dưỡng, khi gặp môi trường thuận lợi, sợi nấm sẽ sinh trưởng và phân nhánh thành hệ sợi nấm

Với hình thức sinh sản vô tính bằng bào tử, bào tử vô tính có hình dạng hình quạt hoặc hình tròn Các bào tử lớn, đa bào được gọi là macroconidia Macroconidia là

một cụm bào tử mọc lên từ chất nền để tạo thành một khối và được phát triển trong túi bào tử Macroconidia cũng có thể hình thành trên sợi nấm trên không của một số loài Fusarium Microconidia là những bào tử nhỏ, đơn bào, được tạo ra nhiều nhất và thường xuyên nhất, phát triển trên các mono-phialide hoặc poly-phialide ở dạng đầu giả hoặc chuỗi giả Chlamydospores là những bào tử tròn, có thành dày, chứa đầy chất

giống như lipid Hầu hết các loài Fusarium sản xuất chúng và chúng phổ biến trong

đất

2.2 Tình hình bệnh hại của Fusarium lên cây trồng

Fusarium gây bệnh bệnh héo rũ, thối rễ, bệnh bạc lá cây con, bệnh thối ngọn và

bệnh cháy hạt Các bệnh này làm giảm tốc độ tăng trưởng và năng suất cây trồng gây thiệt hại nặng nề đến mùa màng và kinh tế của người nông dân

Bệnh do Fusarium gây ra thường xuyên nhất phải kể đến là bệnh héo rũ Đặc

trưng của bệnh này là các lá dưới bị vàng trước sau đó vàng lan lên các lá trên Triệu chứng héo rũ hoặc biến vàng có thể xuất hiện một vài cành trên cây hay cả cây, cây bị nhiễm bệnh các lá bị vàng, héo sau đó cây chết, cắt ngang thân cây bị bệnh các tế bào thường hóa nâu

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm

Nguồn nấm được phân lập từ mẫu bệnh thu thập được từ cây cam (Citrus sinensis) tại huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An

3.1.2 Dụng cụ

Đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, eppendorf 1,5mL 0,2mL, pipet (ống hút) các loại

3.1.3 Hóa chất

Hóa chất sử dụng bao gồm Sodium hypochlorite, Agar, Ampcillline, Streptomycine, Nystatine, Dextrose, Tartaric acid, Khoai tây, Chloramphenicol, Sodium cloride, Potassium cloride, Tris-HCl

3.1.4 Thiết bị

Tủ cấy vi sinh, máy vortex KMS1 Minishaker IKA, máy ly tâm lạnh Hettich Zentrifugen MikRo 22R, máy PCR Biỏad 170-9703, bồn điện di Thermo EC 330, bồn

ủ nhiệ Memmert Wb/OB 7-45 WBU 45, nguồn điện di GE Healthcare EPS 301 và máy chụp gel GelDoc It Imaging System UVP

3.2 Bố trí thí nghiệm

3.2.1 Tiến hành phân lập mẫu nghi ngờ nhiễm Fusarium

Nghiên cứu tập trung chủ yếu vào giống cam ở Việt Nam là Citrus sinensis từ

vườn cam ở huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An Các mẫu rễ của cây cam bị bệnh thối rễ

Rễ được rửa kỹ dưới vòi nước, và các mô bị nhiễm bệnh ở rễ và tấm đáy được tách ra bằng dao mổ Mô được cắt thành các đoạn nhỏ (dài khoảng 5 mm) và mỗi mảnh được khử trùng bề mặt bằng cách nhúng vào cồn 70% trong vài giây, sau đó ngâm vào natri hypochlorite 1% trong 1 phút và sau đó rửa hai lần trong nước cất vô trùng Sau khi làm khô với điều kiện vô trùng trong tủ cấy, cấy vào môi trường nghèo dinh dưỡng Water Agar (WA) bổ sung (1µg/ml) ampcillline, (1µg/ml) streptomycine, (1µg/ml) nystatine ở 28 °C đến khi xuất hiện tơ nấm Sau 3 - 4 ngày, những tản nấm phát triển tốt được cấy chuyển sang môi trường PDA Mẫu nấm được cấy chuyền nhiều lần trên môi trường PDA cho đến khi thu được nấm thuần chủng

3.2.2 Định dạng nấm Fusarium trong mẫu bằng cách phân lập trên môi trường PDA

Sau khi phân lập, các mẫu nấm được quan sát bằng mắt thường và kính hiển vi

về hình dạng khuẩn lạc là gần tròn đến tròn, đường kính 50-70 mm; hình dạng khuẩn

ty hơi nhám, dẹp, có vách ngăn hoàn chỉnh tạo thành từng tế bào phình to kích thước

từ 7,5-12 μm; màu sắc khuẩn ty có màu trắng hoặc hơi hồng; mặt dưới màu trắng; hình dạng bào tử để tiến hành nhận diện sơ bộ

3.2.3 Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR

Sợi nấm từ các khuẩn lạc được trồng bằng PDA đã được sử dụng để trích xuất DNA bằng cách sử dụng Bộ công cụ lọc DNA men nguyên chất Master Việc xác định phân tử bằng PCR và giải trình tự đã được thực hiện bằng cách nhắm vào gen yếu tố

dịch mã kéo dài Fusarium -1 alpha (TEF1) và gen T12 beta-tubulin của nấm, cũng như

gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ, bộ đệm phiên mã nội phổ quát

(ITS) Fusarium oxysporum f sp cepae (FOC) được tiết ra trong gen xylem 3 (SIX3) được sử dụng để xác định xem các mẫu F oxysporum có thuộc về formae Speciales cepae hay không Trình tự gen một phần peaceodulin (CLPRO) đã được sử dụng để xác định chủng Fusarium proliferatum phân lập Xác nhận cuối cùng về sự

tương đồng giữa các chủng phân lập đạt được bằng phương pháp phân tử lặp lại trình

tự đơn giản (ISSR) –PCR Kỹ thuật phân tử ISSR–PCR cung cấp một hệ thống nhanh chóng, đáng tin cậy và có nhiều thông tin để lấy dấu vân tay DNA bằng cách sử dụng các chuỗi vi vệ tinh làm mồi PCR (Bảng 3.1), để tạo ra các điểm đánh dấu đa điểm

Bảng 3.1 Các primer được sử dụng trong việc phát hiện DNA của chi nấm Fusarium

TEF1- Đặc

hiệu Fusarium (E1E2)

F-ATGGGTAAGGAGGACAAG

680 bp R-GGAAGTACCAGTGATCAT

Gen -tubulin T12, đặc

hiệu cho nấm

F-AACATGCGTGAGATTGTAAGT

580 bp R-TAGTGACCCTTGGCCCAGTTG

Fusarium

oxysporum f sp cesae (F

OC) được tiết ra ở gen

xylem 3 (SIX3)

F-ATGCGTTTCCTTCTGCTTATC

306 bp R-AGGTGCGACATCAATGACAG

PCR được tiến hành với tổng thể tích 20 μL mỗi phản ứng: 1 μL mỗi mồi (nồng

độ 20 μM), 10 μL hỗn hợp phản ứng RedTaq® ReadyMix, 3 µL DNA mẫu và 5 µl nước cất hai lần đã hấp khử trùng Điều kiện PCR: biến tính ở 95 °C trong 5 phút; 35 chu kỳ biến tính ở 95°C trong 15 giây, ủ ở 61 °C trong 15 giây, kéo dài ở 72 °C trong

15 giây; kéo dài lần cuối ở 72 °C trong 10 phút, sau đó trữ lạnh ở 4 °C cho đến khi mẫu thu hồi

3.2.4 Tiến hành điện di trên gel Agarose

Các sản phẩm PCR được phân tách bằng điện di trên gel agarose 1,5% để kiểm tra độ tinh sạch DNA tách chiết từ mẫu nấm Mẫu DNA tinh sạch được lưu giữ ở -20

°C Sản phẩm PCR của các dòng nấm được giải trình tự theo phương pháp Sanger, sau

đó so sánh trình tự thu được với trình tự trên ngân hàng gene NCBI để so sánh trình tự

bộ gene và định danh nấm phân lập

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Tiến hành phân lập mẫu nghi ngờ nhiễm Fusarium

Từ thân và rễ cây cam với các triệu chứng điển hình của bệnh héo rũ, chúng tôi

đã phân lập được 1 chủng nấm đặt tên F có hình thái đại thể: khuẩn lạc nấm có sợi nấm màu trắng bông, tơi xốp, mịn, sợi rất mỏng, rìa ngoài cùng có màu hồng tím

4.2 Định dạng nấm Fusarium trong mẫu bằng cách phân lập trên môi trường PDA

Quan sát hình thái vi thể của chủng nấm ở độ phóng đại 40X nhận thấy: sợi nấm dạng hình sợi, không có vách ngăn, bào tử lớn hình lưỡi liềm, một số hình sợi dài Dựa vào khóa phân loại (Burgess và ctv, 1994), chủng nấm này được phân loại thuộc chi Fusarium spp

4.3 Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR

Sản phẩm PCR của các dòng nấm được giải trình tự theo phương pháp Sanger, sau đó so sánh trình tự thu được với trình tự trên ngân hàng gene NCBI để so sánh trình tự bộ gene và định danh nấm phân lập Kết quả cho thấy tất cả 30 mẫu được

nghiên cứu đều nhiễm nấm thuộc chi Fusarium

4.4 Tiến hành điện di trên gel Agarose

Kết quả cho thấy 30 mẫu được điện di trên gel agarose 1,5% để kiểm tra độ tinh sạch DNA tách chiết từ mẫu nấm hoàn toàn đủ điều kiện tinh sạch và tiến hành đem đi giải trình tự

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Đãng, B Q., Hiển, P H., Chí, C V., Huyền, L T., Lan, N T B & Toàn, N T (2021) Quản lý dịch hại tổng hợp bệnh vàng lá thối rễ hiệu quả cho vườn cam thâm canh tại huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 125(04), 97-104

2 Hùng, T N., Hằng, Đ T V., & Huy, N Đ (2020) Bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum f sp cubense) hại chuối tiêu tại Việt Nam Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 18(5), 315-322

3 Hường, N T T., Bình, N T & Hương, N T (2021) Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của một số chủng nấm đối với nấm Fusarium sp gây bệnh trên cây họ bầu

bí Tạp chí Khoa học Trường Đại học Hồng Đức, 55, 11

4 Hiệu, N Đ., Uyên, N T K., Chi, V T Q., Mai, N N., Trang, N T T & Nghĩa, N

A (2018) Định danh loài nấm Fusarium spp gây bệnh thối vỏ trên cây cao su ở Việt Nam Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 4(2), 74-81

5 Kalman, B., Abraham, D., Graph, S., Perl-Treves, R., Meller Harel, Y., & Degani,

O (2020) Isolation and identification of Fusarium spp., the causal agents of onion (Allium cepa) basal rot in Northeastern Israel Biology, 9(4), 69

6 Arie, T (2019) Fusarium diseases of cultivated plants, control, diagnosis, and molecular and genetic studies Journal of pesticide science, 44(4), 275-281