Báo cáo tiểu luận chiều t4 nhóm 4

GÂY BỆNH THỐI RỄ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực hiện : NHÓM 4 Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN MÔN HỌC PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM Fusarium spp GÂY BỆNH THỐI RỄ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chun ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực : NHĨM Niên khóa : 2021-2025 Tp Thủ Đức, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN MÔN HỌC PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM Fusarium spp GÂY BỆNH THỐI RỄ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ Giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên thực MSSV TS HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN THỊ LAN ANH 21126014 ĐỖ NGỌC BẢO CHÂN 21126287 PHẠM THỊ MỸ HẠNH 21126054 Tp Thủ Đức, 10/2023 i T M TẮT Nghiên cứu đƣợc tiến hành để xác định diện gene TEF1 chủng Fusarium spp đƣợc phân lập từ đất phƣơng pháp PCR Để tìm kiếm loại nấm mang gene này, 30 mẫu đất đƣợc thu thập từ xã khác huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An Phƣơng pháp PCR đƣợc thiết kế với primer xuôi dạng primer chung Kết phân tích phát đƣợc Fusarium 9/30 mẫu Kích thƣớc sản phẩm khuếch đại hồn toàn trùng khớp với kết PCR mẫu đối chứng dƣơng Fusarium spp Kết nghiên cứu cho thấy mức độ đặc hiệu cặp mồi sử dụng nghiên cứu tƣơng đối cao để phát gene TEF1 chi nấm Fusarium spp Từ khóa: Fusarium spp, gene TEF1, PCR ii ABSTRACT Research was conducted to determine the presence of the TEF1 gene in Fusarium spp isolated from soil by PCR method To search for fungi carrying these genes, 30 soil samples were collected from different communes in Quy Hop district, Nghe An province The PCR method is designed for drift primers in a general form Analytical results Fusarium was detected in sample 9/30 The size of the monetized product completely coincided with the PCR results on the positive control sample Fusarium spp The research results show that the specificity of the target pairs used in the study is relatively high to detect the TEF1 gene on the pink genus Fusarium spp Keyword: Fusarium spp, gene TEF1, PCR iii MỤC LỤC Chƣơng MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nấm Fusarium 2.1.1 Phân loại nấm Fusarium 2.1.2 Đặc điểm hình thái đặc tính sinh học 2.1.3 Hình thức sinh sản 2.2 Tình hình bệnh hại Fusarium lên trồng .4 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu .5 3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm 3.1.2 Dụng cụ 3.1.3 Hóa chất 3.1.4 Thiết bị 3.2 Bố trí thí nghiệm .5 3.2.1 Tiến hành phân lập mẫu nghi ngờ nhiễm Fusarium 3.2.2 Định dạng nấm Fusarium mẫu cách phân lập môi trƣờng PDA 3.2.3 Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR 3.2.4 Tiến hành điện di gel Agarose Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .8 4.1 Tiến hành phân lập mẫu nghi ngờ nhiễm Fusarium 4.2 Định dạng nấm Fusarium mẫu cách phân lập mơi trƣờng PDA .8 4.3 Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR 4.4 Tiến hành điện di gel Agarose iv Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nơng nghiệp ngành sản xuất góp phần bảo đảm an ninh lƣơng thực, điều kiện tiên để bảo đảm quyền sống ngƣời Việt Nam xác định nông nghiệp trụ đỡ kinh tế Bệnh trồng gây tổn thất thu nhập nghiêm trọng cho nhiều nông dân Việt Nam, làm giảm suất trồng chất lƣợng sản phẩm trồng Những thiệt hại kể mầm bệnh tồn đất bao gồm tác nhân vi sinh nhƣ vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng Theo thống kê Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) thiệt hại bệnh năm 90 kỷ XX ƣớc tính nấm gây hại chiếm đến 11,6%, điều cho thấy tầm quan trọng kiểm soát nấm bệnh gây hại trồng Kiểm sốt bệnh thành cơng phụ thuộc vào việc xác định xác mầm bệnh bệnh Một số bệnh thơng thƣờng chẩn đốn xác vƣờn mắt thƣờng nhƣ bệnh than đen nấm Ustilago maydis, bệnh héo rũ mốc trắng nấm Sclerotinia sclerotiorum, Tuy nhiên, có nhiều bệnh có triệu chứng không đặc hiệu tƣơng tự nhƣ héo, còi cọc, vàng gây loại nấm vi khuẩn Các tác nhân vi sinh đƣợc xác định xác phịng thí nghiệm cách phân lập môi trƣờng nuôi cấy in vitro kiểm tra mẫu kính hiển vi, sau nhận dạng cách sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử Fusarium spp loại nấm sợi gây bệnh thƣờng thấy thực vật, chúng có mặt khắp nơi mơi trƣờng sinh sống ngƣời số chủng có khả gây bệnh cho thực vật sản xuất độc tố mycotoxin (Tsutomu Arie, 2019) Bệnh Fusarium trở ngại đáng kể cho sản xuất lƣơng thực khó kiểm sốt Chi Fusarium bao gồm nhiều lồi gây bệnh cho trồng nhƣ bệnh héo tắc mạch, thối rễ, thân lõi ngô, thối cổ thối củ (Burgess ctv, 2008) Nhiều loài Fusarium khác loài hoại sinh thƣờng xuất đất Các loài hoại sinh thƣờng xâm chiếm rễ thân bị bệnh Những loài hoại sinh phát triển nhanh chóng mơi trƣờng phân lập dễ dàng phân lập đƣợc từ rễ thân bị bệnh (Burgess ctv, 2008) Xuất phát từ lý trên, nghiên cứu “Phân lập định danh nấm Fusarium spp gây bệnh thối rễ phƣơng pháp sinh học phân tử” nhằm nhận dạng loại nấm gây hại cho trồng 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập định danh chi nấm Fusarium spp điều kiện in vitro đánh giá khả gây hại cho trồng 1.3 Nội dung thực Nội dung 1: Phân lập nấm Fusarium môi trƣờng nuôi cấy PDA từ vƣờn cam huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An Nội dung 2: Định danh loài nấm Fusarium đƣợc phân lập dựa vào đặc điểm hình thái Nội dung 3: Giải trình tự lồi nấm đƣợc định danh kỹ thuật PCR điện di Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nấm Fusarium 2.1.1 Phân loại nấm Fusarium Theo hệ thống phân loại Michielse ctv (2009), nấm Fusarium đƣợc phân loại nhƣ sau: Giới : Mycetae (Fungi) Ngành : Ascomycota Lớp : Sordariomycetes Bộ : Hypocreales Họ : Nectriaceae Chi : Fusarium Hình 2.1 Fusarium spp mơi trƣờng ni cấy invitro 2.1.2 Đặc điểm hình thái đặc tính sinh học Fusarium chi nấm lớn phân bố rộng rãi đất gắn liền với thực vật Fusarium đƣợc tìm thấy đất, thực vật, nƣớc khơng khí Phần lớn lồi fusarium hoại sinh Một số loài Fusarium spp loại nấm gây bệnh thực vật quan trọng gây thiệt hại kinh tế to lớn nông nghiệp thiệt hại lãng phí trồng tồn giới chăn ni Một số loài khác tạo độc tố chúng xâm nhập gây hại cho sức khỏe ngƣời động vật Các độc tố phải kể đến trichothecenes fumonisins Độc tố gây tổn hại cho quan đặc biệt chế bảo vệ vật chủ tăng cƣờng xâm lấn nấm Fusarium spp nấm sợi có hình thái cấu trúc phức tạp đặc trƣng sợi nấm phát triển tốt, có vách ngăn, khơng có sắc tố (Hof, 2020) Sợi nấm mang hình dạng mạng lƣới gồm sợi phát triển theo kiểu phân nhánh, có màu từ trắng đến hồng nhạt đỏ 2.1.3 Hình thức sinh sản Fusarium spp có hai hình thức sinh sản sinh sản sinh dƣỡng sinh sản vơ tính bào tử Đối với hình thức sinh sản sinh dƣỡng, gặp môi trƣờng thuận lợi, sợi nấm sinh trƣởng phân nhánh thành hệ sợi nấm Với hình thức sinh sản vơ tính bào tử, bào tử vơ tính có hình dạng hình quạt hình trịn Các bào tử lớn, đa bào đƣợc gọi macroconidia Macroconidia cụm bào tử mọc lên từ chất để tạo thành khối đƣợc phát triển túi bào tử Macroconidia hình thành sợi nấm khơng số lồi Fusarium Microconidia bào tử nhỏ, đơn bào, đƣợc tạo nhiều thƣờng xuyên nhất, phát triển mono-phialide poly-phialide dạng đầu giả chuỗi giả Chlamydospores bào tử trịn, có thành dày, chứa đầy chất giống nhƣ lipid Hầu hết loài Fusarium sản xuất chúng chúng phổ biến đất 2.2 Tình hình bệnh hại Fusarium lên trồng Fusarium gây bệnh bệnh héo rũ, thối rễ, bệnh bạc con, bệnh thối bệnh cháy hạt Các bệnh làm giảm tốc độ tăng trƣởng suất trồng gây thiệt hại nặng nề đến mùa màng kinh tế ngƣời nông dân Bệnh Fusarium gây thƣờng xuyên phải kể đến bệnh héo rũ Đặc trƣng bệnh dƣới bị vàng trƣớc sau vàng lan lên Triệu chứng héo rũ biến vàng xuất vài cành hay cây, bị nhiễm bệnh bị vàng, héo sau chết, cắt ngang thân bị bệnh tế bào thƣờng hóa nâu CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu 3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm Nguồn nấm đƣợc phân lập từ mẫu bệnh thu thập đƣợc từ cam (Citrus sinensis) huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An 3.1.2 Dụng cụ Đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, eppendorf 1,5mL 0,2mL, pipet (ống hút) loại 3.1.3 Hóa chất Hóa chất sử dụng bao gồm Sodium hypochlorite, Agar, Ampcillline, Streptomycine, Nystatine, Dextrose, Tartaric acid, Khoai tây, Chloramphenicol, Sodium cloride, Potassium cloride, Tris-HCl 3.1.4 Thiết bị Tủ cấy vi sinh, máy vortex KMS1 Minishaker IKA, máy ly tâm lạnh Hettich Zentrifugen MikRo 22R, máy PCR Biỏad 170-9703, bồn điện di Thermo EC 330, bồn ủ nhiệ Memmert Wb/OB 7-45 WBU 45, nguồn điện di GE Healthcare EPS 301 máy chụp gel GelDoc It Imaging System UVP 3.2 Bố trí thí nghiệm 3.2.1 Tiến hành phân lập mẫu nghi ngờ nhiễm Fusarium Nghiên cứu tập trung chủ yếu vào giống cam Việt Nam Citrus sinensis từ vƣờn cam huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An Các mẫu rễ cam bị bệnh thối rễ Rễ đƣợc rửa kỹ dƣới vòi nƣớc, mô bị nhiễm bệnh rễ đáy đƣợc tách dao mổ Mô đƣợc cắt thành đoạn nhỏ (dài khoảng mm) mảnh đƣợc khử trùng bề mặt cách nhúng vào cồn 70% vài giây, sau ngâm vào natri hypochlorite 1% phút sau rửa hai lần nƣớc cất vô trùng Sau làm khô với điều kiện vô trùng tủ cấy, cấy vào môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng Water Agar (WA) bổ sung (1µg/ml) ampcillline, (1µg/ml) streptomycine, (1µg/ml) nystatine 28 °C đến xuất tơ nấm Sau - ngày, tản nấm phát triển tốt đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng PDA Mẫu nấm đƣợc cấy chuyền nhiều lần môi trƣờng PDA thu đƣợc nấm chủng 3.2.2 Định dạng nấm Fusarium mẫu cách phân lập môi trƣờng PDA Sau phân lập, mẫu nấm đƣợc quan sát mắt thƣờng kính hiển vi hình dạng khuẩn lạc gần trịn đến trịn, đƣờng kính 50-70 mm; hình dạng khuẩn ty nhám, dẹp, có vách ngăn hồn chỉnh tạo thành tế bào phình to kích thƣớc từ 7,5-12 μm; màu sắc khuẩn ty có màu trắng hồng; mặt dƣới màu trắng; hình dạng bào tử để tiến hành nhận diện sơ 3.2.3 Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR Sợi nấm từ khuẩn lạc đƣợc trồng PDA đƣợc sử dụng để trích xuất DNA cách sử dụng Bộ công cụ lọc DNA men nguyên chất Master Việc xác định phân tử PCR giải trình tự đƣợc thực cách nhắm vào gen yếu tố dịch mã kéo dài Fusarium -1 alpha (TEF1) gen T12 beta-tubulin nấm, nhƣ gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ, đệm phiên mã nội phổ quát (ITS) Fusarium oxysporum f sp cepae (FOC) đƣợc tiết gen xylem (SIX3) đƣợc sử dụng để xác định xem mẫu F oxysporum có thuộc formae Speciales cepae hay khơng Trình tự gen phần peaceodulin (CLPRO) đƣợc sử dụng để xác định chủng Fusarium proliferatum phân lập Xác nhận cuối tƣơng đồng chủng phân lập đạt đƣợc phƣơng pháp phân tử lặp lại trình tự đơn giản (ISSR) –PCR Kỹ thuật phân tử ISSR–PCR cung cấp hệ thống nhanh chóng, đáng tin cậy có nhiều thơng tin để lấy dấu vân tay DNA cách sử dụng chuỗi vi vệ tinh làm mồi PCR (Bảng 3.1), để tạo điểm đánh dấu đa điểm Bảng 3.1 Các primer đƣợc sử dụng việc phát DNA chi nấm Fusarium Primer TEF1- Đặc hiệu Fusarium (E1E2) Gen -tubulin T12, đặc hiệu cho nấm Fusarium oxysporum f sp cesae (F OC) đƣợc tiết gen xylem (SIX3) Gen peaceodulin phần Fusarium proliferatum (CLPRO) Trình tự F-ATGGGTAAGGAGGACAAG R-GGAAGTACCAGTGATCAT F-AACATGCGTGAGATTGTAAGT R-TAGTGACCCTTGGCCCAGTTG Độ dài đoạn 680 bp 580 bp F-ATGCGTTTCCTTCTGCTTATC R-AGGTGCGACATCAATGACAG F-CTTTCCGCCAAGTTTCTTC 306 bp 585 bp R-TGTCAGTAACTCGACGTTGTTG PCR đƣợc tiến hành với tổng thể tích 20 μL phản ứng: μL mồi (nồng độ 20 μM), 10 μL hỗn hp phn ng RedTaqđ ReadyMix, àL DNA mu v µl nƣớc cất hai lần hấp khử trùng Điều kiện PCR: biến tính 95 °C phút; 35 chu kỳ biến tính 95°C 15 giây, ủ 61 °C 15 giây, kéo dài 72 °C 15 giây; kéo dài lần cuối 72 °C 10 phút, sau trữ lạnh °C mẫu thu hồi 3.2.4 Tiến hành điện di gel Agarose Các sản phẩm PCR đƣợc phân tách điện di gel agarose 1,5% để kiểm tra độ tinh DNA tách chiết từ mẫu nấm Mẫu DNA tinh đƣợc lƣu giữ -20 °C Sản phẩm PCR dòng nấm đƣợc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger, sau so sánh trình tự thu đƣợc với trình tự ngân hàng gene NCBI để so sánh trình tự gene định danh nấm phân lập Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tiến hành phân lập mẫu nghi ngờ nhiễm Fusarium Từ thân rễ cam với triệu chứng điển hình bệnh héo rũ, phân lập đƣợc chủng nấm đặt tên F có hình thái đại thể: khuẩn lạc nấm có sợi nấm màu trắng bơng, tơi xốp, mịn, sợi mỏng, rìa ngồi có màu hồng tím 4.2 Định dạng nấm Fusarium mẫu cách phân lập mơi trƣờng PDA Quan sát hình thái vi thể chủng nấm độ phóng đại 40X nhận thấy: sợi nấm dạng hình sợi, khơng có vách ngăn, bào tử lớn hình lƣỡi liềm, số hình sợi dài Dựa vào khóa phân loại (Burgess ctv, 1994), chủng nấm đƣợc phân loại thuộc chi Fusarium spp 4.3 Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR Sản phẩm PCR dịng nấm đƣợc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger, sau so sánh trình tự thu đƣợc với trình tự ngân hàng gene NCBI để so sánh trình tự gene định danh nấm phân lập Kết cho thấy tất 30 mẫu đƣợc nghiên cứu nhiễm nấm thuộc chi Fusarium 4.4 Tiến hành điện di gel Agarose Kết cho thấy 30 mẫu đƣợc điện di gel agarose 1,5% để kiểm tra độ tinh DNA tách chiết từ mẫu nấm hoàn toàn đủ điều kiện tinh tiến hành đem giải trình tự TÀI LIỆU THAM KHẢO Đãng, B Q., Hiển, P H., Chí, C V., Huyền, L T., Lan, N T B & Toàn, N T (2021) Quản lý dịch hại tổng hợp bệnh vàng thối rễ hiệu cho vƣờn cam thâm canh huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, 125(04), 97-104 Hùng, T N., Hằng, Đ T V., & Huy, N Đ (2020) Bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum f sp cubense) hại chuối tiêu Việt Nam Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, 18(5), 315-322 Hƣờng, N T T., Bình, N T & Hƣơng, N T (2021) Phân lập đánh giá khả đối kháng số chủng nấm nấm Fusarium sp gây bệnh họ bầu bí Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Hồng Đức, 55, 11 Hiệu, N Đ., Uyên, N T K., Chi, V T Q., Mai, N N., Trang, N T T & Nghĩa, N A (2018) Định danh loài nấm Fusarium spp gây bệnh thối vỏ cao su Việt Nam Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thôn, 4(2), 74-81 Kalman, B., Abraham, D., Graph, S., Perl-Treves, R., Meller Harel, Y., & Degani, O (2020) Isolation and identification of Fusarium spp., the causal agents of onion (Allium cepa) basal rot in Northeastern Israel Biology, 9(4), 69 Arie, T (2019) Fusarium diseases of cultivated plants, control, diagnosis, and molecular and genetic studies Journal of pesticide science, 44(4), 275-281