Báo cáo tiểu luận chiều t4

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Trang 2 iBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHƯƠNG PHÁP REAL TIME PCR SỬ DỤNG ĐẦU DÒ

TAQMAN

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực hiện : NHÓM 3

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHƯƠNG PHÁP REAL TIME PCR SỬ DỤNG ĐẦU DÒ

TAQMAN

TS Huỳnh Văn Biết NGUYỄN NGỌC KIM NGÂN

HUỲNH THỊ DIỆU NGUYỄN DƯƠNG PHƯƠNG YẾN

Tp Thủ Đức, ngày 18 tháng 10 năm 2023

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Giới thiệu về kỹ thuật real-time PCR 1

1.2 Định nghĩa 1

Chương 2 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG REAL – TIME PCR 3

2.1 Thành phần 3

2.2 Thiết kế mồi và probe trong phản ứng Real – time PCR 3

2.3 Nguyên lí hoạt động 3

Chương 3.TAQMAN 6

3.1 Định nghĩa 6

3.2.Nguyên lý hoạt dộng của Taqman 7

Chương 4 THIẾT BỊ ROTOR GENE Q 10

4.1 Cấu tạo bên ngoài 10

4.2 Cấu tạo bên trong 11

Chương 5 ỨNG DỤNG 12

ii

5.1 Định tính 12

5.2 Định lượng 12

5.2.1 Định lượng tuyệt đối 12

5.2.2 Định lượng tương đối 14

5.3 Xác định thực phẩm GMO 15

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

CMV: Cytomegalovirus

EBV: Epstein-Bar virus

FAO: Food and Agriculture Organization

GMO: Genetically Modified Organism

HBV: Hepatitis B Virus

HCV: Hepatitis C virus

HPV: Human Papilloma Virus

MGB: minor groove binder

OD: Optical density

PCR: Polymerase - Chain - Reaction

qPCR: Real - time Polymerase – Chain - Reaction

SNP: Single nucleotide polymorphism

WHO: World Health Organization

iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1 Các giai đoạn của real time pcr 2

Hình 2 Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật Real-time PCR 4

Hình 3 Cấu trúc của Taqman MGB 6

Hình 4 Minh hoạ thiết kế đầu dó Taqman 6

Hình 5 Sự liên kết của đầu dò và mồi trong giai đoạn ủ 7

Hình 6 Giai đoạn mở rộng của Real – time PCR 7

Hình 7 Chất khử và chất phóng xạ không còn nằm gần nhau 8

Hình 8 Cách đầu dò phát ra tín hiệu 8

Hình 9 Nguyên lí hoạt động của đầu dò 9

Hình 10 Thiết bị để phân tích kết quả Real – time PCR 10

Hình 11 Cấu tạo đằng trước 10

Hình 12.Cấu tạo đằng sau 10

Hình 13 Mặt cắt và bộ phận bên trong 11

Hình 14 Cấu trúc virus HBV 14

Hình 15 Nguyên lí định lượng HBV 14

Hình 16 Chu kì và biểu đồ trong ứng dụng phát hiện GMO 17

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Giới thiệu về kỹ thuật real-time PCR

Việc phát minh ra của Kary Mullis vào năm 1984 được coi là một cuộc cách mạng trong khoa học Tuy nhiên, kết quả phản ứng PCR chỉ được biết sau khi hoàn thành và phải thực hiện một số kỹ thuật đi kèm khác như điện di hay đo OD (Optical density) Bên cạnh

đó, kết quả ghi nhận được của phản ứng là nồng độ cuối cùng của sản phẩm PCR, trong khi

sự thay đổi nồng độ trong quá trình phản ứng cũng như ảnh hưởng của lượng mẫu đầu vào đến kết quả không được ghi nhận

Để khắc phục được những vấn đề này, PCR đã được cải tiến thành real-time PCR (hay PCR), đây được coi là một bước nhảy vọt về công nghệ vào cuối thế kỷ 20, giúp mở ra những ứng dụng mới vượt bậc cho các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới Máy real-time PCR lần đầu tiên được thương mại hóa bởi Applied Biosystems vào năm 1996, công nghệ này nhanh chóng phát triển thành một thị trường cạnh tranh, hàng loạt các công ty kinh doanh sản phẩm sinh học cho ra mắt các dòng máy real-time PCR

1.2 Định nghĩa Real – time PCR

Về mặt định nghĩa, kỹ thuật real-time PCR cho phép biết được số lượng bản sao DNA mục tiêu tạo ra ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng bằng công nghệ huỳnh quang Ngoài việc có thể xác định được sự có mặt của trình tự DNA mục tiêu (Real-time PCR định tính), Real – time PCR còn có thể định lượng được DNA mục tiêu (qPCR định lượng) có trong mẫu ban đầu qua mỗi chu kỳ

Hình 1 Các giai đoạn của real time pcr

Kết quả được thể hiện dưới dạng biểu đồ quan sát được qua mỗi chu kỳ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về hiệu quả khuếch đại DNA mục tiêu Real-time PCR yêu cầu có thiết bị

đo cường độ phát huỳnh quang từ ống mẫu và cài chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả về sự biến đổi cường độ huỳnh quang

2.2 Thiết kế mồi và probe trong phản ứng Real – time PCR

Các nguyên tắc trong việc thiết kế mồi :

Mẫu dò phải nằm gần primer (để không ảnh hưởng đến quá trình đọc tín hiệu) Hầu hết mẫu dò có chiều dài ngắn hơn 18-22 nu Không nên có G ở đầu 5’ vì G hấp thụ tín hiệu huỳnh quang làm sai lệch kết quả

Trình tự mẫu dò có hàm lượng GC khoảng 30-80% Mẫu dò phải có nhiều base C hơn G.Nhiệt độ nóng chảy của mẫu dò lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi 8 – 100C

2.3 Nguyên lý hoạt động

Chu trình nhiệt của real-time PCR cũng có 3 giai đoạn cơ bản tương tự như PCR bao gồm:

Hình 2 Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật Real-time PCR

Giai đoạn biến tính: Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 94-950C, lúc này liên kết hydro giữa các bazơ trong sợi DNA mạch đôi bị phá vỡ, dẫn đến tạo thành 2 sợi đơn DNA Mỗi sợi đơn này trở thành khuôn để tổng hợp mạch mới Thời gian biến tính có thể tăng lên nếu thành phần khuôn có nhiều GC

Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-650C trong 20-40 giây để probe và mồi gắn lần lượt vào sợi DNA khuôn và bắt đầu quá trình tổng hợp mạch mới nhờ vào sự hoạt động của DNA polymerase

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 720C, đây là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động tổng hợp mạch mới của DNA polymerase Giai đoạn này không bắt buộc ở một số chu trình Real – time PCR, do kỹ thuật này thường dùng khuếch đại các đoạn có trình tự

5

ngắn hơn PCR, vào khoảng <200bp, do vậy chỉ cần hai bước biến tính và bắt cặp là đủ để khuếch đại đoạn gen mục tiêu trong phản ứng Real – time PCR Chu trình chỉ gồm 2 bước giúp tiết kiệm thời gian, nhanh chóng phát hiện và định lượng được DNA

Các giai đoạn này được thực hiện thông qua sự luân chuyển nhiệt độ giữa các chu kỳ Qua mỗi chu kỳ, tín hiệu huỳnh quang sẽ được ghi nhận có sự gia tăng tương ứng với lượng bản sao DNA nhân lên theo cấp số lũy thừa

CHƯƠNG 3 TAQMAN

3.1 Định nghĩa

Taqman là mẫu dò phổ biến được sử dụng trong Real – time PCR, mẫu dò này hoạt động dựa trên khả năng cắt exonuclease của Taq polymerase Ngoài ra, còn có TaqMan MGB (minor groove binder) với cấu trúc đầu 3’ chứa một phân tử có khả năng bám vào rãnh xoắn nhỏ của DNA Khi mẫu dò này bám vào trình tự đích, một rãnh nhỏ ngắn được hình thành trên DNA làm tăng Tm, dẫn đến mẫu dò bám chặt hơn hay nói cách khác mẫu

dò vẫn bám chắc ở nhiệt độ Ta cần thiết cho mồi mà không cần tăng chiều dài

Hình 3 Cấu trúc của Taqman MGB

Tagman là oligonucleotide dài 18 đến 22 nu, được đánh dấu chất phát quang ở đầu 5’ và chất ngắt tín hiệu ở đầu 3’

Hình 4 Minh hoạ thiết kế đầu dò Taqman

7

3.2 Nguyên lý hoạt dộng của Taqman

Khi probe nguyên vẹn và 2 chất ở khoảng cách gần thì chất ngắt tín hiệu làm cộng hưởng chất phát quang bởi cơ chế FRET nên không thể tạo ra tín hiệu huỳnh quang Nếu DNA đích có mặt, probe gắn ở sau mồi và bị cắt bởi hoạt tính 5’ exonuclease của Taq polymerase khi phản ứng diễn ra Sự cắt probe làm tách rời 2 chất báo cáo khỏi quencher nên tín hiệu phát quang được tạo ra

Hình 5 Sự liên kết của đầu dò và mồi trong giai đoạn ủ

Hình 6 Giai đoạn mở rộng của Real – time PCR

Hình 8 Cách đầu dò phát ra tín hiệu Hình 7 Chất khử và chất phóng xạ không còn nằm gần

nhau nữa và huỳnh quang được phát ra

9

Hình 9 Nguyên lí hoạt động của đầu dò

Ưu điểm: sự dặc hiệu của probe là để sinh ra tín hiệu huỳnh quang , probe có thể đánh dấu với các chất báo cáo khác nhau, cho phép khuếch đại và phát hiễn 2 trình tự đích cùng

1 phản ứng

Nhược điểm: Tổng hợp các probe khác nhua đòi hỏi các trình tự khác nhau

CHƯƠNG 4 THIẾT BỊ ROTOR GENE Q

4.1 Cấu tạo bên ngoài

Hình 10 Thiết bị để phân tích kết quả Real – time PCR

Hình 11 Cấu tạo đằng trước

Hình 12 Cấu tạo đằng sau

11

Nắp dạng trượt trên nắp có đèn tín hiệu biểu thị máy đang hoạt động, block nhiệt dạng rotor giống rotor máy li tâm

Đằng sau có nút bật tắt nguồn, quạt, nguồn cắm với máy tính, cổng usb

4.2 Cấu tạo bên trong

Hình 13 Mặt cắt và bộ phận bên trong

Phần gia nhiệt: Công nghệ gia nhiệt quạt giả Nhiệt phủ từ nấm máy xuống buồng máy Khi máy hoạt động các ống mẫu được đặt trên 1 đĩa rotor quay tròn liên tục như rotor của máy ly tâm có thể quay 400 rtmp/ phút giúp tản nhiệt đều và ly tâm mẫu tránh tạo bọt khi

Phần phát ảnh sang mỗi bước sóng kích thích được 1 chiếc đèn led tương ứng phát

ra Sau khi chu kì kết thúc, lần lượt các đèn led sẽ chiếu ánh sáng vào từng phản ứng và tia sáng phát xạ sẽ được thu nhận và xử lý

Phần thu nhận ảnh sáng: Detector PMIT chỉ có 1 mắt đọc duy nhất, quét qua từng đẩy tube mẫu (khi tube mẫu đang quay) chuyển tín hiệu quang thành tín hiệu điện

Hệ thống quang có định giúp thu nhận tín hiệu ổn định chính xác mà không cần sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang tham chiếu

CHƯƠNG 5 ỨNG DỤNG

5.1 Định tính

Định tính các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, nấm, ngoài ra việc tối ưu trình tự mẫu dò có thể giúp phát hiện cả các đột biến điểm hay các đoạn DNA có đa hình trình tự đơn (SNP),

Phát hiện khác biệt SNP và xác định kiểu di truyền

Ví dụ với Taqman probe, để phát hiện sự khác biệt SNP và định genotype, nhà nghiên cứu phải thiết kế các Taqman probe (mang các chất phát huỳnh quang R khác nhau) bắt cặp trên cùng vị trí của sản phẩm khuếch đại nhưng các probe này có sự khác biệt về trình tự tương ứng với sự khác biệt SNP hay khác biệt trình tự giúp phân biệt genotype

Trong giai đoạn bắt cặp thì probe có trình tự tương thích nhất với trình tự đích trên sản phẩm khuếch đại sẽ bắt cặp lên sợi đích và sẽ bị Taq polymerase thủy giải, do vậy đường biểu diễn khuếch đại tương ứng với màu huỳnh quang của probe sẽ ngóc lên và đến cực đại trong khi tín hiệu của các màu huỳnh quang khác sẽ vẫn nằm dưới huỳnh quang nền vì các probe tương ứng vẫn còn nguyên vẹn và không bị thủy giải

5.2 Định lượng

5.2.1 Định lượng tuyệt đối

Virus viêm gan B (Hepatitis B Virus – HBV) là một trong những tác nhân chính gây viêm gan siêu vi ở người Trên 2 tỉ người trên thế giới nhiễm HBV, trong đó hơn 350 triệu người nhiễm mạn tính Viêm gan mạn tính do HBV có thể dẫn đến xơ gan và ung thư gan Các chẩn đoán lâm sàng, sinh hóa thường không đặc hiệu trong khi các xét nghiệm miễn dịch thì không hiệu quả trong nhiều trường hợp - ở giai đoạn cửa sổ, ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch và trên các týp huyết thanh đột biến của virus Mặt khác, các chẩn đoán trên không cho kết quả định lượng trong khi việc xác định hàm lượng virus ở bệnh nhân là cần

Mẫu máu toàn phần được ly tâm phân đoạn để thu lấy huyết thanh

DNA bộ gene của các phần tử virus HBV có trong huyết thanh

Vùng gene nhân bản được chọn phải có tính bảo tồn cao để đảm bảo sự nhân bản diễn ra đồng đều giữa các genotype khác nhau của HBV

Sử dụng một cặp mồi và mẫu dò Taqman bắt cặp trên một vùng dài 118 bp của gene

S trong bộ gene HBV

Việc định lượng trình tự mục tiêu cho vào phản ứng được thực hiện tại giai đoạn pha

mũ của quá trình nhân bản Số lượng trình tự mục tiêu ban đầu càng cao thì tín hiệu huỳnh quang thu được càng sớm vượt cao hơn tín hiệu huỳnh quang

Nguyên lý kỹ thuật như sau:

Hình 15 Nguyên lý định lượng HBV

HBV-DNA định lượng bằng taqman probe được thiết kế nhắm vào trình tự bảo tồn của vùng preS/S của bộ gen HBV cho phép định lượng nồng độ HBV-DNA trong mẫu thử của cả 10 kiểu gen khác nhau của HBV với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Xét sử dụng cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò (HBsF, HBsR, HBsTaq) khuếch đại một trình tự đặc hiệu của bộ gen HBV khoảng 80bp nằm trên gene S Xét nghiệm thực hiện trên trên hệ thống máy Realtime PCR 7500 của ABI

Ngoài ra kỹ thuật realtime PCR được ứng dụng để phát hiện các mầm bệnh khác như lao, não mô cầu, HPV, HSV, CMV, EBV…

5.2.2 Định lượng tương đối

Trong lĩnh vực thủy sản, đặc biệt là ngành nuôi tôm công nghiệp đang phải đối mặt với nhiều rủi ro, trong đó, dịch bệnh nguy hiểm trên tôm như bệnh đốm trắng trên tôm EMS, EHP, IMNV, YHV… đã gây thiệt hại kinh tế rất nghiệm trọng Trước thực trạng trên, kỹ thuật Real-time PCR được đánh giá là công cụ hữu hiệu và được sử dụng phổ biến giúp chẩn đoán sớm và phòng ngừa sự lây lan dịch bệnh Đồng thời, kỹ thuật Real-time

an toàn về thực phẩm GM hiện nay vẫn là chủ đề nóng gây tranh cãi thời gian qua, mặc dù

tổ chức WHO và FAO chưa có báo cáo nào đề cập đến những tác động nguy hại ở mức báo động của GMO cho người sử dụng như đột biến hay gây tử vong

Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu khoa học cũng cho thấy loại thực phẩm này có khả năng gây dị ứng, gây kháng kháng sinh hay rối loạn quá trình chuyển hóa Luật ghi nhãn bắt buộc thường có hiệu lực dựa trên tỷ lệ GMO của bất kỳ thành phần cụ thể nào trong một sản phẩm thực phẩm, mặc dù một số quy định dựa trên tỷ lệ phần trăm trên toàn bộ mặt hàng thực phẩm Các quy tắc hạn chế nhất, như Liên minh châu Âu, Ả Rập Xê-út, Thổ Nhĩ Kỳ và Úc, có ngưỡng 0,9%

Những nước khác cho phép bao gồm GMO ở mức độ cao hơn, với Hàn Quốc là 3%

và Nhật Bản là 5% Úc và New Zealand yêu cầu các thành phần GMO phải được ghi chú trong bảng thành phần, trừ khi toàn bộ mặt hàng là biến đổi gen Trong trường hợp đó, thông tin phải được bao gồm bên cạnh tên, theo Cơ quan Tiêu chuẩn Thực phẩm Australia, New Zealand Hàn Quốc có ngưỡng dán nhãn GMO cao hơn, với bất kỳ thứ gì dưới 3% được coi là không cố ý

Do vậy, kiểm nghiệm thực phẩm biến đổi gen là điều cần thiết để xác nhận và định lượng sinh vật biến đổi gen trong các mẫu thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi Kỹ thuật real-time PCR thường được ứng dụng hiệu quả trong dán nhãn và xác định hàm lượng GMO Mỗi tổ chức hay quốc gia sẽ quy định phần trăm GMO để dán nhãn cho mẫu, do đó để giúp doanh nghiệp thực phẩm có thể xuất khẩu vào các thị trường trên thế giới, việc phát hiện sinh vật biến đổi gen là rất quan trọng

Ví dụ đậu biến đổi gene để kháng được thuốc trừ cỏ là do nhận được gene giúp phục hồi một đường biến dưỡng acid amin thiết yếu vốn dĩ bị glyphosate phá hủy Đây chính là gene enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) được cô lập từ vi khuẩn có ở đất,

đó là Agrobacterium sp dòng cp4 Gene này được chèn vào vector là virus khảm súp-lơ (cauliflower mosaic virus, CaMV) có mang promoter 35S rồi chuyển vào cây đậu Vector

có mang promoter 35S này rất thường được dùng để chuyển gene trong thực vật là vì phổ chuyển gene và biểu hiện được gene rất rộng cho nhiều lọai cây Ngoài ra promoter 35S có trình tự rất ổn định và được biết rõ Chính vì vậy nên CaMV 35S promoter là đối tượng chính yếu dùng để định tính và định lượng tỷ lệ biến đổi gene trong các sinh vật hay sản phẩm biến đổi gene Sau đây là một ví dụ định lượng tỷ lệ biến đổi gene trong đậu nành để minh họa Để thực hiện được thử nghiệm, trước hết phải có các mẫu chuẩn tức là mẫu đậu nành đã có trộn thêm đậu nành biến đổi gene theo tỷ lệ biết trước từ 0% đến 5% (mua từ Sigma) Gene đích để định lượng là promoter 35S, gene tham chiếu là gene lectin của đậu nành Các mẫu chuẩn và mẫu thử đểu được tách chiết DNA (dùng bộ tách chiết DNA cho thực vật, như bộ DNeasy plant mini kit của Qiagen có thể tách chiết được 1-2mg từ 55-100mg sản phẩm) Thực hiện real-time PCR (sử dụng SYBR hay Taqman probe) định lượng hai gene trên một lượng nhất định DNA tách chiết được từ các mẫu thử và mẫu chuẩn Kết quả Ct được ghi nhận và trình bày trong bảng 9 Biểu đồ 10 trình bày mối quan

hệ tuyến tính giữa tỷ lệ GMO% và DCt

Hình 16 Chu kì và biểu đồ trong ứng dụng phát hiện GMO