Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Trang 2 iBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KH
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN MÔN THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHƯƠNG PHÁP REAL TIME PCR SỬ DỤNG ĐẦU DỊ TAQMAN Ngành học : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực : NHĨM Tp Thủ Đức, ngày 18 tháng 10 năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN MÔN THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHƯƠNG PHÁP REAL TIME PCR SỬ DỤNG ĐẦU DÒ TAQMAN Hướng dẫn báo cáo Sinh viên thực TS Huỳnh Văn Biết NGUYỄN NGỌC KIM NGÂN HUỲNH THỊ DIỆU NGUYỄN DƯƠNG PHƯƠNG YẾN Tp Thủ Đức, ngày 18 tháng 10 năm 2023 i MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ii DANH SÁCH CÁC BẢNG iii DANH SÁCH CÁC HÌNH iv Chương MỞ ĐẦU .1 1.1 Giới thiệu kỹ thuật real-time PCR .1 1.2 Định nghĩa Chương NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG REAL – TIME PCR 2.1 Thành phần .3 2.2 Thiết kế mồi probe phản ứng Real – time PCR .3 2.3 Nguyên lí hoạt động .3 Chương 3.TAQMAN .6 3.1 Định nghĩa 3.2.Nguyên lý hoạt dộng Taqman Chương THIẾT BỊ ROTOR GENE Q 10 4.1 Cấu tạo bên 10 4.2 Cấu tạo bên 11 Chương ỨNG DỤNG 12 5.1 Định tính .12 5.2 Định lượng 12 5.2.1 Định lượng tuyệt đối 12 5.2.2 Định lượng tương đối 14 5.3 Xác định thực phẩm GMO 15 ii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT CMV: Cytomegalovirus EBV: Epstein-Bar virus FAO: Food and Agriculture Organization GMO: Genetically Modified Organism HBV: Hepatitis B Virus HCV: Hepatitis C virus HPV: Human Papilloma Virus MGB: minor groove binder OD: Optical density PCR: Polymerase - Chain - Reaction qPCR: Real - time Polymerase – Chain - Reaction SNP: Single nucleotide polymorphism WHO: World Health Organization iii DANH SÁCH CÁC BẢNG iv DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình Các giai đoạn real time pcr Hình Nguyên lý hoạt động kỹ thuật Real-time PCR Hình Cấu trúc Taqman MGB Hình Minh hoạ thiết kế đầu dó Taqman Hình Sự liên kết đầu dò mồi giai đoạn ủ Hình Giai đoạn mở rộng Real – time PCR Hình Chất khử chất phóng xạ khơng cịn nằm gần Hình Cách đầu dị phát tín hiệu Hình Ngun lí hoạt động đầu dị Hình 10 Thiết bị để phân tích kết Real – time PCR 10 Hình 11 Cấu tạo đằng trước 10 Hình 12.Cấu tạo đằng sau 10 Hình 13 Mặt cắt phận bên 11 Hình 14 Cấu trúc virus HBV 14 Hình 15 Ngun lí định lượng HBV 14 Hình 16 Chu kì biểu đồ ứng dụng phát GMO 17 v CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Giới thiệu kỹ thuật real-time PCR Việc phát minh Kary Mullis vào năm 1984 coi cách mạng khoa học Tuy nhiên, kết phản ứng PCR biết sau hoàn thành phải thực số kỹ thuật kèm khác điện di hay đo OD (Optical density) Bên cạnh đó, kết ghi nhận phản ứng nồng độ cuối sản phẩm PCR, thay đổi nồng độ trình phản ứng ảnh hưởng lượng mẫu đầu vào đến kết không ghi nhận Để khắc phục vấn đề này, PCR cải tiến thành real-time PCR (hay PCR), coi bước nhảy vọt công nghệ vào cuối kỷ 20, giúp mở ứng dụng vượt bậc cho nhà nghiên cứu toàn giới Máy real-time PCR lần thương mại hóa Applied Biosystems vào năm 1996, cơng nghệ nhanh chóng phát triển thành thị trường cạnh tranh, hàng loạt công ty kinh doanh sản phẩm sinh học cho mắt dòng máy real-time PCR 1.2 Định nghĩa Real – time PCR Về mặt định nghĩa, kỹ thuật real-time PCR cho phép biết số lượng DNA mục tiêu tạo sau chu kỳ nhiệt phản ứng cơng nghệ huỳnh quang Ngồi việc xác định có mặt trình tự DNA mục tiêu (Real-time PCR định tính), Real – time PCR cịn định lượng DNA mục tiêu (qPCR định lượng) có mẫu ban đầu qua chu kỳ Hình Các giai đoạn real time pcr CHƯƠNG NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA REAL- TIME PCR 2.1 Thành phần Tương tự PCR, kỹ thuật real-time PCR bao gồm thành phần dNTP, DNA Polymerase, DNA mạch khuôn, cặp mồi dung dịch đệm Điểm khác biệt real-time PCR sử dụng chất phát huỳnh quang để máy phát đo cường độ tín hiệu từ chất Khi phản ứng nhân xảy tới chu kỳ định, cường độ tín hiệu huỳnh quang bắt đầu có gia tăng rõ rệt tương quan với số lượng DNA tạo Kết thể dạng biểu đồ quan sát qua chu kỳ, từ đưa đánh giá hiệu khuếch đại DNA mục tiêu Real-time PCR yêu cầu có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ ống mẫu cài chương trình phần mềm cho phép xử lý kết biến đổi cường độ huỳnh quang 2.2 Thiết kế mồi probe phản ứng Real – time PCR Các nguyên tắc việc thiết kế mồi : Mẫu dò phải nằm gần primer (để khơng ảnh hưởng đến q trình đọc tín hiệu) Hầu hết mẫu dị có chiều dài ngắn 18-22 nu Khơng nên có G đầu 5’ G hấp thụ tín hiệu huỳnh quang làm sai lệch kết Trình tự mẫu dị có hàm lượng GC khoảng 30-80% Mẫu dị phải có nhiều base C G.Nhiệt độ nóng chảy mẫu dị lớn nhiệt độ nóng chảy mồi – 100C 2.3 Nguyên lý hoạt động Chu trình nhiệt real-time PCR có giai đoạn tương tự PCR bao gồm: Hình Nguyên lý hoạt động kỹ thuật Real-time PCR Giai đoạn biến tính: Hỗn hợp phản ứng gia nhiệt đến 94-950C, lúc liên kết hydro bazơ sợi DNA mạch đôi bị phá vỡ, dẫn đến tạo thành sợi đơn DNA Mỗi sợi đơn trở thành khuôn để tổng hợp mạch Thời gian biến tính tăng lên thành phần khn có nhiều GC Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống 50-650C 20-40 giây để probe mồi gắn vào sợi DNA khn bắt đầu q trình tổng hợp mạch nhờ vào hoạt động DNA polymerase Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 720C, nhiệt độ tối ưu cho hoạt động tổng hợp mạch DNA polymerase Giai đoạn không bắt buộc số chu trình Real – time PCR, kỹ thuật thường dùng khuếch đại đoạn có trình tự ngắn PCR, vào khoảng