Đang tải... (xem toàn văn)
Hiện nay chưa có loại vaccinenào để ngăn ngừa loại virus này.Theo nghiên cứu, Virus Nipah lây lan qua tiếp xúc với chất dịch cơ thể củadơi, lợn hoặc người bị nhiễm bệnh, khiến tới 75% số
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÁO CÁO MÔN HỌC
SỬ DỤNG THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TRONG PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG VIRUS NIPAH TRÊN VIKHUẨN E COLI
Hướng dẫn khoa họcSinh viên thực hiện
Trang 2TP Thủ Đức, 10/2023
LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc và tình cảm chân thành, cho phép em gửi lời cảm ơn tới Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM nói chung cũng như Khoa Khoa học Sinh học nói riêng đã trang bị, hỗ trợ cơ sở vật chất, tạo cơ hội cho sinh viên chúng em được tiếp cận với môn Thiết bị và Kĩ thuật CNSH.
Đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Huỳnh Văn Biết đã nỗ lực, tận tình giảng dạy, đưa bài seminar này vào chương trình giảng dạy Đối với em và các cá nhân khác thì đây là một cơ hội vô cùng ý nghĩa để làm quen, trau dồi kĩ năng, kiến thức, chuẩn bị nền tảng cho Khóa luận tốt nghiệp sau này
Chân thành cảm ơn anh Trương Quang Toản cũng như các anh chị phòng LAB 207 đã trang bị cơ sở vật chất, tận tình giảng dạy, giúp đỡ chúng em trong quá trình học Thực hành
Mặc dù đã cố gắng rất nhiều, nhưng bài cũng thể không tránh khỏi những thiếu sót Em kính mong Thầy và Anh sẽ có những ý kiến đóng góp, giúp đỡ để bài của em có thể được hoàn thiện hơn
Cuối lời em xin chúc Thầy và Anh thật dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp là ươm mầm, truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau
TP Thủ Đức, ngày 23 tháng 9 năm 2023
Tác giả
Trang 31.3 Nội dung thực hiện 1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1 Ứng dụng sinh học phân tử trong phân lập và tạo dòng vi sinh vật 2
2.2 Virus Nipah (NiV) 2
2.2.1 Cấu trúc của Virus Nipah 3
2.2.2 Cấu trúc bộ gen của Virus Nipah 3
2.2.3 Dịch tể học của Virus Nipah 4
2.2.4 Cơ chế lây truyền của Virus Nipah 4
2.2.5 Sao chép của Virus Nipah 5
2.2.6 Biểu hiện lâm sàng của Virus Nipah 6
2.2.7 Sinh bệnh học của Virus Nipah 7
2.2.8 Chuẩn đoán Virus Nipah 8
2.3 Trình tự gen của Virus Nipah 9
2.4 Vi khuẩn E Coli 11
2.4.1 Đặc điểm hình thái 11
Trang 42.4.2 Cấu trúc bộ gen 11
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
3.1 Vật liệu 12
3.2 Phương pháp nghiên cứu 13
3.2.1 Khuếch đại gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT-PCR 13
3.2.1.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 13
3.2.1.2 Ly trích RNA (tách chiết vật liệu di truyền) 13
3.2.2 Điện di và kiểm tra sản phẩm 14
3.2.3 Tổng hợp plasmid tái tổ hợp 16
3.2.3.1 Trình tự và bản đồ vector pGEM®-T 16
3.2.3.2 Chuyển sản phẩm PCR vào E Coli DH5α 17
3.2.3.2.1 Chuyển sản phẩm PCR vào vector pGEM®-T 17
3.2.3.2.2 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào E Coli DH5α phân lập chọn lọc 17
3.2.4 Sàng lọc tế bào vi khuẩn đã được biến nạp bằng PCR colony 18
3.2.5 Tách chiết DNA plasmid từ E Coli 19
3.2.6 Điện di plasmid trong vi khuẩn E Coli 19
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KHIẾN NGHỊ 22
TÀI LIỆU THAM KHẢO 23
Trang 5DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
CDC Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh CNS Hệ thống thần kinh trung ương
CT Chụp cắt lớp vi tính
CXCL10 CXC motif chemokine ligand 10 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
EIEC Enteroinvasive Escherichia coli-Escherichia coli xâm nhập đường ruột
G-CSF Granulocyte colony-stimulating factors-Yếu tố kích thích bạch cầu hạt HCNC Hội chứng não cấp
IL-1α Interleukin-1 alpha IL-1β Interleukin-1 beta IL-6 Interleukin-6 IL-8 Interleukin-8 LA Long and accurate
LB (Luria Bertani) môi trường nuôi cấy khuẩn E.Coli MRI Cộng hưởng từ
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction Taq Thermus aquaticus
TNF-α Tumor Necrosis Factors alpha
Trang 7DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Virus Nipah (NiV) 3
Hình 2.2 Cấu trúc của Virus Nipah (NiV) 3
Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của Virus Nipah (NiV) 4
Hình 2.4 Con đường lây truyền của Virus Nipah (NiV) | Nguồn hình ảnh: Raj KumarSingh và cộng sự 5
Hình 2.5 Sao chép của Virus Nipah (NiV) 6
Hình 2.6 Sinh bệnh học của Virus Nipah (NiV) 8
Hình 2.7 Trình tự gen Virus Nipah 9
Hình 2.8 Ảnh chụp E Coli sử dụng kính hiển vi điện tử 11
Hình 2.9 Sự hình thành nucleoid Escherichia Coli 11
Hình 3.1 Bảng diện đi sản phẩm PCR có chỉ thị của gen mục tiêu 15
Hình 3.2 Trình tự và bản đồ vector pGEM®-T 16
Hình 3.3 Bảng diện đi sản phẩm PCR 20
Trang 8CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hội chứng não cấp (HCNC) do Virus Nipah gây ra, một paramyxovirus được
phát hiện ở Malaysia lần đầu tiên vào tháng 12 năm 1998 tại một trang trại giết mổ heo ở làng Sungai Nipah, phía nam thủ đô Kuala Lumpur (Malaysia) - virus sau đó
được đặt theo tên của ngôi làng Đầu năm 2004, có thông báo rằng Virus Nipah
được xác định là tác nhân gây bệnh gây bệnh HCNC ở Bangladesh những ngay sau đó thông tin này được xác nhận là do nhầm lẫn Kể từ năm 2018, đây là lần
thứ 4 Virus Nipah bùng phát lây nhiễm tại Ấn Độ Hiện nay chưa có loại vaccine
nào để ngăn ngừa loại virus này.
Theo nghiên cứu, Virus Nipah lây lan qua tiếp xúc với chất dịch cơ thể của
dơi, lợn hoặc người bị nhiễm bệnh, khiến tới 75% số người nhiễm bệnh tử vong.
Mới đây, Ấn Độ đã ghi nhận 2 trường hợp tử vong do nhiễm Virus Nipah tại bang
Kerala, miền nam quốc gia này Ổ chứa virut Nipah trong tự nhiên được xác định là loài dơi ăn quả Pteropus (flying fox), một loại dơi phân bố rộng ở nhiều châu
lục trên thế giới, người bị nhiễm Virus Nipah do hít phải không khí có chứa virut
được đào thải từ động vật bị nhiễm virut qua chất tiết đường hô hấp hoặc nước tiểu
của chúng Theo CDC, người nhiễm Virus Nipah có tỷ lệ tử vong lên tới 40 - 75%.Một số nhà khoa học cho rằng Virus Nipah có độc tính gấp 75 lần Corona virus.
1.2 Mục tiêu đề tài
Sử dụng thiết bị và kỹ thuật CNSH trong phân lập Virus Nipah (NiV) và tạodòng trên vi khuẩn E Coli bằng kỹ thuật RT-PCR và tổng hợp plasmid tái tổ hợp.
1.3 Nội dung thực hiện
Nội dung 1: Khuếch đại đoạn gen mục tiêu của Virus Nipah bằng kỹ thuật
Nội dung 2: Tổng hợp plasmid tái tổ hợp trên vi khuẩn E ColiNội dung 3: Điện di plasmid trong vi khuẩn E Coli
Trang 9CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Ứng dụng sinh học phân tử trong phân lập và tạo dòng vi sinh vật
Trước đây người ta thường dựa vào đặc điểm hình thái bên ngoài để chọn ra những vi sinh vật có những đặc điểm mong muốn để tiên hành phân lập và tạo dòng chúng Phương pháp này tương đối đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém nhưng nó vẫn có nhược điểm về thời gian và độ chính xác
Sinh học phân tử (molecular biology) là một bộ môn khoa học nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các đại phân tử sinh học (acid nucleic, protein, …) cần thiết cho sự sống.
Sinh học phân tử về cơ bản được chia làm 3 giai đoạn phát triển:
- Giai đoạn tiền đề: Xác định, tìm ra nhân tố di truyền Đây là giai đoạn hình thành các học thuyết cơ sở tiền đề cho sự ra đời chính thức của sinh học phân tử và sự phát triển của sinh học phân tử hiện đại
- Giai đoạn Sinh học phân tử ra đời: Đưa ra cấu trúc của sợi DNA, học thuyết trung tâm, phát triển các kỹ thuật di truyền
- Giai đoạn Sinh học hiện đại: Hoàn thiện, ứng dụng Sinh học phân tử trong nhiều mặt đời sống
Các kĩ thuật của sinh học phân tử (Công nghệ gen, PCR, điện di gel, lai Southern/ Northern/ Western blot, kỹ thuật Array, …) dần trở nên phổ biến và là công cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học trong nhiều nghiên cứu đa lĩnh vực.
Sinh học phân tử giờ được đưa vào chương trình đào tạo của nhiều trường đại học và là hướng nghiên cứu sự sống của nhiều Viện, trung tâm Các hướng nghiên cứu có thể kể đến như:
+ Tách triết DNA tổng số + Tạo DNA tái tổ hợp + Đinh danh loài mới, …
2.2 Virus Nipah (NiV)
Virus Nipah (NiV) là một loại virus lây truyền từ động vật sang người, có
nghĩa là nó có thể lây truyền giữa động vật và con người Dơi ăn quả, thường được
Trang 10gọi là cáo bay, đóng vai trò là vật chứa NiV tự nhiên Virus Nipah cũng được biết
là lây nhiễm cho người và lợn Nhiễm NiV có liên quan đến viêm não (sưng não) và có thể dẫn đến bệnh từ nhẹ đến nặng và tử vong Các đợt bùng phát hầu như hàng năm xảy ra ở các khu vực châu Á, đặc biệt là Bangladesh và Ấn Độ.
Hình 2.1 Virus Nipah (NiV)
2.2.1 Cấu trúc của Virus Nipah
Virus Nipah (NiV) là một loại virus RNA thuộc họ Paramyxoviridae (Bộ
Mononegavirales), chi Henipavirus và có liên quan chặt chẽ với virus Hendra lây nhiễm ở ngựa.
Virus Nipah là một loại virus có vỏ bọc, có kích thước từ 40 đến 600 nm vàcó nhiều hình thái Bộ gen của Virus Nipah là một chuỗi đơn, RNA cảm giác âm
tính không phân đoạn.
Hình 2.2 Cấu trúc của Virus Nipah (NiV)
2.2.2 Cấu trúc bộ gen của Virus Nipah
RNA cảm giác âm sợi đơn của cặp bazơ 18246 và 18252 (phân lập Malaysia) (phân lập bngladesh),kích thước bộ gen xấp xỉ 18.2 cặp kilobase.
Có sáu đơn vị phiên mã và sáu protein cấu trúc trong bộ gen Nó bao gồm nucleocapsid (N), phosphoprotein (P), protein nền (M), protein tổng hợp (F), glycoprotein (G) và polymerase (L).
Protein liên quan đến bộ gen: protein lớn (L) và phosphoprotein (P).
Protein dung hợp (F) và protein glycoprotein đính kèm là protein virus (G).
Trang 11Phosphoprotein (P): chức năng của nó như một đồng yếu tố polymerase, thúc đẩy quá trình xử lý polymerase và cho phép đóng gói các bộ gen và bộ gen virus mới được tổng hợp.
Phosphoprotein của virut Nipah đóng một vai trò bổ sung trong ức chế miễn dịch bằng cách ức chế tín hiệu interferon bằng cách liên kết với vật chủ STAT - 1.
Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của Virus Nipah (NiV)
2.2.3 Dịch tể học của Virus Nipah
Sự xuất hiện ban đầu của đợt bùng phát Virus Nipah xảy ra ở
Malaysia-Singapore trong những năm 1998 - 1999, có 246 bệnh nhân được báo cáo mắc bệnh viêm não do sốt , và tỷ lệ tử vong là khoảng 40% Đợt bùng phát virus thứ hai được báo cáo ở khu vực không tiếp giáp của quận Meherpur ở Bangladesh và thành phố Siliguri ở Tây Bengal, Ấn Độ, vào năm 2001 Cho đến năm 2010, ghi nhận đợt bùng phát NiV được báo cáo ở Bangladesh.
Vào năm 2011, một đợt bùng phát khác đã xảy ra ở Bangladesh, dẫn đến cái
chết của 15 người do nhiễm Virus Nipah Các cuộc điều tra dịch tễ học đã xác
nhận rằng NiV đã lan rộng khắp Châu Á, Châu Phi và Nam Thái Bình Dương, gây ra các đợt bùng phát lẻ tẻ thông qua cả lây truyền từ người sang người và từ động vật sang người Nó đã gây ra cái chết cho hàng trăm người trong hai thập kỷ qua, gây ra mối đe dọa đáng kể cho cả con người và vật nuôi.
2.2.4 Cơ chế lây truyền của Virus Nipah
Hiện tại người ta đã xác định rằng dơi ăn quả thuộc loài Pteropus (còn được
gọi là cáo bay) là vật mang Virus Nipah bản địa Những con dơi ăn quả bị nhiễm
bệnh tiết ra một loại virus trong nước bọt, nước tiểu hoặc các chất tiết ra từ cơ thể khác, lây nhiễm cho lợn và các động vật nuôi khác Con người bị nhiễm bệnh khi tiếp xúc gần gũi với những con vật này.
Virus Nipah có thể truyền từ động vật sang người:
Trang 12- Bằng cách tiếp xúc thân mật với dơi, lợn và/hoặc con người bị bệnh (người bị nhiễm NiV).
- Lây nhiễm qua các giọt hô hấp, dịch tiết mũi hoặc họng của động vật bị nhiễm bệnh.
- Tiêu thụ trái cây và nước trái cây bị ô nhiễm có chứa tiết động vật Phân dơi thường làm ô nhiễm nhựa cây chà là thô (toddy), đây là một yếu tố nguy hiểm đáng kể khi tiêu thụ Được biết, những con dơi uống sữa tập trung trong các thùng chứa mở và thỉnh thoảng đi tiểu vào đó, làm lây nhiễm virus.
- Lây truyền từ người sang người do tiếp xúc trực tiếp với những người bị nhiễm bệnh, thường là trong gia đình và người chăm sóc của bệnh nhân.
Hình 2.4 Con đường lây truyền của Virus Nipah (NiV) | Nguồn hình ảnh: Raj Kumar Singhvà cộng sự.
2.2.5 Sao chép của Virus Nipah
Giai đoạn đầu của quá trình lây nhiễm virus là gắn/hấp phụ, trong đó virus tự bám vào vật chủ, thông qua glycoprotein G của virus với B2, sau đó kết hợp màng virus với màng tế bào chủ.
Bộ gen RNA âm tính đóng vai trò là khuôn mẫu để phiên mã mRNA của virus, sau đó được dịch mã thành protein của virus vRNA cũng có chức năng như một khuôn mẫu để tổng hợp cRNA, cRNA này tiếp tục đóng vai trò là khuôn mẫu
Trang 13để tổng hợp vRNA Hơn nữa, các protein của virus thực hiện vai trò truyền tín hiệu interferon Các protein F cũng được nội hóa và trưởng thành trong các tế bào.
Quá trình lắp ráp chủ yếu được thực hiện bởi protein M, với N, P, C, M, F và G được tích hợp trong virion.
Cuối cùng, các chồi virion xuyên qua màng vật chủ có chứa các protein G trên bề mặt của nó và được giải phóng khỏi tế bào.
Hình 2.5 Sao chép của Virus Nipah (NiV)
2.2.6 Biểu hiện lâm sàng của Virus Nipah
Nhiễm Virus Nipah (NiV) có thể dẫn đến bệnh từ nhẹ đến nặng, bao gồm
sưng não (viêm não) và thậm chí tử vong.
Thông thường, các triệu chứng xuất hiện từ 4 - 14 ngày sau khi tiếp xúc với virut Các triệu chứng ban đầu bao gồm sốt và nhức đầu trong ba đến mười bốn ngày, và các triệu chứng về đường hô hấp như ho, đau họng và khó thở thường xuất hiện Một giai đoạn sưng não (viêm não) có thể xảy ra sau đó, với các triệu chứng như mệt mỏi, mất phương hướng và rối loạn tâm thần, có thể nhanh chóng dẫn đến hôn mê trong vòng 24 đến 48 giờ.
Trang 14Các triệu chứng ban đầu có thể bao gồm một hoặc nhiều điều sau đây: Sốt, nhức đầu, ho, cổ họng đau, hô hấp khó khăn, ói mửa, …
Các triệu chứng nghiêm trọng có thể xảy ra sau đó, bao gồm:
Mất phương hướng, mệt mỏi và/hoặc nhầm lẫn, động kinh, hôn mê, sưng não (viêm não), …
Tử vong có thể xảy ra trong 40-75% trường hợp Đã có báo cáo về những
người sống sót sau khi nhiễm Virus Nipah bị co giật tái phát và thay đổi tính cách.
Các bệnh nhiễm trùng gây ra các triệu chứng và đôi khi gây tử vong hàng tháng hoặc thậm chí hàng năm sau khi tiếp xúc (được gọi là bệnh tiềm ẩn hoặc không hoạt động) cũng đã được mô tả.
2.2.7 Sinh bệnh học của Virus Nipah
NiV có thể được phát hiện trong các tế bào biểu mô của tiểu phế quản trong giai đoạn đầu của bệnh ở người.
Kháng nguyên virus hiện diện ở phế quản và phế nang, chủ yếu ở biểu mô phế quản và tế bào phổi týp II trên mô hình động vật thí nghiệm.
Các cytokine gây viêm được tạo ra do nhiễm trùng biểu mô đường hô hấp, nơi tuyển dụng các tế bào miễn dịch và dẫn đến bệnh giống như hội chứng suy hô hấp cấp tính.
Các chất trung gian gây viêm như IL-1α, IL-6, IL-8, G-CSF, CXCL10, v.v được tạo ra khi biểu mô đường thở nhỏ hơn bị nhiễm trùng.
Virus lây lan đến các tế bào nội mô của phổi trong giai đoạn sau của bệnh và có thể xâm nhập vào máu và lây nhiễm các cơ quan khác, bao gồm lá lách, thận và não, dẫn đến suy đa cơ quan.
NiV có thể lây nhiễm bạch cầu và gây nhiễm trùng chết người ở chuột đồng Tế bào đơn nhân, tế bào giết người tự nhiên và tế bào lympho T CD6+ CD8+ bị nhiễm ở lợn.
Virus có thể xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương thông qua đường tạo máu hoặc xâm nhập ngược chiều qua dây thần kinh khứu giác.
Sự lây nhiễm của virus vào hệ thần kinh trung ương sẽ phá vỡ hàng rào máu não, gây ra biểu hiện IL-1β và TNF-α, và dẫn đến sự phát triển của các dấu hiệu thần kinh.
Trang 15Hệ thần kinh trung ương bị nhiễm bệnh ở người có thể biểu hiện các thể vùi và mảng trong cả chất xám và chất trắng, cùng với hoại tử.Trong một số mô hình động vật thí nghiệm, virus có thể xâm nhập trực tiếp vào CNS thông qua dây thần kinh khứu giác.
Hình 2.6 Sinh bệnh học của Virus Nipah (NiV)
2.2.8 Chuẩn đoán Virus Nipah
Xét nghiệm trong phòng thí nghiệm: NiV có thể được phát hiện bằng nhiều xét nghiệm trong phòng thí nghiệm như xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA), phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) và phân lập vi rút.
Nghiên cứu hình ảnh: Các nghiên cứu hình ảnh như chụp cộng hưởng từ (MRI) và chụp cắt lớp vi tính (CT) có thể giúp phát hiện các triệu chứng thần kinh liên quan đến nhiễm NiV.
Xét nghiệm huyết thanh học: Xét nghiệm huyết thanh học có thể được thực hiện để phát hiện kháng thể chống lại NiV trong máu.
Sự trình bày lâm sàng: Biểu hiện lâm sàng của nhiễm NiV bao gồm các triệu chứng như sốt, nhức đầu, đau cơ và suy hô hấp, có thể hỗ trợ chẩn đoán bệnh.