Hiện nay chưa có loại vaccinenào để ngăn ngừa loại virus này.Theo nghiên cứu, Virus Nipah lây lan qua tiếp xúc với chất dịch cơ thể củadơi, lợn hoặc người bị nhiễm bệnh, khiến tới 75% số
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Mẫu bệnh phẩm: mẫu huyết thanh và mẫu nước tiểu dơi ăn quả được thu thập và dịch não tủy bệnh nhân HCNC không rõ căn nguyên nghi ngờ do virus được lấy tại bệnh viện.
Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm:
- Bộ kit ISOLATE II Plasmid Mini Kit.
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
Các hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm:
- Dung dịch đệm RT x RT Ace
- Dung dịch đệm LA x MgCL2
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Khuếch đại gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT-PCR
3.2.1.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Cách lấy và bảo quản mẫu dịch não tủy: dịch nào tủy được lấy vô trùng từ bệnh nhân HCNC không rõ nguyên nhân trong 3 ngày đầu của bệnh, bảo quản ở 4°C trong quá trình chuyển mẫu, lưu giữ mẫu ở -70°C.
Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu nước tiểu từ dơi ăn quả: bắt dơi, kích thích mạnh vào bụng dơi, nước tiểu dơi sẽ được bài tiết ra ngoài, dùng ống nghiệm nhỏ hứng nước tiểu dơi, trộn nước tiểu của 5 con dơi thành một mẫu, bảo quản ở 4°C trong quá trình vận chuyển, lưu giữ mẫu ở -70°C.
Cách lấy mẫu và bảo quản máu dơi ăn quả: lấy máu dơi ăn quả từ động mạch cổ, mỗi con lấy 0,5 – 1 ml máu vào ống nghiệm nhỏ, để nghiêng ống nghiệm ở nhiệt độ phòng từ 30 - 60 phút, để mẫu ở 4°C qua đêm, tách huyết thanh Mẫu được vận chuyển nhanh về phòng xét nghiệm trong điều kiện 4°C, lưu giữ mẫu ở ở -70°C.
3.2.1.2 Ly trích RNA (tách chiết vật liệu di truyền)
Tách chiết vật liệu di truyền theo phương pháp Trizol: Cho vào ống eppendorf lần lượt trizol, chloroform, mẫu bệnh phẩm Lắc mạnh ống trong 15 giây, ly tâm 12.000 vòng/phút ở 4°C trong 10 phút Lấy phần nổi sau ly tâm cho vào ống eppendorf, cho thêm vào cồn isopropyl, lắc nhẹ ống trong 1 giây ly tâm 12.000 vòng/phút ở 4°C trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi, cho cồn ethanol 75%, ly tâm 12.000 vòng/phút ở 4°C trong 5 phút Loại bỏ lịch nổi bằng pipet, cho nước cất 2 lần làm đồng nhất RNA đã lắng sau ly tâm.
- Giai đoạn RT (tổng hợp cDNA)
Công thức cho một phản ứng: mM dNTP, dung dịch đệm RT x RT Ace, nước cất.
Cho RNA đã xử lý bằng nhiệt 65°C trong 5 phút Ủ ở 37°C/1 giờ, sản phẩm cDNA lưu giữ mẫu ở -20°C.
Thành phần hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Dung dịch đệm LA x MgCL2, mM dNTP, mồi xuôi, mồi ngược, LA Taq, nước cất, cDNA.
Thông số Trình tự Chiều dài Tm
Quá trình phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn:
Biến tính: Nhiệt độ tăng lên 94 - 96°C để tách hai sợi DNA ra Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn.
Bắt cặp: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Bước này gọi là gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (50 - 65°C) Nhiệt độ sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện.
Kéo dài: Dưới tác động của enzyme DNA polymerase (72°C) Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Sản phẩm sau khi khuếch đại là 245 bp.
3.2.2 Điện di và kiểm tra sản phẩm Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point) Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di
Pha thạch nồng độ từ 1,5 % đến 2 % agarose bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặcTAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, đợi đến khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40°C đến 50°C, cho vào 5 l etidi bromua/100 ml.Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn Tiến hành đổ vào bản gel (chú ý không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm) Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch đã đun agarose vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel
Sản phẩm PCR sau khi điện di:
Hình 3.1 Bảng diện đi sản phẩm PCR có chỉ thị của gen mục tiêu
3.2.3 Tổng hợp plasmid tái tổ hợp
3.2.3.1 Trình tự và bản đồ vector pGEM®-T
Hệ thống vectơ pGEM®-T là hệ thống thuận tiện để nhân bản các sản phẩm PCR được tạo ra bởi một số polymerase bền nhiệt Các polymerase này thường thêm một deoxyadenosine đơn lẻ, theo kiểu không phụ thuộc vào khuôn mẫu, vào đầu 3´ của các đoạn được khuếch đại
Vector pGEM®-T đã sẵn sàng để sử dụng trong các phản ứng thắt, được chuẩn bị bằng cách cắt Vector pGEM®-5Zf(+) bằng EcoRV và thêm thymidine đầu cuối 3´ vào cả hai đầu Các phần nhô ra 3´-T đơn lẻ này tại vị trí chèn cải thiện đáng kể hiệu quả của việc gắn sản phẩm PCR vào plasmid bằng cách ngăn chặn sự tái tuần hoàn của vectơ và cung cấp phần nhô ra tương thích để gắn các sản phẩm PCR có phần nhô ra A
Hình 3.2 Trình tự và bản đồ vector pGEM®-T
Trong pGEM®-T Vector, các trình tự khởi đầu RNA polymerase của T7 và SP6 tạo thành một vùng nhân bản đa bên trong vùng mã hóa α-peptide cho β-galactosidase. Việc vô hiệu hóa xen kẽ của α-peptide cho phép các dòng vô tính tái tổ hợp được xác định trực tiếp bằng Sàng lọc Xanh lam/Trắng trên các tấm chỉ thị Vectơ cho phép chuẩn bị DNA sợi đơn do Nguồn gốc sao chép f1 của nó.
Nhiều vị trí nhân bản được bao quanh bởi các vị trí nhận biết enzym cắt giới hạn BstZI, EcoRI và NotI cho phép giải phóng phần chèn bằng quá trình tiêu hóa một enzym Ngoài ra, có thể sử dụng phân hủy kép để giải phóng phần chèn khỏi vectơ
3.2.3.2 Chuyển sản phẩm PCR vào E Coli DH5α
3.2.3.2.1 Chuyển sản phẩm PCR vào vector pGEM®-T
Cho dATP, Taq polymerase vào để tổng hợp đầu A ở sản phẩm PCR (theo nguyên tắc A nối với T) Trộn sản phẩm PCR chứa đầu A vào vector pGEM®-T, sau đó cho enzyme nối vào để nối sản phẩm PCR với vector pGEM®-T lại với nhau.
3.2.3.2.2 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào E Coli DH5α phân lập chọn lọc.
Nguyên lý: Vi khuẩn E Coli sau khi xử lý với CaCl2 sẽ làm cho màng tế bào trở nên khả nạp giúp cho DNA xâm nhập tế bào E Coli dễ dàng hơn Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (42°C trong 60 giây) để kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào trong tế bào Môi trường dưỡng chất được thêm vào sau đó cho phép tế bào hồi phục và plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tương ứng.
Biến nạp plasmid vào E Coli DH5α: