Bài báo cáo tiểu luận tbkt cnsh

TỔNG QUAN ĐỀ TÀI• Đặt vấn đề: Hội chứng não cấp HCNC do Virus Nipah gây ra, một paramyxovirus được phát hiện ở Malaysia lần đầu tiên vào tháng 12 năm 1998 tại một trang trại giết mổ heo

SỬ DỤNG THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH

HỌC TRONG PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG VIRUS NIPAH TRÊN VI KHUẨN E COLI

MÔN HỌC: THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CNSHMÃ MÔN HỌC: 211402

GVHD: TS HUỲNH VĂN BIẾT

CHỦ ĐỀ:

TỔNG QUAN ĐỀ TÀI

• Đặt vấn đề:

Hội chứng não cấp (HCNC) do Virus Nipah gây ra, một

paramyxovirus được phát hiện ở Malaysia lần đầu tiên vào tháng 12 năm 1998 tại một trang trại giết mổ heo ở làng Sungai Nipah, phía nam Malaysia, virus sau đó được đặt theo tên của ngôi làng.

Theo nghiên cứu, Virus Nipah lây lan qua tiếp xúc với chất

dịch cơ thể của dơi, lợn hoặc người bị nhiễm bệnh, tới 75% số người nhiễm bệnh tử vong.

4

TỔNG QUAN ĐỀ TÀI

• Mục tiêu đề tài:

Sử dụng thiết bị và kỹ thuật CNSH trong phân lập Virus Nipah (NiV) và tạo dòng trên vi khuẩn E Coli bằng kỹ thuật

RT-PCR và tổng hợp plasmid tái tổ hợp.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Virus Nipah (NiV) là một loại

virus lây truyền từ động vật sang người, có nghĩa là nó có thể lây truyền giữa động vật và con người.

Dơi ăn quả, thường được gọi là cáo bay, đóng vai trò là vật chứa

NiV tự nhiên Virus Nipah cũng

được biết là lây nhiễm cho người và lợn.

Hình 1 Virus Nipah liên kết với các thụ

thể trên tế bào người

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cấu trúc của Virus Nipah

Virus Nipah (NiV) là một loại

virus RNA thuộc họ Paramyxoviridae, chi Henipavirus và có liên quan chặt chẽ với virus Hendra lây nhiễm ở

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Có sáu đơn vị phiên mã và sáu protein cấu trúc trong bộ gen Nó bao gồm nucleocapsid (N), phosphoprotein (P), protein nền (M), protein tổng hợp (F), glycoprotein (G) và polymerase (L).

Cấu trúc bộ gen của Virus Nipah

Hình 3 Cấu trúc bộ gen của Virus Nipah

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Trình tự gen của Virus Nipah

Hình 6 Trình tự gen của Virus Nipah.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Escherichia Coli còn được

gọi là E Coli, là trực khuẩn

Gram (-), kỵ khí tùy nghi,

hình que E Coli có khả

năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi Tất

cả E Coli đều lên men

lactose và sinh hơi trừ

ngoại lệ E Coli loại EIEC

Đặc điểm hình thái của E Coli

Hình 4 E Coli dưới kính hiển vi điện tử

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Trình tự bộ gen của E Coli là phân tử DNA dạng vòng kép dài 4,6 triệu cặp base, chứa 4288 gen mã hóa protein, 7 operon RNA ribosome (rRNA) và 86 gen RNA vận chuyển (tRNA).

Cấu trúc bộ gen của E Coli

Hình 5 Cấu trúc bộ gen của E Coli

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Lấy mẫu và bảo quản mẫu:

Mẫu bệnh phẩm: mẫu huyết thanh và mẫu nước tiểu dơi ăn quả được thu thập và dịch não tủy bệnh nhân HCNC không rõ căn nguyên nghi ngờ do virus được lấy tại bệnh viện.

Bảo quản ở 4°C trong quá trình chuyển mẫu, lưu giữ mẫu ở -70°C.

Khuếch đại gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT-PCR

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Ly trích RNA (tách chiết vật liệu di truyền):- Giai đoạn RT (tổng hợp cDNA)

+ Công thức cho một phản ứng: mM dNTP, dung dịch đệm RT x RT Ace, nước cất.

+ Cho RNA đã xử lý bằng nhiệt 65°C trong 5 phút Ủ ở 37°C/1 giờ, sản phẩm cDNA lưu giữ mẫu ở -20°C.

- Giai đoạn PCR

+ Thành phần hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Dung dịch đệm LA x MgCL2, mM dNTP, mồi xuôi, mồi ngược, LA Taq, nước cất, cDNA.

Khuếch đại gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT-PCR

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Ly trích RNA (tách chiết vật liệu di truyền): - Giai đoạn PCR

Cặp mồi:

Khuếch đại gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT-PCR

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Điện di và kiểm tra sản phẩm:

Khuếch đại gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT-PCR

Hình 7 Kết quả

điện di

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Chuyển sản phẩm PCR vào E Coli DH5α:

Chuyển sản phẩm PCR vào vector pGEM®-T

+ Cho dATP, Taq polymerase vào để tổng hợp đầu A ở sản phẩm PCR (theo nguyên tắc A nối với T) Trộn sản phẩm PCR chứa đầu A vào vector pGEM®-T, sau đó cho enzyme nối vào để nối sản phẩm PCR với vector pGEM®-T lại với nhau.

Tổng hợp plasmid tái tổ hợp

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Chuyển sản phẩm nối vào tế bào E Coli DH5α phân lập chọn lọc:α phân lập chọn lọc:

Nguyên lý: Vi khuẩn E Coli sau khi xử lý với CaCl2 sẽ làm cho màng

tế bào trở nên khả nạp giúp cho DNA xâm nhập tế bào E Coli dễ dàng

hơn Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (42°C trong 60 giây) để kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào trong tế bào

Tổng hợp plasmid tái tổ hợp

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Biến nạp plasmid vào E Coli DH5α phân lập chọn lọc:α:

Tổng hợp plasmid tái tổ hợp

Hình 9 Quy trình

biến nạp

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thành phần của PCR colony

Sàng lọc tế bào vi khuẩn đã được biến nạp bằng PCR colony

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chu trình nhiệt

Sàng lọc tế bào vi khuẩn đã được biến nạp bằng PCR colony

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sử dụng mẫu ở quá trình biến nạp tiến hành tách chiết DNA plasmid Thực hiện ly trích theo hướng dẫn của nhà sản xuất trong bộ kit ISOLATE II Plasmid Mini Kit.

Tách chiết DNA plasmid từ E Coli

Hình 10 ISOLATE II

Plasmid Mini Kit.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CẢM ƠN THẦY,

VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE