Giám định bệnh virus chồi giống tạo cây in vitro sạch virus và khảo sát tính kháng virus của cây dứa cayenne bằng kỹ thuật công nghệ sinh học

BÁO CÁO NGHIỆM THU ðỀ TÀI GIÁM ðỊNH BỆNH VIRUS CHỒI GIỐNG, TẠO CÂY IN VITRO SẠCH VIRUS VÀ KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG VIRUS CỦA CÂY DỨA CAYENNE BẰNG KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ SINH HỌC Cơ quan quản lý đề tài: Sở Khoa học Công Nghệ Tp HCM Cơ quan chủ trì đề tài: Trường ðại học Nơng Lâm Tp HCM Chủ nhiệm ñề tài: TS Trần Thị Dung Tp Hồ Chí Minh / 2007 MỤC LỤC
 Trang Phần một: Mở ñầu 1.1 ðặt vấn ñề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phần hai: Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu nhóm dứa Cayenne 2.2 Bệnh héo virus dứa môi giới truyền bệnh 2.3 Virus PMWaV-2 HSP 70 protein 2.4 Các phương pháp tạo virus 2.5 Các phương pháp giám ñịnh virus thực vật .13 2.5.1 Phương pháp kiểm tra dựa huyết học .13 2.5.2 Phương pháp hiển vi quang học vi ñiện tử .14 2.5.3 Phương pháp sinh học phân tử .14 2.6 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền phát thị phân tử 16 2.6.1 ða dạng di truyền thị phân tử 16 2.6.2 Các phương pháp nghiên cứu tính đa dạng di truyền 18 2.6.3 Bulked segregant analysis .20 2.7 Các chiến lược nghiên cứu tính kháng bệnh thực vật .21 2.7.1 Tính kháng bệnh thực vật .21 2.7.2 Các chiến lược nghiên cứu tính kháng 22 2.8 Một số kết nghiên cứu nước .27 2.8.1 Nghiên cứu nước 27 2.8.2 Nghiên cứu nước 28 Phần ba: Nội dung, vật liệu phương pháp nghiên cứu 30 • Nội dung nghiên cứu .30 • Vật liệu phương pháp nghiên cứu .32 3.1 Nội dung 1: Giám ñịnh bệnh virus chồi giống dứa Cayenne .32 3.1.1 Xây dựng hồn thiện quy trình giám định PMWaV chồi dứa Cayenne 32 3.1.2 Thu thập kiểm tra bệnh virus chồi giống dứa Cayenne 34 3.2 Nội dung 2: Tạo dứa Cayenne virus .35 3.2.1 Tạo dứa Cayenne in vitro virus phương pháp ni cấy đỉnh sinh trưởng xử lý nhiệt .35 3.2.2 Giám ñịnh PMWaV dứa Cayenne in vitro tái sinh từ ñỉnh sinh trưởng 39 3.3 Nội dung 3: ðánh giá tính virus dứa Cayenne in vitro 39 3.3.1 Trồng dứa Cayenne in vitro vườn ươm 39 3.3.2 Kiểm tra tính virus mức độ biến dị dứa Cayenne in vitro 40 3.4 Nội dung 4: Xác ñịnh marker liên kết tính kháng virus 40 3.4.1 ðánh giá tính đa dạng di truyền dứa Cayenne kỹ thuật RAPD 40 3.4.2 Phát marker liên kết tính kháng .42 3.5 Nội dung 5: Xác ñịnh gene liên quan với tính kháng virus 43 Phần bốn: Kết thảo luận 46 4.1 Nội dung 1: Giám ñịnh bệnh virus chồi giống dứa Cayenne 46 4.1.1 Xây dựng hồn thiện quy trình giám ñịnh PMWaV chồi dứa Cayenne 46 4.1.2 Thu thập kiểm tra bệnh virus chồi giống dứa Cayenne 54 4.2 Nội dung 2: Tạo dứa Cayenne in vitro virus phương pháp ni cấy đỉnh sinh trưởng xử lý nhiệt 55 4.2.1 Khảo sát khả tái sinh ðST nuôi cấy môi trường MS 55 4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng giống q trình xử lí nhiệt lên sinh trưởng tái sinh từ ðST .57 4.2.3 Giám ñịnh PMWaV dứa Cayenne in vitro tái sinh từ ðST 59 4.3 Nội dung 3: ðánh giá tính virus dứa Cayenne in vitro 64 4.3.1 Trồng dứa Cayenne in vitro vườn ươm .64 4.3.2 Kiểm tra tính virus chồi dứa in vitro vườn ươm 66 4.3.3 Khảo sát mức ñộ biến dị dứa Cayenne in vitro ngồi đồng ruộng 67 4.4 Nội dung 4: Xác định marker liên kết tính kháng virus 69 4.4.1 ðánh giá tính đa dạng di truyền dứa Cayenne kỹ thuật RAPD 69 4.4.2 Kết chủng bệnh 77 4.4.3 Xác ñịnh thị RAPD liên quan kiểu hình khơng biểu bệnh wilt81 4.5 Nội dung 5: Xác định gene liên quan với tính kháng virus 83 4.5.1 Kết tối ưu PCR thoái hoá 83 4.5.2 Reamplify sản phẩm PCR 89 4.5.3 Kết PCR loại mô khác 90 Phần năm: Kết luận ñề nghị 92 Tài liệu tham khảo .94 Phụ lục PHẦN MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Dứa loại ăn ñược ưa chuộng thị trường giới hương vị ñặc trưng giàu chất dinh dưỡng; enzyme bromelin chiết xuất từ dứa có nhiều ứng dụng cơng nghệ thực phẩm, thuộc da nhiều ngành khác Riêng Việt Nam, dứa có ưu tính chống chịu với ngoại cảnh như: khơng kén đất, trồng vùng đất phèn hay vùng đất khơng thể canh tác rau khác Từ ñiều kiện thuận lợi trên, năm qua dứa Cayenne với ñặc ñiểm ñạt tiêu chuẩn suất, chất lượng yêu cầu cần thiết khác cho chế biến ñồ hộp ñã ñược ưu tiên phát triển Bộ Nông nghiệp xác ñịnh tập trung cho việc phát triển vùng ngun liệu dứa Sở Nơng nghiệp tỉnh thực qui hoạch phát triển dứa rà soát lại vùng nguyên liệu phục vụ nhà máy chế biến Sở Nơng Nghiệp Tp HCM thực chương trình giống trồng chất lượng cao có dứa Cayenne Ngồi ra, tỉnh thuộc vùng ðơng Nam (ðồng Nai, Bình Dương), Tây Nguyên (Gia Lai) miền Trung dự kiến qui hoạch vùng nguyên liệu loại gắn với xây dựng nhà máy chế biến sản phẩm ñạt tiêu chuẩn xuất khẩu, chủ lực dứa Tuy nhiên, theo kết ñiều tra hầu hết ruộng dứa Tp HCM, Long An, Tiền Giang, Lâm ðồng ñều xuất bệnh như: bệnh héo ñỏ ñầu (bệnh wilt), thối trái, thối nõn làm ảnh hưởng nghiêm trọng ñến suất chất lượng dứa, gây thiệt hại mặt kinh tế Một nguyên nhân lây lan bệnh hại nguồn chồi giống ban đầu khơng mầm bệnh, quan trọng virus gây bệnh ñỏ ñầu PMWaV (Pineapple mealybug wilt – associated virus) chiếm tỉ lệ cao gây thiệt hại nặng nề, ñặc biệt thời gian ủ bệnh dài (khoảng tháng) nhiều khơng thể nhận biết giống bị nhiễm bệnh khơng có loại hóa chất diệt trừ virus hiệu Giống dứa Cayenne nhập nội mẫn cảm với bệnh ñỏ ñầu dứa Queen; giống nhập từ Thái Lan, Trung Quốc có mức độ nhiễm cao lây lan nhanh giống Việt Nam (Lâm ðồng) Việc trồng nhầm giống mang PMWaV gây hao tổn thời gian, tiền bạc công sức người nông dân ðể dứa Cayenne ngày mở rộng chuyên canh nhằm ñáp ứng nhu cầu tươi nguyên liệu phục vụ cho việc chế biến ñồ hộp xuất khẩu, việc xác ñịnh giống PMWaV có ý nghĩa lớn mặt kinh tế vấn ñề cấp thiết ðồng thời, cần phải có giống bệnh đảm bảo chất lượng ñể cung cấp cho khu vực trồng dứa Với ñề tài “Giám ñịnh bệnh virus chồi giống, tạo in vitro virus khảo sát tính kháng virus dứa Cayenne kỹ thuật cơng nghệ sinh học” chúng tơi hi vọng góp phần tạo ñược nguồn giống dứa Cayenne bệnh nhằm bảo vệ suất phẩm chất dứa, mang lại hiệu kinh tế cao 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Thiết lập qui trình phát virus gây bệnh héo ñỏ ñầu PMWaV – PMWaV – dứa Cayenne thực giám ñịnh chồi giống cho loại dứa Cayenne Lâm ðồng, Thái Lan, Trung Quốc - Tạo chồi dứa Cayenne virus thơng qua xử lí nhiệt kết hợp ni cấy đỉnh sinh trưởng kiểm tra virus PMWaV – PMWaV – chồi dứa in vitro kỹ thuật RT-PCR - Xây dựng quy trình đánh giá tính ña dạng di truyền dứa Cayenne xác ñịnh marker liên kết tính kháng virus PMWaV – PMWaV – kỹ thuật RAPD ðồng thời xây dựng phương pháp xác ñịnh gene liên quan ñến tính kháng kỹ thuật PCR với primer thối hóa PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu nhóm dứa Cayenne Dứa có tên khoa học Ananas comosus (L.) Merr thuộc: o Phân lớp: Magnoliophyta o Lớp: Liliopsida o Bộ: Poales o Họ: Bromeliaceae o Giống: Ananas o Loài: A comosus Dứa gồm khoảng 50 giống 2000 lồi phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt ñới châu Mỹ Các giống dứa ñang ñược trồng trọt chia thành nhóm: nhóm dứa Cayenne, nhóm dứa Queen (cịn gọi hồng hậu) nhóm Spanish (nhóm Tây Ban Nha) ðặc điểm nhóm dứa Cayenne dài, khơng có gai có đầu chóp lá, dày, lịng máng sâu, có nhiều phấn mặt phía gốc Hoa có màu xanh nhạt, đỏ Quả có dạng hình trụ, mắt nơng, nặng bình quân 1,5 – 2,0 kg phù hợp cho việc chế biến làm đồ hộp Khi chưa chín màu xanh đen, sau chuyển dần đến lúc chín có màu đỏ pha da đồng Cây ñẻ yếu, trung bình cho – chồi gốc năm Trong điều kiện chăm sóc khơng có chồi cuống Quả dứa Cayenne chứa nhiều nước vỏ mỏng nên dễ thối vận chuyển Vì việc chọn vùng, địa điểm trồng qui hoạch ñồng ruộng phải quan tâm ñến ñặc ñiểm Giống Cayenne du nhập vào nước ta cuối năm ba mươi, ñầu năm bốn mươi số ñịa phương miền Bắc chủ yếu đồn điền người Pháp quản lí Chân Mộng (thuộc Vĩnh Phú) nơi tiếp nhận giống ñầu tiên, sau người ta quen gọi Cayenne Chân Mộng Các giống Cayenne ñược trồng phổ biến giống Cayenne Thái Lan, Cayenne Trung Quốc Cayenne Lâm ðồng Theo tài liệu Viện ăn miền Nam, giống Cayenne Thái Lan Trung Quốc ñều cho trái to phát triển tốt; nhiên giống nhập nội nên cần có thời gian ñể kết luận Giống Cayenne Lâm ðồng ñã phát triển lâu ñời Việt Nam, chống chịu bệnh wilt phẩm chất tốt nên phát triển giai ñoạn Với ưu ñiểm suất cao, to mang nhiều đặc điểm phù hợp với cơng nghệ chế biến ñồ hộp, giống Cayenne ñược ý phổ biến diện rộng Các vùng trồng dứa nguyên liệu hình thành nhằm cung cấp ngun liệu cho nhà máy chế biến dứa 2.2 Bệnh héo virus dứa môi giới truyền bệnh Theo Sether et al (1998), bệnh héo virus (Mealybug wilt of pineappleMWP) gây thiệt hại nhiều khu vực trồng dứa giới Bệnh biểu ñầu tiên già nhất, sau đến già bên trên; ñỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, trương nước, mép ñầu bị héo, hóa nâu khơ dần Tùy theo giống từ bị nhiễm bệnh tới biểu triệu chứng từ tuần ñến tháng Nhiều bị nhiễm vườn ươm khơng có dấu hiệu bệnh, sau thời gian trồng biểu Bệnh trở nên nặng hoa, nuôi mùa gốc Hình 2.1: Cây dứa dứa Cayenne bị nhiễm bệnh ñỏ ñầu virus PMWaV Bệnh héo thường trải qua giai ñoạn phát triển: • Xâm nhiễm (biểu bệnh chót có màu đỏ) • Lây lan (gây biến màu lá, chuyển từ ñỏ sang hồng, mép phiến uốn cong phía mặt dưới) • Héo (các bị bệnh héo khô dần, nõn mọc bình thường ) • Gây chết Hậu bệnh wilt bị nhỏ, chua, khơ, mắt lộ rõ, khơng có giá trị thương phẩm Nguyên nhân gây bệnh Các nghiên cứu ñã chứng minh yếu tố tiềm tàng liên quan đến bệnh virus Một dạng closterovirus hình que gấp khúc phân lập từ có triệu chứng MWP Hawaii Tuy nhiên sau tiểu phần closterovirus tìm thấy dứa có khơng triệu chứng phạm vi giới Virus liên quan ñến bệnh héo dứa (PMWaV) thực chất phức hợp loại virus PMWaV-1 PMWaV-2 Dựa vào ñặc ñiểm di truyền, hai loại virus ñược xếp vào họ Closterovirus, lồi Ampelovirus, giống Vinivirus Các phân tích phát sinh lồi trình tự gene cho thấy PMWaV-1 PMWaV-2 có độ tương đồng trung bình 50% PMWaV-2 liên quan mật thiết với virus gây bệnh nho (GLRaV-3) có độ tương đồng từ 64% - 72% thơng qua khung đọc (open reading frame-ORF) Tác nhân lây truyền bệnh PMWaV-1 PMWaV-2 ñược truyền loài rệp sáp: Dysmicoccus brevipes (rệp màu hồng) D neobrevipes (rệp màu xám) Rệp sáp có kích thước khoảng – mm, phủ lớp sáp ñể tự vệ Rệp sáp bám vào non, vào gốc già, vào mắt quả, vào rễ để hút dịch Rệp thực chất khơng chứa virus; chúng sống dứa nhiễm PMWaV thu ñược virus Rệp tiếp thu truyền virus suốt q trình dinh dưỡng Khơng có kí chủ khác virus tìm thấy ngồi dứa nhiều lồi cỏ kí chủ hai lồi rệp ðiều cho thấy dứa nhiễm PMWaV nguồn chứa virus cho rệp truyền sang khác Kiến thường xuất ñồng thời với rệp tạo ñiều kiện thuận lợi cho rệp phát triển Với che chở kiến chu kì sinh sản ngắn từ 35 – 45 ngày, rệp mắn ñẻ phát triển nhanh Hiện tượng cộng sinh rệp kiến làm phát triển lây lan bệnh Kiến sử dụng mật rệp tiết ra, dùng ñất rác hữu xây dựng thành nơi ẩn náu xung quanh ñàn rệp ñể che chở cho chúng khỏi mưa nắng tạo nên tiểu khí hậu thích hợp cho rệp sinh sản Người ta phát ba loại kiến vùng trồng dứa Hawaii gồm: kiến ñầu to Pheidole megacephala Fabricius, kiến Argenetina Iridomyrmex humilis Mayr (Fluker and Beardsley) kiến lửa Solenopsis geminata Fabricius (Rohrbach, K.G et al., 1998) Hình 2.2: Rệp sáp màu xám Dysmicoccus neobrevipes Beards Hình 2.3: Rệp sáp màu hồng Dysmicoccus brevipes Cockerell Hình 2.4: Vị trí rệp sáp dứa Hình 2.5: Sự cộng sinh kiến đầu to rệp sáp Hình 2.6: Kiến Argenetina Iridomyrmex humilis Mayr, Kiến lửa Solenopsis geminata Fabricius Kiến ñầu to Pheidole megacephala Fabricius 2.3 PMWaV gene HSP 70 2.3.1 PMWaV PMWaV thuộc họ Closterovirus, loài Ampelovirus, giống Vinivirus Closterovirus có mã di truyền sợi RNA ñơn (Bar-Joseph and Hull, 1974) Chúng có khoảng 30 lồi kí sinh thực vật với gene đơn bội lưỡng bội (Karasev, 2000) Những nghiên cứu phát sinh lồi dựa phân tích mã, dịch mã biểu protein cho thấy tính chuyên biệt RNA phụ thuộc vào RNA polymerase heat shock protein HSP 70 (Koonin, 1991; Koonin and Dolja, 1993) Môi giới truyền bệnh Closterovirus rệp vừng (aphids), rệp sáp 95 TIẾNG NƯỚC NGOÀI 11 Nair A R and Thomas G.,2007 Evaluation of resistance gene (R-gene) specific primer sets and characterization of resistance gene candidates in ginger (Zingiber officinale Rosc.) Plant Molecular Biology, Rajiv Gandhi Centre for Biotechnology, Thiruvananthapuram 695 014, India 12 Deng Z., S Huang, P Ling, 2000 Cloning and characterization of NBS-LRR class resistance-gene candidate sequences in citrus University of Florida 13 Edwin A G van der Vossen, Jeroen N A M Rouppe van der Voort, Konstantin Kayuka, Abdel Bendahmane, Hans Sandbrink, David C Baulcombe, Jaap Bakker, Willem J Stiekema and Rene M Klein-Lankhorst, 2000 Homologues of a single resistance-gene cluster in potato confer resistance to distinct pathogens: a virus and a nematode The Plant Journal, 567-576 14 Hughes, G., and Samita, S., 1998 Analysis of patterns of pineapple mealybug wilt disease in Srilanka Plant Disease, 82: 885 – 890 15 Hu, J S., Sether, D M., Liu, X P., Wang, M., Zee, F., and Ulman, D E., 1997 Use of a tissue blotting immunoassay to examine the distribution of pineapple closterovirus in Hawaii Plant Disease, 81: 1150-1154 16 Jahn C G., Beardsley W J., and Hector Gozález-Hernándes, 2001 A review of the Association of Ants with Mealybug Wilt Disease of pineapple 17 Gygax M., Gianfranceschi L., Liebhard R., Kellerhals M., Gessler C., Patocchi A., 2004 Molecular markers linked to the apple scab resistance gene Vbj derived from Malus baccata jackii Theor Appl Genet 109: 1702-1709 18 Guihong YU, Hongxiang MA, Zhang XU, Lijian REN, Maoping ZHOU, Weizhong LU., 2004 Cloning a DNA marker associated to wheat scab resistance J Appl Genet 45(1), pp 17-25 19 Lawrence J G., Finnegan J E., Ayliffe A M., and Ellis G J., 1995 The L6 gene for flax rust resistance is related to the Arabidopsis Bacterial resistance gene RPS2 and the tobacco viral resistance gene N The plant cell, vol 7, 1195-1206 20 Melzer, M J., Karasev, A V., Sether, D M., and Hu, J S., 2001 Nucleotide sequence, genome organization and phylogenetic analysis of pineapple mealybug wilt-associated virus-2 Journal of General Virology, 82: 1-7 21 Molnar S J., James L E., and Kasha K J., 2000 Inheritance and RAPD tagging of multiple genes for resistance to net blotch in barley Genome 43: 224–231 96 22 Moury B., Pflieger S., Blattes A., Lefebvre V., and Palloix A., 2000 A CAPS marker to assist selection of tomato spotted wilt virus (TSWV) resistance in pepper Genome 43: 137–142 23 Okubara P.A et al., 2002 A novel RAPD marker linked to the Fusarium wilt race resistance gene (Fwf) in Pisum sativum Pisum Genetics 24 Pamela C Ronald, 1997 The molecular basis of disease resistance in rice Plant Molecular Biology 35: 179-186 25 Pierik, R.L.M., 1987 In Vitro Culture of Higher Plants Martinus Nijhoff Publishers 26 Rohrbach K G., Beardsley J W., German T L., Reimer N J., and Sanford W G., 1988 Mealybug wilt, Mealybugs and Ants on Pineapple Plant Disease 72 (7) 27 Roltsch W Rearing of the Pink Hibiscus Mealy Bug and Its Parasitoids in a Desert Environment, 1989 28 Sambrook J., and Russell D W., 2001 Molecular cloning, vol 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA 29 Saxena M S K and Hooker L A., 1968 On the structure of a gene for disease resistance in maize Department of Plant Pathology, University of Illinois, Urbana 30 Sether, D M., Ulman, D E., and Hu, J S., 1998 Transmission of pineapple mealybug wilt-associated virus by two species of mealbug (Dysmicoccus spp.) Phytopathology, 88: 1224-1230 31 Sether, D M., Karasev A V., Okumura C., Arakawa C., Zee F., Kislan M M., Busto J L., and Hu J S., 2001 Differentiation, distribution, and elimination of two different pineappple mealybug wilt-associated viruses found in pineapple Plant Disease 85 (8): 856-864 32 Sether, D M., and Hu, J S., 2002 Closterovirus infection and mealybug exposure are necessary for the development of mealybug wilt of pineapple disease Phytopathology, 92: 928-935 33 Sether, D M., and Hu, J S., 2002 Yield impact and spread of Pineapple mealybug wilt associated virus-2 and mealybug wilt of pineapple in Hawaii Plant Disease 86: 867-874 34 Sether D M., Melzer M J., Busto J., 2005 Diversity and Mealybug Transmissibility of Ampeloviruses in pineapple Plant Dis 89: 450-456 97 35 Sipes, B S., Sether D M., and Hu J S., 2002 Interactions between Rotylenchus reniformis and Pineapple mealybug wilt associated virus-1 in pineapple Plant Disease 86: 933-938 36 Vladimir Kanazin, 1996 Resistance gene analogs are conserved and clustered in soybean Genetics 37 Webster Craig G., Wylie Stephen J., and Jones Michael G K., 2004 Diagnosis of plant viral pathogens Current Science, vol 86, No.12: 1604-1607 98 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 38 http: //www.apsnet.org/online/feature/pineapple/ 39 Hu J S., Sether D M., Ullman D E and Lockhart B.E Mealybug wilt of pineapple: pineapple viruses & two step heat treatment of pineapple crowns ISHS Acta Horticulturae 425: Second International Pineapple Symposium www.actahort.org/books/425/425_52.htm 16/06/2005 40 Ullman D.E., Williams D.F., Fleisch H., Hu J.S., Sether D.M and Gonsalves A Heat treatment of pineapple: subsequent growth and occurrence of mealybug wilt of pineapple ISHS Acta Horticulturae 334: First International pineapple symposium www.actahort.org/books/334/334_43.htm 16/06/2005 41 http: //www.agroviet.gov.vn/loadasp/tn/tn-spec-nodatedetail.asp?tn=tn&id=998127 12/03/2005 42 Hort 30 Pineapple http: //www.hort.purdue.edu/newcrop/tropical/lecture_30/lec_30.html 05/05/05 43 http: //www.mard.gov.vn/fsiu/data/trongtrot1.htm 44 http: //www.apsnet.org/online/common/names/pineappl.asp 45 http: //vnexpress.net/Vietnam/Khoa-hoc/2005/04/3B9DD14D/ 15/06/2005 46 http: //www.vnn.vn/service/printversion?article_id=603246 15/06/2005 47 http: //www.agroviet.gov.vn/loadasp/tn/tn-spec-nodatedetail.asp?tn=tn&id=998128 17/06/2005 48 http: //www.gialai.gov.vn/default.asp?t=gt_dinhhuong.htm 17/06/2005 99 49 http: //www.hort.purdue.edu/newcrop/tropical/lecture_32/lec_32.html 50 www.bayceer.uni-bayreuth.de/bayceer/de/pub/pub/pub_detail.php?id_obj=22424 15/6/2005 51 http: //en.wikipedia.org/wiki/Pineapple 52 http: //trc.ucdavis.edu/egsutter/plb171/lecturespdf4/14-Virus%20elimination.pdf 53 http: //www.ansinet.org/fulltext/jbs/jbs110898-899.pdf.10 23/2/05) 54 http: //www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/phanloaitv/ch5(4).htm 09/08/2005 55 Applications of Tissue culture to Plant Improvement TissueCultureLecture[1] (tl dạng Powerpoint) PHỤ LỤC NỘI DUNG ðỀ TÀI Giám ñịnh bệnh vrus chồi giống, tạo in vitro virus khảo sát tính kháng virus dứa Cayenne kỹ thuật công nghệ sinh học TT Các nội dung thực chủ yếu Xây dựng hồn thiện qui trình giám định bệnh virus chồi giống dứa Cayenne Quy trình giám định bệnh 12/04 12/05 chồi giống dứa Cayenne nhập nội virus chồi giống dứa Cayenne Kết giám ñịnh chồi Thu thập kiểm tra bệnh virus Sản phẩm cần ñạt Thời gian giống Cayenne nhập nội 1/05 – 9/05 nội ñịa kỹ thuật PCR (Thái Lan, Trung Quốc) nội ñịa (Lâm ðồng) Tạo dứa Cayenne in vitro virus phương pháp ni cấy đỉnh sinh trưởng xử lý nhiệt 1/05 – 9/05 Giám ñịnh bệnh virus dứa in vitro 10/05 – 11/05 Trồng dứa Cayenne in vitro vườn ươm 12/05 – 4/06 Cây dứa Cayenne virus Trồng dứa Cayenne in vitro ngồi đồng ruộng 4/06 – 4/07 Theo dõi tình hình bệnh virus mức ñộ biến dị dứa Cayenne in vitro Xác định tính kháng virus dứa Cayenne markers phân tử 1/07 – 4/07 Báo cáo tổng kết 5/07 – 6/07 Cây dứa Cayenne in vitro 4/06– 4/07 virus Kết kiểm tra chồi giống dứa Cayenne in vitro Cây dứa Cayenne virus Kết khảo sát dạng biến dị tỷ lệ biến dị Xác định marker liên kết với tính kháng virus gene kháng virus PHỤ LỤC MỘT SỐ LUẬN VĂN THỰC HIỆN LIÊN QUAN ðẾN ðỀ TÀI “Giám ñịnh bệnh vrus chồi giống, tạo in vitro virus khảo sát tính kháng virus dứa Cayenne kỹ thuật công nghệ sinh học” Luận văn ðại học 1-Nghiên cứu tạo dứa Cayenne in vitro virus gây bệnh héo ñỏ ñầu 3-Xác ñịnh gene kháng virus PMWaV (Pineapple mealybug wilt associated virus) gây bệnh héo ñỏ ñầu dứa Cayenne phương pháp PCR thoái hoá (degenerated PCR) 4-Xây dựng qui trình giám định virus PMWaV (pineapple mealybug wiltassociated virus ) dứa Cayenne 5-Xây dựng qui trình giám ñịnh virus PMWaV (pineapple mealybug wiltassociated virus ) dứa Cayenne 6-Ứng dung kỹ thuật RT-PCR phát hịên virus PMWaV-1(Pineapple mealybug wilt associated virus-1) gây bệnh héo ñỏ ñầu dứa Cayenne) Luận văn Cao học (Thạc sĩ) 1-Nghiên cứu tạo dứa Cayenne (Ananas comosus (L.) Merr) virus PMWaV (Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus) phương pháp xử lý nhiệt kết hợp nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng 2-Nghiên cứu tính ña dạng di truyền phát marker liên kết tính kháng virus PMWaV dứa Cayenne PHỤ LỤC CÁC BƯỚC TẠO CHỒI DỨA SẠCH VIRUS Tạo chồi in vitro từ chồi nhiễm virus Vô mẫu chồi dứa nhiễm virus Tạo chồi môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung BA 2mg/l NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O KH2PO4 FeSO4.7H2O Na2 – EDTA MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O KI Na2MoO4.2H2O Nồng ñộ (mg/l) 1650 1900 440 170 27.85 37.25 370 22.3 8.6 6.2 0.025 0.025 0.83 0.25 Dung dịch mẹ 100X (mg/l) 16500 19000 44000 17000 2785 3725 37000 2230 860 620 25 25 830 250 Dung dịch mẹ 1000X (mg/l) Glycine 2,0 2000 Thành phần Khống đa lượng (*) (*) Sắt EDTA Khoáng vi lượng Vitamine Morel Myo - inositol 100,0 1000 Nicotinic acid 0,5 500 Pyridoxine - HCl 0,5 500 Thiamine - HCl 0,1 100 Các thành phần khác ðường 30g/l Agar 7,5g/l pH 5,8 (*) ðối với CaCl2 KH2PO4 nên pha riêng dung dịch ñể tránh kết tủa Xử lí nhiệt Thiết bị: tủ xử lí nhiệt Environmental Test Chamber MRL – 350 (ETC) Khi chồi tái sinh cao khoảng 5cm, cấy chuyền sang môi trường MS tuần trước đặt bình ni cấy vào tủ xử lí nhiệt ETC Các thơng số cuả tủ xử lí điều chỉnh sau: • Nhiệt ñộ: 37oC • Chế ñộ chiếu sáng: 16 giờ/ngày • Cường độ sáng: 2000 lux • Thời gian xử lí: 30 ngày Ni cấy đỉnh sinh trưởng 3.1 Dụng cụ • Kính hiển vi soi Olympus SZ40, • Thớt cao su (dùng làm điểm tựa để cắt đỉnh sinh trưởng), • Nhíp dài 15cm • Cán dao trịn gắn lưỡi lam 3.2 Phương pháp Dùng nhíp tách hết chồi Quan sát qua kính hiển vi, xác ñịnh vùng sinh trưởng tách ñỉnh sinh trưởng (kích thước từ 0,5 mm – 1mm) lưỡi lam ðặt nhẹ mẫu nuôi cấy lên môi trường Sử dụng ống nghiệm đường kính 2,5 cm, chiều cao 10 cm ñể thuận tiện thao tác tiết kiệm mơi tr ường Kiểm tra virus chồi hình thành 4.1 Ly trích RNA 4.1.2 Hóa chất • Kit ly trích RNA - Arum Total RNA Mini Kit (Biorad) • Nitơ lỏng • Ethanol 70% 4.1.3 Thiết bị, dụng cụ • Cân ñiện tử (Ohaus - Mỹ) • Máy ly tâm • Autoclave (Tomy - Nhật) • Các loại pipette 0,5àl - 10àl v 10àl - 100àl ã Cỏc loi ủu tip 0,5àl - 10àl v 10àl - 100àl ã Cối chày giã (ðức) • ðá gel, bao tay, trang • Bồn ủ nhiệt (Memmert – Anh) Cân 60 mg mẫu tiến hành ly trích RNA theo qui trình sau: 60mg mẫu (đã nghiền Nitơ lỏng) Tube 2ml 700µl dung dịch lysis solution Ly tâm 14.000 vịng – 3’ 700 µl ethanol 70% Hịa tan pipet Dịch RNA binding column Ly tâm 30 giây Bỏ dịch lọc Ly tâm 30 giây Bỏ dịch lọc Ủ 25oC – 15’ Ly tâm 30 giây Bỏ dịch lọc Ly tâm 30 giây Bỏ dịch lọc Ly tâm 90 giây Bỏ dịch lọc 700 µl dịch rửa low stringenecy Hỗn hợp µl DNase 75 µl DNase delution 700 µl dung dịch high stringenecy 700 µl dịch rửa low stringenecy 80 µl dung dịch elution solution ñã ủ 70oC – 15’ Ủ 1’ – ly tâm 2’ RNA tổng số 4.2 Kiểm tra virus 4.2.1 Hóa chất • Access RT-PCR kit (Promega) • Agarose (Biorad) • EDTA (Erhylenediamine-tetra acetate) (Merk, ðức) • TE 1X (Tris – EDTA) • TAE 0,5X (Tris – Acetat - EDTA) • Primer 225, 226 • Loading dye 6X (Promega) • Ladder 100 (Promega) • Ethidiumbromide (ðức) • Nước cất siêu khử ion, chiếu tia UV Bảng 4.1 Trình tự Primer 225, 226 Primer 225 Trình tự 5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3' Primer 226 5'-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3' Số Nu 20 20 % GC 50 % 45 % o Tm 55,7oC 57,3 C Bảng 4.2 Thành phần cách pha TE 1X Thành phần Thể tích Tris (pH 8.0) 1M 0,5ml EDTA 0,5 M 0,1ml Nước cất 49,4ml Tổng cộng 50,0ml Bảng 4.3 Cách pha loãng primer Nồng ñộ ñầu Thành phần Primer Nồng ñộ cuối Thể tích 25mM 0,5mM 2µl TE 98µl Tổng cộng 100µl Bảng 4.4 Thành phần cách pha TAE 50X Thành phần Tris base 2M Thể tích lít 242 g Glacial acetic acid 57,1 ml EDTA 0,5 M, pH 8.0 100 ml Pha loãng TAE 50X thành TAE 0,5X nước cất khử ion 4.2.2 Thiết bị, dụng cụ o o o o o o o o Máy PCR (Biorad, Thụy ðiển) M áy ñiện di (Biorad, Thụy ðiển) Máy votex (IKA - ðức) Cân ñiện tử (Ohaus - Mỹ) Lị vi sóng (Electrolux) Tủ lạnh -20oC, oC (Sanyo - Nhật) Giếng ñổ gel Máy chụp DNA Geldoc (Biorad, Thụy ðiển) 4.2.3 Cách tiến hành 4.2.3.1 Chuẩn bị hỗn hợp PCR • Pha hỗn hợp hóa chất cần thiết cho phản ứng RT – PCR Hỗn hợp cho phản ứng (50µl) pha sau: Thể tích Nồng ñộ cuối 10 µl 1X dNTP (10mM) µl 0.2 mM MgSO4 (25 mM) µl mM Enzyme reverse AMV (5 Unit/µl) µl 0.1 Unit/µl Enzyme Taq polymerase Tfl (5 Unit/µl) µl 0.1 Unit/µl Primer 225 (25 mM) 1µl 0,5mM Primer 226 (25 mM) 1µl 0,5mM RNA khn mẫu µl Hóa chất AMV / Tfl Buffer (5X) Nc ct ln 30 àl ã Pha hn hợp tube 0,5 ml trộn ñều pipet Sau thêm AMV RT Tfl DNA polymerase vào, vortex hỗn hợp 10 giây • Phủ lên tube 1- giọt Nuclease – free mineral oil • ðặt tube vào bồn giữ nhiệt ủ 450C 45 phút • Cài đặt chương trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR bước gồm trình tổng hợp cDNA khuếch đại RNA • Cài đặt chu kì nhiệt cho phản ứng, gồm giai ñoạn Giai ñoạn 1, tổng hợp sợi cDNA: 450C/45 phút (1 chu kì), 940C/2 phút (1 chu kì); giai đoạn 2, cDNA khuếch ñại theo chương trình nhiệt sau: 920C/30 giây, 580C/1 phút, 680C/90 giây (10 chu kì); 920C/30 giây, 540C/1 phút, 680C/90 giây (35chu kì) 680C/8 phút (1 chu kì) Sơ ñồ phản ứng RT-PCR phát PMWaV 4.2.3.2 Chuẩn bị gel điện di • Pha gel agarose với nồng độ 1,5%: Cân 0,195g agarose cho vào 13ml dung dịch TAE 0,5X ðun lị vi sóng cho agarose tan thật • Chờ nhiệt độ dung dịch agarose giảm cịn khoảng 55oC đổ vào khay điện di có cài sẵn lược • Khi gel đơng lại nhẹ nhàng tháo lược ñặt khay vào bồn ñiện di chứa sẵn ñệm TAE (0,5X) Chú ý gel phải ngập dung dịch ñệm 4.2.3.3 ðiện di sản phẩm • Chuẩn bị hỗn hợp điện di 5µl/ giếng (3,5µl mẫµ + 1,5µl loading dye) mảnh giấy parafilm Dùng pipette trộn ñều hỗn hợp tránh tạo bọt khí • Load hỗn hợp lên gel agarose 1,5% chạy ñiện di 90 phút 50V cho ñến vạch màu loading dye chạy ñến 2/3 chiều dài gel • Nhuộm Ethidium bromide 15 phút chụp hình gel tia UV ñọc kết 4.2.3.3 ðọc kết điện di Kích thước sản phẩm PCR ñược ghi nhận thông qua so sánh với thang chuẩn 100bp DNA ladder Những mẫu khuếch đại có chứa band với kích thước 589 bp hay 609 bp (tương ñương 600 bp) mẫu dương tính (bị nhiễm PMWaV) Tăng sinh chồi cho kết âm tính Tiếp tục nhân chồi cho kết âm tính với PMWaV mơi trường MS bổ sung BA 2mg/lit tái sinh chồi hồn chỉnh sử dụng mơi trường MS Chuyển ñất trồng Khoảng tháng sau nhân chồi, hình thành đầy ñủ rễ lá, chuyển trồng nhà lưới Sau tháng, chuyển trồng ngồi đất Kiểm tra virus lần Sau tháng, trồng ñược kiểm tra virus lần hai ñể khẳng ñịnh PMWaV PHỤ LỤC KINH PHÍ TẠO CHỒI DỨA SẠCH VIRUS STT NỘI DUNG DỤNG CỤ - THIẾT BỊ HỐ CHẤT Vơ mẫu Dụng cụ ni cấy mơ Mơi trường MS CHI PHÍ THỰC HIỆN (VNð) 50000 Nhân chồi Dụng cụ nuôi cấy mô Môi trường MS, BA 2mg/l 35000 60 Tái sinh hồn chỉnh Dụng cụ ni cấy mơ Mơi trường MS 70000 90 Xử lí nhiệt Dụng cụ ni cấy mơ Tủ xử lí nhiệt Environmental Test Chamber MRL – 350 (ETC) Mơi trường MS 540000 30 chi phí cho lần xử lí (tối đa 300 cây) Trồng mô nhà lưới Vỉ xốp, ly nhựa, bình tưới Phân NPK, thuốc diệt nấm, đất 1200000 60 bao gồm chi phí th nhân cơng, số lượng cây: 300 Chuyển đất phủ nơng nghiệp Phân NPK, thuốc diệt nấm, thuốc diệt kiến 2000000 180 bao gồm chi phí th nhân cơng, số lượng cây: 300 Ly trích RNA Máy ly tâm, cân ñiện tử, pipet, tip, eppendorf, cối chày sứ, găng tay Kit ly trích RNA - Arum Total RNA Mini Kit (Bio- rad), nitơ lỏng, cồn tuyệt ñối, găng tay 19100000 20 chi phí thời gian thực cho 100 mẫu Kiểm tra virus (RT - PCR) Máy PCR, máy ñiện di, tủ lạnh -20oC & oC, máy ñọc gel, máy votex, tip load mẫu, găng tay Access RT-PCR kit (Promega), Primer 225 & 226, loading dye, 100 bp ladder (Promega) 22995000 441 Các mục >4, & chưa tính tiền cơng thực TỔNG CỘNG Hai mươi hai triệu chín trăm chín mươi lăm ngàn THỜI GIAN (ngày) GHI CHÚ chi phí cho mẫu chi phí chuẩn bị lit mơi trường ni cấy chi phí chuẩn bị lit mơi trường nuôi cấy