Ứng dụng một số giải pháp công nghệ sinh học trong chọn tạo và nhân các dòng ớt cay ưu tú nhằm phát triển các giống ớt cay lai f1 có yếu tố bất dục đực bào chất cms

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CỔ PHẦN GIỐNG CÂY TRỒNG MIỀN NAM BÁO CÁO NGHIỆM THU ỨNG DỤNG MỘT SỐ GIẢI PHÁP CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO VÀ NHÂN CÁC DÒNG ỚT CAY ƯU TÚ NHẰM PHÁT TRIỂN CÁC GIỐNG ỚT CAY LAI F1 CÓ YẾU TỐ BẤT DỤC ĐỰC BÀO CHẤT (CMS) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS Lê Thị Kính CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 02/ 2017 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đề tài “Ứng dụng số giải pháp công nghệ sinh học chọn tạo nhân dòng ớt cay ưu tú nhằm phát triển giống ớt cay lai F1 có yếu tố bất dục đực bào chất (CMS)” triển khai với mục đích kết hợp phương pháp chọn giống truyền thống với ứng dụng marker phân tử để phân loại, định danh chọn tạo dòng A/B R ưu tú nhằm phát triển giống ớt cay lai F1 có yếu tố bất dục đực bào chất CMS có giá trị thương phẩm cao Ngoài ra, phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng thực nhằm nhân nhanh với chất lượng tốt dòng A (dòng bất dục đực bào chất CMS) khỏe mạnh, hỗ trợ hiệu cho công tác sản xuất hạt giống lai F1 qui mô lớn Đề tài thực năm (2013 – 2016) Trung Tâm Nghiên cứu Giống trồng thuộc Công ty Cổ Phần Giống Cây Trồng Miền Nam SSC (cơ sở Phú Giáo- Bình Dương Củ Chi – TP Hồ Chí Minh) Viện Sinh Học Nhiệt Đới (TP Hồ Chí Minh) Bộ vật liệu chọn giống sử dụng nghiên cứu gồm 50 giống/dịng ớt cay, thuộc nhóm ớt địa (ớt sừng) Các phương pháp nghiên cứu áp dụng bao gồm: (1) Phương pháp ứng dụng marker phân tử DNA: 41 cặp mồi SSR để đánh giá phân nhóm khoảng cách di truyền nguồn vật liệu chọn giống, cặp mồi SCAR xác định yếu tố bất dục đực bào chất CMS tế bào chất gene phục hồi hữu dục đực Rf nhân nhằm định danh dòng A (CMS) B R Các marker SSR SCAR ứng dụng để xác định nhanh cặp dòng A/B tương đồng đồng hợp tử dòng R đồng hợp; (2) Phương pháp chọn giống truyền thống: đánh giá đặc tính hình thái, nơng học phân nhóm vật liệu chọn giống, lọc dòng (tự thụ) tạo dòng thuần, hồi giao để tạo cặp A/B tương đồng di truyền cải thiện vài tính trạng dòng làm cha (dòng R), lai test để đánh giá xác định tổ hợp lai triển vọng; (3) Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng: áp dụng phương pháp nuôi cấy mô vi nhân giống hạn chế hay không sử dụng đường chất hữu mơi trường ni cấy Từ khóa: Ớt cay (Capsicum annuum), marker DNA, lọc dòng, hồi giao, dòng A (CMS) B R, vi nhân giống quang tự dưỡng I ABSTRACT Study “ Application of some biotechnology tools in chili pepper breeding and micropropagation of male sterile lines with objective to develop chili pepper hybrid F1 varieties by using cytoplasmic male sterility (CMS)” was realised to develop promising lines of chili pepper as CMS lines (A), Maintainer lines (B) and Restorer lines (R) The study was done in years (2013 – 2016) in the Research Seed Center of Southern Seed Coorporation (SSC) located at Phu Giao - Binh Duong Province and at Cu Chi- Ho Chi Minh city Plant materials used in this study include 50 lines of chili pepper Some techniques were used for this research: (1) Utilization of DNA markers: 41 pairs of SSR primers to evaluate and classify plant materials, two pairs of SCAR primers to identify types of chili pepper lines as A (CMS), B and R; these DNA markers also used as marker assisted backrossing (MAB) in chili pepper breeding program; (2) Utilization of traditional plant breeding methods: evaluating and classifying plant materials by agro-morphological characteristics, selecting inbreed lines by selfing and improving A/B and R lines by backrossing, test crossing to evaluate and determine promising hybrid F1; (3) Application of photo-autotrophic micropropagation or sugar-free micropropagation method to multiply the plants of CMS lines ( line A) Key words: chilli pepper (Capsicum annuum), DNA marker, inbreeding, backross, A (CMS) B and R lines, photoautotrophic culture II MỤC LỤC 2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 2.2.1 2.2.2 2.3 2.3.1 2.3.2 2.4 2.4.1 2.4.2 2.5 2.5.1 2.5.2 2.6 2.6.1 2.6.2 2.6.3 2.6.4 Tóm tắt nội dung nghiên cứu Mục lục Danh sách chữ viết tắt Danh sách bảng Danh sách hình THƠNG TIN CHUNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM Nội dung Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình định danh Marker liên kết gen phục hồi (Rf), yếu tố bất dục không bất dục tế bào chất (S/N) tiến tới xây dựng quy trình xác định loại dòng A, B R ớt cay Vật liệu Phương pháp Nội dung 2.Ứng dụng Marker phân tử kết hợp khảo sát số đặc tính hình thái, nơng học vào công tác đánh giá phân loại nguồn vật liệu ban đầu Vật liệu Phương pháp Nội dung Thanh lọc tuyển chọn dòng A, B, R triển vọng với tính trạng mục tiêu Vật liệu Phương pháp Nội dung Ứng dụng marker phân tử để cải thiện dòng A, B, R phương pháp Hồi giao (Backcross) Vật liệu Phương pháp Nội dung 5.Đánh giá dòng phương pháp lai Test Lai test (vụ 1) Khảo sát THL (vụ 2) Nội dung Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình vi nhân giống quang tự dưỡng ớt cay Chuyên đề 6.1 Khử trùng hạt ớt cay bất dục đực Chuyên đề 6.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật(BA IAA) lên khả tạo chồi đốt thân mầm in vitro Chuyên đề 6.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường giá thể lên tăng trưởng ớt bất dục đực giai đoạn in vitro ex vitro Chuyên đề 6.4 Khảo sát ảnh hưởng thành phần khoáng lên tăng trưởng ớt bất dục đực nuôi cấy quang tự dưỡng III Trang I III VI VIII X 26 26 26 27 30 30 31 36 36 36 37 37 37 38 38 38 40 40 41 43 46 2.6.5 2.6.6 2.7 2.7.1 2.7.2 in vitro Chuyên đề 6.5 Khảo sát ảnh hưởng cường độ ánh sáng thời gian chiếu sáng lên tăng trưởng ớt bất dục đực nuôi cấy quang tự dưỡng Khảo sát ảnh hưởng thoáng khí hộp ni lên tăng trưởng ớt bất dục đực nuôi cấy quang tự dưỡng Nội dung Xác định khả sản xuất trì ổn định dịng bất dục đực ớt cay trình vi nhân giống quang tự dưỡng Chuyên đề 7.1 7.2 Nhân giống theo quy trình nhân giống quang tự dưỡng đánh giá khả ổn định dòng trước trồng Chuyên đề 7.3 7.4 Đánh giá khả trì ổn định dịng bất dục đực nhân vơ tính CHƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 3.1 48 49 51 51 52 53 3.1.1 Nội dung Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình 53 định danh Marker liên kết gen phục hồi (Rf), yếu tố bất dục không bất dục tế bào chất (S/N) tiến tới xây dựng quy trình xác định loại dòng A, B R ớt cay Khảo sát mồi 54 3.1.1.1 Khảo sát marker CMS dịng CMS (A) trì (B) 54 3.1.1.2 Khảo sát marker Rf dòng phục hồi (R) trì (B) 57 3.1.2 Đánh giá phương pháp soi phấn 59 3.2 Nội dung Ứng dụng Marker phân tử kết hợp khảo sát số đặc tính hình thái, nơng học vào cơng tác đánh giá phân loại nguồn vật liệu ban đầu Kết phân nhóm theo khoảng cách di truyền Hệ số PIC, số allele tổng số băng DNA thể mồi Kết phân tích đa hình mối quan hệ di truyền dịng Ớt Phân nhóm theo đặc tính liên quan bất dục đực CMS Phân nhóm theo độ cay Phân nhóm theo hình thái, nơng học Nội dung Thanh lọc tuyển chọn dịng A, B, R triển vọng với tính trạng mục tiêu Nội dung Ứng dụng marker phân tử để cải thiện dòng A, B, R phương pháp Hồi giao (Backcross) Nội dung Đánh giá dòng phương pháp lai Test 63 3.2.1 3.2.1.1 3.2.1.2 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.3 3.4 3.5 IV 63 64 64 67 68 69 73 76 82 86 3.6 Nội dung Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình vi nhân giống quang tự dưỡng ớt cay 3.6.1 Chuyên đề 6.1 Khử trùng hạt ớt cay bất dục đực 3.6.2 Chuyên đề 6.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BA IAA) lên khả tạo chồi đốt thân mầm in 88 vitro 3.6.3 Chuyên đề 6.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường giá thể lên tăng trưởng ớt bất dục đực giai đoạn in vitro ex vitro 3.6.4 Chuyên đề 6.4 Khảo sát ảnh hưởng thành phần khoáng lên tăng trưởng ớt bất dục đực nuôi cấy quang tự dưỡng in vitro Chuyên đề 6.5.Khảo sát ảnh hưởng cường độ ánh sáng thời gian chiếu sáng lên tăng trưởng ớt bất dục đực nuôi cấy quang tự dưỡng Chuyên đề 6.6 Khảo sát ảnh hưởng thống khí hộp ni lên tăng trưởng ớt bất dục đực nuôi cấy quang tự dưỡng Nội dung Xác định khả sản xuất trì ổn định dịng bất dục đực ớt cay trình vi nhân giống quang tự dưỡng Chuyên đề 7.1 7.2 Nhân giống theo quy trình nhân giống quang tự dưỡng đánh giá khả ổn định dòng trước trồng Kết thí nghiệm 3.6.5 3.6.6 3.7 3.7.1 3.7.1.1 3.7.1.2 3.7.2 3.7.2.1 3.7.2.2 86 90 96 102 108 115 115 115 Kết chuyển giao cho SSC – so sánh nhân giống vơ tính 116 quang tự dưỡng môi trường MS Chuyên đề 7.3 7.4 Đánh giá khả trì ổn định 122 dịng nhân vơ tính Đánh giá tính ổn định dịng A qua đợt cấy chuyền 122 Đánh giá tính ổn định dịng A qua khả trì phục 124 hồi CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 V DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT AD AVRDC BC CAPS CC CCC CDR CMS CNSH DAS DD DNA DT DTL ĐC ĐHSTTV ĐK GCMS GMS GTTLK GTTLT HC HPLC HQ HT K NM NSG NST MAS MAB OP PCR PIC QTD RAPD SCAR SHNĐ SHU SL S-nhăn THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT Ấn Độ Trung tâm Nghiên cứu Phát triển rau Châu Á Backcross (Hồi giao) Cleaved Amplified Polymorphic Sequences Cao Chiều cao Chiều dài rễ Cytoplasmic Male Sterility(Bất dục đực bào chất) Công nghệ sinh học Day after sowing (ngày sau gieo) Dị dạng Deoxyribonucleic acid Dài trái Diện tích Đối chứng Điều hịa sinh trưởng thực vật Đường kính Cytoplasmic- Genetic Male Sterility (Bất dục đực tế bào chất – nhân) Genetic Male Sterility (Bất dục đực nhân) Gia tăng trọng lượng khô Gia tăng trọng lượng tươi Hơi cao High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng lực cao) Hàn Quốc Hơi thấp Kali Nảy mầm Ngày sau gieo Nhiễm sắc thể Marker assisted selection (Marker hỗ trợ chọn lọc) Marker assisted backcrossing (marker hỗ trợ backcross) Open pollination (Giao phấn tự do) Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) Polymorphic Information Content (Chỉ số thơng tin đa hình) Quang tự dưỡng Random Amplification of Polymorphic DNA Sequence Characterized Amplified Region Sinh học Nhiệt đới Scoville Heat Unit (Đơn vị đo độ cay ớt) Số Sừng-nhăn VI VIẾT TẮT SR SRC SSC SSR SV SX T TB TGT THL TL TLN TLNM TLT TP HCM TQ UV VL VN VSHND THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT Số rễ Trung tâm Nghiên cứu giống trồng miền Nam Công ty Cổ phần giống Cây Trồng miền Nam Simple sequence repeat (trình tự lập lại đơn giản) Sừng vàng Sừng xanh Thấp Trung bình Thời gian trổ hoa Tổ hợp lai Thái Lan Tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ hạt nảy mầm Trọng lượng trái Thành phố Hồ Chí Minh Trung Quốc Ultraviolet Vật liệu Việt Nam Viện Sinh học Nhiệt đới VII SỐ 1.1 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 DANH SÁCH BẢNG TÊN BẢNG SỐ LIỆU Các đặc tính phân loại dùng phân biệt lồi Capsicum Thơng tin cặp mồi nghiên cứu Thành phần phản ứng PCR Điều kiện phản ứng PCR Danh sách thơng tin 50 giống/dịng Ớt vật liệu ban đầu Thông tin cặp mồi tham giá đánh giá đa dạng di truyền ớt cay Thành phần gel polyacrylamide 6% Thông tin cặp mồi tham gia đánh giá dòng A, B, R ớt cay Sơ đồ lai test dịng ớt triển vọng Bố trí thí nghiệm phương pháp khử trùng Bố trí thí nghiệm nồng độ đường giá thể Bố trí thí nghiệm hàm lượng nitơ tổng Bố trí thí nghiệm thời gian cường độ chiếu sáng Kết đánh giá tính bất dục, hữu dục marker, kiểm tra hạt phấn cặp A/B dòng R ớt cay Hệ số PIC, số allele tổng số băng DNA thể cặp mồi Phân nhóm dịng ớt cay theo kiểu dòng A, B, R Kết khảo sát nhận diện marker SSR đa hình dịng B (HP2, HP47) dòng CMS(HP11) Kết khảo sát nhận diện marker SSR đa hình dịng bố mẹ tái tục (HP5) dòng cho (HP5) TRANG 26 28 28 30 31 33 35 38 41 44 47 48 62 64 68 77 80 Các tiêu nông học giống ớt trongthí nghiệm khảo sát vụ ĐX 15-16 Củ Chi Các tiêu trái giống ớt thí nghiệm khảo sát vụ ĐX 15-16 Củ Chi Năng suất thành phần suất giống ớt thí nghiệm khảo sát vụ ĐX 15-16 Củ Chi 82 3.9 Ảnh hưởng phương pháp khử trùng điều kiện chiếu sáng lên tỷ lệ nhiễm (TLN), tỷ lệ hạt nảy mầm (TLNM) theo thời gian nuôi cấy 86 3.10 Số chồi tỉ lệ mẫu tạo chồi từ đốt thân ớt bất dục đực nuôi cấy in vitro ngày thứ 14, 28 42 89 3.11 Ảnh hưởng nồng độ đường giá thể lên gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT), gia tăng trọng lượng khô (GTTLK), số hàm lượng chlorophyll (Chl) a+b ớt bất dục đực nuôi cấy in vitro ngày thứ 42 90 3.7 3.8 VIII 83 85 SỐ 3.12 TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 94 Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT) cây, gia tăng trọng lượng khô (GTTLK) cây, chiều cao cây, số lá/cây ớt bất dục đực ex vitro ngày thứ 3.13 Ảnh hưởng thành phần khoáng lên gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT), gia tăng trọng lượng khô (GTTLK), hàm lượng nitơ tổng số (N tổng), tỷ lệ chlorophyll a/b (chl a/b), tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/trọng lượng tươi rễ (TLTTL/TLTR) ngày thứ 42 97 3.14 Ảnh hưởng cường độ ánh sáng thời gian chiếu sáng lên gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT), gia tăng trọng lượng khơ (GTTLK), diện tích (DTL) ngày thứ 21 42, tỷ lệ chlorophyll a/b (Chl a/b) ngày thứ 42 ớt bất dục đực nuôi cấy quang tự dưỡng 104 3.15 Ảnh hưởng mức độ thống khí khác bao nylon lên gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT), gia tăng trọng lượng khô (GTTLK), chiều cao (CCC), chiều dài rễ (CDR), số (SL), số rễ (SR), diện tích (DTL) ớt bất dục đực nuôi cấy quang tự dưỡng ngày thứ 42 111 3.16 Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT), chiều cao (CC), chiều dài rễ (CDR) số ớt bất duc đực theo thời gian cấy chuyền 115 3.17 Tỷ lệ nảy mầm hạt ớt HP 36 môi trường MS QTD 117 3.18 Hệ số nhân tỷ lệ sống sau đợt nuôi cấy 117 3.19 Chiều cao (CC), chiều dài rễ (CDR), số số rễ ớt bất dục đực nuôi cấy môi trường QTD theo thời gian cấy chuyền 119 3.20 Chiều cao (CC), chiều dài rễ (CDR), số số rễ ớt bất dục đực nuôi cấy môi trường MS theo thời gian cấy chuyền 119 3.21 Chiều cao (CC), thời gian trổ hoa (TGT), trọng lượng trái (TLT) chiều dài trái (DT), đường kính trái (ĐK) số hạt/trái ớt bất dục đực theo thời gian cấy chuyền 122 3.22 Tỷ lệ nảy mầm (NM), tỷ lệ dị dạng (DD) chiều cao (CC) hệ F1 dòng A theo đợt cấy truyền 124 IX Mean Mean Mean Mean Mean Mean 3= 4= 5= 6= 7= 8= 55.60 C Mean 66.70 B Mean 66.70 B Mean 81.50 A Mean 0.0000 F Mean 0.0000 F Mean 4= 3= 2= 1= 7= 8= 66.70 B 55.60 C 37.00 D 18.50 E 0.0000 F 0.0000 F Tỉ lệ hạt nảy mầm ngày Duncan's Multiple Range Test LSD value = 10.10 s_ = 2.545 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean = 30.90 C Mean = 50.60 A Mean = 39.50 BC Mean = 46.90 AB Mean = 50.60 A Mean = 39.50 BC Mean = 46.90 AB Mean = 37.00 BC Mean = 17.30 D Mean = 30.90 C Mean = 37.00 BC Mean = 17.30 D Mean = 4.900 E Mean = 6.200 E Mean = 6.200 E Mean = 4.900 E Tỉ lệ hạt nảy mầm ngày 14 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 6.705 s_ = 1.689 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean = 59.30 C Mean = 86.40 Mean = 75.30 B Mean = 79.00 Mean = 86.40 A Mean = 75.30 Mean = 79.00 B Mean = 63.00 Mean = 56.80 C Mean = 59.30 Mean = 63.00 C Mean = 56.80 Mean = 45.70 D Mean = 45.70 Mean = 39.50 D Mean = 39.50 A B B C C C D D Tỉ lệ hạt nảy mầm ngày 21 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 6.478 s_ = 1.632 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean = 61.70 E Mean = 90.10 A Mean = 75.30 CD Mean = 86.40 AB Mean = 90.10 A Mean = 80.20 BC Mean = 86.40 AB Mean = 75.30 CD Mean = 80.20 BC Mean = 72.80 D Mean = 72.80 D Mean = 65.40 E Mean = 65.40 E Mean = 61.70 E Mean = 46.90 F Mean = 46.90 F Tỉ lệ hạt nảy mầm ngày 28 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 4.240 s_ = 1.068 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean = 63.00 D Mean = 96.30 A Mean = 77.80 C Mean = 88.90 B Mean = 96.30 A Mean = 85.20 B 132 Mean Mean Mean Mean Mean 4= 5= 6= 7= 8= 88.90 B 85.20 B 74.10 C 66.70 D 48.10 E Mean Mean Mean Mean Mean 2= 6= 7= 1= 8= 77.80 C 74.10 C 66.70 D 63.00 D 48.10 E Bảng 2.14 Số chồi ngày 14 Least Significant Difference Test LSD value = 273.7 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 0.6 A Mean = 0.6 A Mean = 0.6 A Mean = 0.6 A Mean = 0.3 B Mean = 0.3 B Mean = 0.3 B Mean = 0.3 B Số chồi ngày 28 Least Significant Difference Test LSD value = 333.7 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 0.9 B Mean = 1.4 Mean = 1.0 B Mean = 1.4 Mean = 1.4 A Mean = 1.0 Mean = 1.4 A Mean = 0.9 A A B B Số chồi ngày 42 Least Significant Difference Test LSD value = 194.7 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 1.2 D Mean = 2.5 A Mean = 1.6 C Mean = 2.3 B Mean = 2.3 B Mean = 1.6 C Mean = 2.5 A Mean = 1.2 D Tỉ lệ mẫu tạo chồi ngày 14 Least Significant Difference Test LSD value = 217.2 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 58.3 A Mean = 58.3 Mean = 58.3 A Mean = 58.3 Mean = 25.0 B Mean = 25.0 Mean = 25.0 B Mean = 25.0 A A B B Tỉ lệ mẫu tạo chồi ngày 28 Least Significant Difference Test LSD value = 148.8 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 75.0 B Mean = 100.0 A Mean = 83.3 A Mean = 100.0 A Mean = 100.0 A Mean = 83.3 B Mean = 100.0 A Mean = 75.0 B Bảng 2.15 (Giai đoạn in vitro) Gia tăng trọng lượng tươi 133 Least Significant Difference Test LSD value = 333.7 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 817.2 A Mean = 996.1 A Mean = 996.1 A Mean = 817.2 A Mean = 398.5 B Mean = 398.5 B Gia tăng trọng lượng khô Least Significant Difference Test LSD value = 24.85 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 72.30 A Mean = 77.90 A Mean = 77.90 A Mean = 72.30 A Mean = 44.00 B Mean = 44.00 B Số Least Significant Difference Test LSD value = 0.7038 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 9.600 B Mean = 12.70 A Mean = 12.70 A Mean = 9.700 B Mean = 9.700 B Mean = 9.600 B Hàm lượng chlorophyll a+b Least Significant Difference Test LSD value = 2.243 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 4.300 C Mean = 27.20 A Mean = 27.20 A Mean = 24.80 B Mean = 24.80 B Mean = 4.300 C Bảng 2.16 (Giai đoạn ex vitro) Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT) Least Significant Difference Test LSD value = 86.84 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 2171 B Mean = 2515 A Mean = 2515 A Mean = 2171 B Mean = 1955 C Mean = 1955 C Chiều cao Least Significant Difference Test LSD value = 8.103 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 129.3 B Mean = 146.5 A Mean = 132.6 B Mean = 132.6 B Mean = 146.5 A Mean = 129.3 B Bảng 2.18 Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT) ngày thứ 42 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 56.58 134 s_ = 13.80 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean = 685.2 B Mean = 815.4 Mean = 594.5 C Mean = 759.6 Mean = 759.6 A Mean = 685.2 Mean = 815.4 A Mean = 617.7 Mean = 617.7 C Mean = 594.5 Mean = 412.4 D Mean = 412.4 A A B C C D Gia tăng trọng lượng khô (GTTLK) ngày thứ 42 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 7.934 s_ = 2.659 at alpha = 0.050 x Original Order Ranked Order Mean = 48.34 BC Mean = 58.21 A Mean = 49.75 AB Mean = 54.74 AB Mean = 54.74 AB Mean = 53.05 AB Mean = 58.21 A Mean = 49.75 AB Mean = 53.05 AB Mean = 48.34 BC Mean = 41.04 C Mean = 41.04 C Hàm lượng nitơ tổng số (N tổng) ngày thứ 42 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 3.462 s_ = 0.8446 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean = 37.48 AB Mean = 40.42 A Mean = 36.19 B Mean = 37.95 AB Mean = 37.95 AB Mean = 37.48 AB Mean = 40.42 A Mean = 36.19 B Mean = 26.10 C Mean = 26.10 C Mean = 20.99 D Mean = 20.99 D Tỷ lệ chlorophyll a/b (Chl a/b) ngày thứ 42 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.2246 s_ = 0.07528 at alpha = 0.050 x Original Order Ranked Order Mean = 2.720 AB Mean = 2.940 Mean = 2.730 AB Mean = 2.730 Mean = 2.730 AB Mean = 2.730 Mean = 2.640 BC Mean = 2.720 Mean = 2.940 A Mean = 2.640 Mean = 2.480 C Mean = 2.480 A AB AB AB BC C Tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/trọng lượng tưới rễ (TLTTL/TLTR) ngày thứ 42 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.8630 s_ = 0.2106 at alpha = 0.010 x 135 Original Order Mean = 3.000 Mean = 1.840 Mean = 2.020 Mean = 2.570 Mean = 2.350 Mean = 4.120 B C C BC BC A Ranked Order Mean = 4.120 A Mean = 3.000 B Mean = 2.570 BC Mean = 2.350 BC Mean = 2.020 C Mean = 1.840 C Bảng 2.20 Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT) ngày thứ 42 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 231.3 s_ = 77.53 at alpha = 0.050 x Original Order Ranked Order Mean = 505.5 B Mean = 777.3 A Mean = 470.7 B Mean = 639.7 AB Mean = 639.7 AB Mean = 602.1 AB Mean = 602.1 AB Mean = 505.5 B Mean = 777.3 A Mean = 500.5 B Mean = 500.5 B Mean = 470.7 B Gia tăng trọng lượng khô (GTTLK) ngày thứ 42 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 18.41 s_ = 6.170 at alpha = 0.050 x Original Order Ranked Order Mean = 40.50 B Mean = 62.10 A Mean = 37.60 B Mean = 51.30 AB Mean = 51.30 AB Mean = 48.30 AB Mean = 48.30 AB Mean = 40.50 B Mean = 62.10 A Mean = 40.20 B Mean = 40.20 B Mean = 37.60 B Tỷ lệ chlorophyll a/b (Chl a/b) ngày thứ 42 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 1.193 s_ = 0.2910 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean = 3.300 BC Mean = 4.900 A Mean = 4.900 A Mean = 4.000 AB Mean = 2.900 BC Mean = 3.300 BC Mean = 2.600 C Mean = 2.900 BC Mean = 2.900 BC Mean = 2.900 BC Mean = 4.000 AB Mean = 2.600 C 136 PHỤ LỤC 14 CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG TRONG NỘI DUNG VÀ KHỐNG MS (Murashige& Skoog, 1962) Khốngđalượng (macro-elements) Ammonium nitrate (NH4NO3) Calcium chloride (CaCl2 · 2H2O) Magnesium sulphate (MgSO4 · 7H2O) Potassium phosphate (KH2PO4) Potassium nitrate (KNO3) 1,650 mg L-1 440 mg L-1 370 mg L-1 170 mg L-1 1,900 mg L-1 Khoáng vi lượng (micro-elements) Boric acid (H3BO3) Cobalt chloride (CoCl2 · 6H2O) Cupric sulphate (CuSO4 · 5H2O) Manganese sulphate (MnSO4 · 4H2O) Potassium iodide (KI) Sodium molybdate (Na2MoO4 · 2H2O) Zinc sulphate (ZnSO4·7H2O) 6.2 mg L-1 0.025 mg L-1 0.025 mg L-1 22.3 mg L-1 0.83 mg L-1 0.25 mg L-1 8.6 mg L-1 Ferrous sulphate (FeSO4 · 7H2O) Na2EDTA · 2H2O 27.8 37.2 mg L-1 mg L-1 KHỐNG MS THAY ĐỔI Thànhphầnkhốngđalượng MS (mg L-1)đượcthayđổi chuyênđề 6.4 40(1:2) 60(1:2) 40(1:3) 60(1:3) 40(0:1) 628.2 1650 800 1200 440 440 440 440 440 370 370 370 370 370 170 170 170 170 170 1900 1900 2020 3030 4040 Hàmlượng (NH4)2SO4 thêmvào 363.66 0 0 60(0:1) 440 370 170 6060 Tênnghiệmthức NH4NO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2PO4 KNO3 VITAMIN MOREL (Morel & Wetmore, 1951) Myo – Inositol 100.00 mg L-1 Thiamine hydrochloride 1.00 mg L-1 Pyridoxine hydrochloride 1.00 mg L-1 Nicotinic acid (Free acid) 1.00 mg L-1 Biotin 0.01 mg L-1 Calcium pantothenate 1.00 mg L-1 137 PHỤ LỤC NỘI DUNG (SSC) PHỤ LỤC 15 PHÂN TÍCH ANOVA NỘI DUNG (SSC) MÔI TRƯỜNG MS ANOVA MS SỐ RỄ ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 48.109 24.054 235.315 0.0000 Within 0.613 0.102 Total 48.722 Coefficient of Variation = 7.34% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 22.600 7.533 0.31 0.18 3.00 10.300 3.433 0.38 0.18 3.00 6.300 2.100 0.26 0.18 -Total 9.00 39.200 4.356 2.47 0.82 Within 0.32 DÀI RỄ ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 8.402 4.201 180.048 0.0000 Within 0.140 0.023 Total 8.542 Coefficient of Variation = 2.91% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 14.800 4.933 0.15 0.09 3.00 19.700 6.567 0.15 0.09 3.00 12.800 4.267 0.15 0.09 -Total 9.00 47.300 5.256 1.03 0.34 Within 0.15 CHIỀU CAO CÂY ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob - 138 Between 6.602 3.301 95.839 0.0000 Within 0.207 0.034 Total 6.809 Coefficient of Variation = 8.48% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 10.200 3.400 0.17 0.11 3.00 4.800 1.600 0.17 0.11 3.00 4.700 1.567 0.21 0.11 -Total 9.00 19.700 2.189 0.92 0.31 Within 0.19 SỐ LÁ ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 19.236 9.618 577.066 0.0000 Within 0.100 0.017 Total 19.336 Coefficient of Variation = 2.38% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 22.400 7.467 0.12 0.07 3.00 14.000 4.667 0.12 0.07 3.00 12.400 4.133 0.15 0.07 -Total 9.00 48.800 5.422 1.55 0.52 Within 0.13 MÔI TRƯỜNG QTD ANOVA QTD SỐ RỄ ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 15.976 7.988 359.450 0.0000 Within 0.133 0.022 Total 16.109 Coefficient of Variation = 3.04% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 20.300 6.767 0.15 0.09 3.00 12.800 4.267 0.21 0.09 3.00 11.100 3.700 0.00 0.09 -Total 9.00 44.200 4.911 1.42 0.47 Within 0.15 139 DÀI RỄ ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 7.047 3.523 288.273 0.0000 Within 0.073 0.012 Total 7.120 Coefficient of Variation = 1.37% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 21.000 7.000 0.10 0.06 3.00 27.500 9.167 0.15 0.06 3.00 24.100 8.033 0.06 0.06 -Total 9.00 72.600 8.067 0.94 0.31 Within 0.11 CHIỀU CAO CÂY ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.602 0.301 11.292 0.0092 Within 0.160 0.027 Total 0.762 Coefficient of Variation = 7.24% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 7.700 2.567 0.23 0.09 3.00 5.800 1.933 0.06 0.09 3.00 6.800 2.267 0.15 0.09 -Total 9.00 20.300 2.256 0.31 0.10 Within 0.16 SỐ LÁ ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1.860 0.930 69.750 0.0001 Within 0.080 0.013 Total 1.940 Coefficient of Variation = 1.69% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 22.300 7.433 0.15 0.07 3.00 19.000 6.333 0.12 0.07 3.00 20.200 6.733 0.06 0.07 -Total 9.00 61.500 6.833 0.49 0.16 140 Within 0.12 SO SÁNH MS VÀ QTD DÀI RỄ MS-QTD ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 6.407 6.407 384.401 0.0000 Within 0.067 0.017 Total 6.473 Coefficient of Variation = 2.16% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 14.800 4.933 0.15 0.07 QTD 3.00 21.000 7.000 0.10 0.07 -Total 6.00 35.800 5.967 1.14 0.46 Within 0.13 ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 10.140 10.140 434.572 0.0000 Within 0.093 0.023 Total 10.233 Coefficient of Variation = 1.94% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 19.700 6.567 0.15 0.09 QTD 3.00 27.500 9.167 0.15 0.09 -Total 6.00 47.200 7.867 1.43 0.58 Within 0.15 ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 21.282 21.282 1596.121 0.0000 Within 0.053 0.013 Total 21.335 Coefficient of Variation = 1.88% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 12.800 4.267 0.15 0.07 3.00 24.100 8.033 0.06 0.07 141 -Total 6.00 36.900 6.150 2.07 0.84 Within 0.12 DÀI THÂN ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1.042 1.042 25.000 0.0075 Within 0.167 0.042 Total 1.208 Coefficient of Variation = 6.84% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 10.200 3.400 0.17 0.12 QTD 3.00 7.700 2.567 0.23 0.12 -Total 6.00 17.900 2.983 0.49 0.20 Within 0.20 ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.167 0.167 10.000 0.0341 Within 0.067 0.017 Total 0.233 Coefficient of Variation = 7.31% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 4.800 1.600 0.17 0.07 QTD 3.00 5.800 1.933 0.06 0.07 -Total 6.00 10.600 1.767 0.22 0.09 Within 0.13 ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.735 0.735 22.050 0.0093 Within 0.133 0.033 Total 0.868 Coefficient of Variation = 9.53% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 4.700 1.567 0.21 0.11 QTD 3.00 6.800 2.267 0.15 0.11 142 -Total 6.00 11.500 1.917 0.42 0.17 Within 0.18 SỐ LÁ ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.002 0.002 0.091 Within 0.073 0.018 Total 0.075 Coefficient of Variation = 1.82% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 22.400 7.467 0.12 0.08 QTD 3.00 22.300 7.433 0.15 0.08 -Total 6.00 44.700 7.450 0.12 0.05 Within 0.14 ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 4.167 4.167 312.499 0.0001 Within 0.053 0.013 Total 4.220 Coefficient of Variation = 2.10% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 14.000 4.667 0.12 0.07 QTD 3.00 19.000 6.333 0.12 0.07 -Total 6.00 33.000 5.500 0.92 0.38 Within 0.12 ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 10.140 10.140 760.498 0.0000 Within 0.053 0.013 Total 10.193 Coefficient of Variation = 2.13% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 12.400 4.133 0.15 0.07 QTD 3.00 20.200 6.733 0.06 0.07 143 -Total 6.00 32.600 5.433 1.43 0.58 Within 0.12 SỐ RỄ ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.882 0.882 15.114 0.0177 Within 0.233 0.058 Total 1.115 Coefficient of Variation = 3.38% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 22.600 7.533 0.31 0.14 QTD 3.00 20.300 6.767 0.15 0.14 -Total 6.00 42.900 7.150 0.47 0.19 Within 0.24 ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1.042 1.042 11.161 0.0288 Within 0.373 0.093 Total 1.415 Coefficient of Variation = 7.94% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 10.300 3.433 0.38 0.18 QTD 3.00 12.800 4.267 0.21 0.18 -Total 6.00 23.100 3.850 0.53 0.22 Within 0.31 ĐỢT ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 3.840 3.840 109.714 0.0005 Within 0.140 0.035 Total 3.980 Coefficient of Variation = 6.45% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -MS 3.00 6.300 2.100 0.26 0.11 QTD 3.00 11.100 3.700 0.00 0.11 144 -Total 6.00 17.400 2.900 0.89 0.36 Within 0.19 PHỤ LỤC 16 PHÂN HẠNG NỘI DUNG (SSC) PHÂN HẠNG LSD QTD DÀI RỄ Least Significant Difference Test LSD value = 0.3001 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 7.000 C Mean = 9.167 A Mean = 9.167 A Mean = 8.033 B Mean = 8.033 B Mean = 7.000 C CHIỀU CAO CÂY Least Significant Difference Test LSD value = 0.4502 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 2.567 A Mean = 2.567 A Mean = 1.933 B Mean = 2.267 AB Mean = 2.267 AB Mean = 1.933 B SỐ LÁ Least Significant Difference Test LSD value = 0.3124 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 7.433 A Mean = 7.433 A Mean = 6.333 C Mean = 6.733 B Mean = 6.733 B Mean = 6.333 C SỐ RỄ Least Significant Difference Test LSD value = 0.4064 at alpha = 0.010 Original Order Mean = 6.767 A Mean = 4.267 B Mean = 3.700 C Ranked Order Mean = 6.767 A Mean = 4.267 B Mean = 3.700 C PHÂN HẠNG LSD MS DÀI RỄ Least Significant Difference Test LSD value = 0.2855 at alpha = 0.050 Original Order Mean Mean Mean = 4.933 B = 6.567 A = 4.267 C Ranked Order Mean = 6.567 A Mean = 4.933 B Mean = 4.267 C CHIỀU CAO CÂY Least Significant Difference Test LSD value = 0.3472 at alpha = 0.050 Original Order Mean = 3.400 A Ranked Order Mean = 3.400 A 145 Mean Mean = 1.600 B = 1.567 B Mean Mean 2= 3= 1.600 B 1.567 B SỐ LÁ Least Significant Difference Test LSD value = 0.2455 at alpha = 0.050 Original Order Mean = 7.467 A Mean = 4.667 B Mean = 4.133 C Ranked Order Mean = 7.467 A Mean = 4.667 B Mean = 4.133 C SỐ RỄ Least Significant Difference Test LSD value = 0.2063 at alpha = 0.050 Original Order Mean = 7.533 A Mean = 3.433 B Mean = 2.100 C Ranked Order Mean = 7.533 A Mean = 3.433 B Mean = 2.100 C 146