PHÁT HIỆN và ĐỊNH LƯỢNG VIRUS AUJESZKY TRÊN HEO BẰNG kỹ THUẬT NESTED PCR và REAL TIME PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bài tiểu luận PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS AUJESZKY TRÊN HEO BẰNG KỸ THUẬT NESTED PCR VÀ REAL-TIME PCR Giáo viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phương Thảo Mã số sinh viên: 06126139 Lớp: DH06SH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com A Đặt vấn đề Trong trình phát triển ngành chăn ni heo giới chăn ni phải đối mặt với khơng khó khăn, đặc biệt bệnh ảnh hưởng trực tiếp đến thành tích sinh sản tăng trưởng heo như: bệnh dịch tả heo, bệnh đóng dấu son, bệnh tai xanh số có bệnh giả dại (Aujeszky) Ở heo, bệnh lan tràn dạng nhiễm trùng tiềm ẩn, gây tử vong cho heo chứng viêm não cấp Virus pseudorabies (PrV) thiết lập lây nhiễm suốt đời (mãn tính) nhiều mơ thần kinh vật chủ tự nhiên, lây nhiễm phục hồi hoạt động kích thích căng thẳng (stress) tự nhiên hay thí nghiệm ( Rock,1993; Azmietal ctv, 2002) Kỹ thuật ELISA phân biệt kháng glucoprotein phát triển cho phép kiểm soát lan truyền PrV, tiêu diệt chúng việc kiểm soát tiêu diệt heo bị nhiễm virus (Kit ctv, 1990; Lehmann ctv, 2002; Pensaert ctv, 2004) Tuy nhiên, heo với lây nhiễm tiềm ẩn, coi miễn với PrV, dễ dàng bị bỏ sót trường hợp ELISA phân biệt sai để tìm đáp ứng kháng thể với virus Hơn nữa, điều nêu lên vài heo lây nhiễm tiềm ẩn với PrV biến thể huyết âm tính (Jacobs và ctv, 1996; McCaw ctv, 1997) Những kỹ thuật khác phát triển để phát định lượng nhiễm PrV tiềm ẩn (Schang and Osorio, 1994; Denis ctv., 1997) Kỹ thuật này, dựa vào cấy chuyển tiêm truyền (explantation and cocultivation) mô nhiễm bệnh, hai phương pháp tốn nhiều thời gian độ nhạy không cao, sử dụng kỹ thuật phân tử giúp ích với việc nâng cao độ nhạy độ xác (McFarlane ctv., 1986; Lokensgard ctv., 1991) Đặc biệt, kỹ thuật PCR dự đoán trước gia tăng đáng kể khả xác định tồn định lượng virus mà điều gặp trở ngại nuôi cấy mô Việc sử dụng kỹ thuật này, kết này, tiếp tục gia tăng (Krumbholz ctv., 2003; Mumford ctv., 2004; Ozoemena ctv., 2004) Trong báo cáo sử dụng kỹ thuật nested PCR real-time PCR xác định tần số thực tế số lượng lây nhiễm PrV mô thần kinh nhiều heo chọn ngẫu nhiên Từ đó, áp dụng kỹ thuật việc phát virus PrV tiềm ẩn heo Việt Nam LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com B Tổng quan I Bệnh Aujeszky 1.1 Khái niệm Bệnh Aujeszky bệnh truyền nhiễm virus gây nên heo, loài gặm nhấm nhiều loài động vật khác Bệnh Aujeszky cịn có tên gọi khác như: pseudorage, aujeszky’s disease, pseudorabie, mad itch Ở heo, bệnh lan tràn dạng nhiễm trùng tiềm ẩn, gây tử vong cho heo chứng viêm não cấp Ở loài vật khác, người thấy triệu chứng viêm não – màng não tiến triển mau lẹ đưa tới tử vong kèm theo chứng ngứa khơng cản trở Khơng thấy bệnh lây người Hình Diagram showing the virion structure, its different proteins (with the new nomenclature) and the DNA of the AD virus (nguồn: www.sanidadanimal.info/ /images/9virus.gif ) 1.1.1 Lịch sử phân bố địa lí Năm 1902, Aladar Aujeszky, giáo sư vi trùng học trường Thú y Budapest phân lập bệnh việc nuôi cấy thỏ, bệnh phẩm từ thần kinh chó bê sau xuất triệu chứng thần kinh tương tự bệnh dại thời gian nung bệnh ngắn khoảng ngày, dẫn đến chết 24–48 với biểu ngứa dội điểm tiêm truyền Ơng cho bệnh khác với bệnh dại Về sau bệnh ghi nhận nhiều loài thú Nhưng thời gian dài người ta heo (ổ chứa nguồn lây nhiễm cho loài vật khác) hầu hết quốc gia bị nhiễm Ngay Pháp, LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com từ năm 1912 bệnh nghi ngờ bò chó, giám định chắn vào năm 1934 bò tơ đến 1966 việc cảm nhiễm heo xác lập Bệnh xuất nhiều quốc gia Châu Âu, Bắc Nam Mỹ Bệnh chưa biết rõ Châu Phi Châu Á Nhưng vài năm gần gây thiệt hại nhiều quốc gia Singapore, Đài Loan… Vài quốc gia như: Áo, Úc, Nhật chưa thấy xuất bệnh 1.1.2 Căn bệnh Aujeszky DNA virus, thuộc họ Herpesviridase Suid Herpesvirus I (SHV I), kích thước 180 nm, 162 capsomeres, có vỏ bọc Virus đề kháng trung bình với tác nhân vật lí hóa học Một số chất vô hoạt virus Formol, beta – probiolactone Glutaraldehyde, ethyl ethylene imine( áp dụng cho chế vaccine vô hoạt), nước javel, NH4 (áp dụng vào việc sát trùng), virus tồn lâu oC đến – 20 oC Bệnh tích tế bào đặc trưng xuất thể vùi nhân ưa acid hợp bào (syncytia) Áp dụng thực hành phương pháp sản xuất nhiều virus (cho việc chế tạo vaccine) biến đổi độc lực, phân lập chủng virus (chẩn đốn virus) định hiệu giá tìm kiếm kháng thể Trong tự nhiên, virus có tính gây bệnh mạnh, giết chết số lồi thú theo số hướng Virus hướng thần kinh (neurotropisme) liên quan đến biểu lâm sàng phân bố virus thể Virus hướng sinh dục liên quan đến việc gây sảy thai Virus hướng phổi gây xáo trộn hô hấp (hầu hết cho heo cai sữa) Đặc điểm kháng nguyên: vỏ bọc chứa loại glycoprotein gI, gII, gIII, gIV (hay gp 50), gX (hay gp 63) Capside chứa protein, thymidine Kinase Nguồn chứa virus: Heo bệnh virus qua chất tiết, dịch từ mũi, miệng, sinh dục tinh trùng Ở thời kì cao điểm, heo cai sữa thải 105,3 Virus cịn diện lớn tử thi heo Heo khỏi bệnh trở thành vật chứa virus chết Chúng virus, chết đột ngột ảnh hưởng vài yếu tố (tiêm vaccine, thay đổi chỗ nuôi, tình trạng sinh lí – chửa đẻ…) Heo khỏe mang trùng lại thường gặp heo trưởng thành, nhiễm trùng heo vừa khỏi bệnh, chúng ổ chứa giả dại Heo tiêm vaccine sau tiếp xúc với virus Aujeszky gây bệnh tự nhiên (virus hoang dã) trở thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vật khỏe mang trùng Việc tiêm chủng dùng lẽ giới hạn cường độ thời gian virus hoang dã xâm nhiễm Chất chứa bệnh Heo bệnh: chất tiết (mũi, miệng, quan sinh dục) tử thi nhiều virus Heo khỏi bệnh mang trùng: thấy virus nước mũi tháng sau Heo khỏe mang trùng:(có thể nhiễm trung thầm lặng) gặp nhiều heo sinh sản hay heo tiêm vaccine cảm nhiễm virus hoang dại Các sản phẩm động vật: thịt quan (gan, thận, phổi) heo bệnh nguồn lây nhiễm nguy hiểm cho loài ăn thịt Virus cịn tìm thấy tinh trùng, huyết heo ( tinh trạng huyết nhiễm siêu vi) Từ môi trường bên ngồi: virus tồn thức ăn, nước uống, phương tiện vận chuyển 30 – 40 ngày Virus gió mang từ vài trăm mét tới khoảng hai km Đường xâm nhập: Ở heo, virus xâm nhập qua đường miệng (qua sữa, qua thức ăn), đường mũi, đường sinh dục, qua da bị xây sát Ở thú ăn thịt cho lông (cao, chồn…) đường xâm nhập chủ yếu đường tiêu hóa Trên bị, người ta chưa biết thật rõ, qua da Các stress mở đường cho xâm nhiễm thải virus Cách sinh bệnh: Sau theo đường mũi – miệng (oro – nasal) virus nhân lên chỗ, đặc biệt hạch amygdale lan tỏa hướng trung tâm thần kinh đồng thời công thần kinh trung ương Mặt khác qua đường máu, tình trạng viremia, virus công nhiều quan phổi (gây xáo trộn hô hấp), quan sinh sản (gây xáo trộn sinh sản) Trong cảm nhiễm chậm, heo khỏi bệnh, virus diện thời gian dài vài mơ (có thể phân lập virus tháng sau khỏi bệnh) Việc cảm nhiễm thời gian phơi thai (thời kì heo nái có mang) dẫn đến sảy thai Cách lây lan: Ở heo lây theo hai cách: trực tiếp gián tiếp Trực tiếp (chủ yếu): heo bú sữa mẹ mắc bệnh, heo lớn nuôi nhốt chung, heo giống giao phối qua bào thai tùy thuộc ngày nhiễm virus mà gây sảy thai, thai khô, chết thai, sinh còi cọc… Gián tiếp: qua xe chổ thức ăn, qua dụng cụ nhiễm Ở loài vật khác: chó, mèo, thú lấy lơng phần lớn tiêu thụ phận heo bệnh chứa virus LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.1.3.Triệu chứng Trên heo mức độ trầm trọng triệu chứng số heo chết tỉ lệ nghịch với tuổi heo Triệu chứng ngứa hay gặp thú khác khơng gặp heo Heo 15 ngày tuổi: phát triển lâm sàng nhanh, vài đến 12 chết Tử số lên đến 100% Con vật bệnh có biểu thần kinh như: o Run cơ, hoạt động phối hợp, vòng o Co giật (convulsion) khoảng 45 giây, co rút ưỡn cong người sau (opisthotonus) o Đạp bơi bốn chân o Nghiến răng, chảy nước nhãi o Trợn mắt (nygtaginus) o Có thể ói mửa, tiêu chảy, nhiệt độ khơng vượt 41 oC Heo 15 ngày – tháng tuổi: Bắt đầu với biểu ăn không ngon, thân nhiệt tăng o 41 C -3 ngày Có số dấu hiệu thần kinh viêm màng não, não tủy cấp tính (meningo-encephalo myélite) như: nhạy cảm, dễ run cơ, động kinh (epileptiforme) kêu khàn giọng, liệt vùng hầu, chảy nhiều nước dãi (ptyalisme) Con vật chết sau 4-6 ngày kể từ xuất triệu chứng thần kinh Tỉ lệ tử vong khoảng 20% Heo ni vỗ: bệnh xuất nhiều hình thức khác Tỉ lệ tử vong thấp khoảng 1% Biểu như: - Xáo trộn tiêu hóa: sốt, ăn, đơi xuất triệu chứng thần kinh - Xáo trộn hô hấp: sốt, ăn, ho vài ngày, giảm tăng trưởng - Đôi cảm nhiễm thầm lặng mà không thấy xuất triệu chứng - Heo sinh sản: cảm nhiễm thầm lặng Đoi người ta ghi nhận sốt, ăn, hay ngáp 4-5 ngày.Triệu chứng thần kinh thấy Trên nái có mang thấy xáo trộn sinh sản như: - Sảy thai, 50% trường hợp thường thấy tháng đầu tháng sau - Đẻ heo chết Trong ổ có sống, có chết Thai khơ thai ngậm nước Sau mắc bệnh, heo hình thành miễn dịch khác vững kéo dài gần hai năm với hình thành kháng thể trung hịa, kháng thể kết hợp bổ thể Heo không truyền LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com kháng thể qua thai truyền kháng thể qua sữa đầu Heo kháng bệnh vòng tháng sau sinh Sau mắc bệnh 2-3 ngày, vật xuất triệu chứng ngứa khơng ngăn trở Để thỏa mãn ngứa, vật cào cắn tới tận da thịt Bệnh biến 12-48 vật chết 1.1.4 Chẩn đoán 1.1.4.1 Bệnh phẩm: Heo chết, thai sảy Nội quan hạch amygdale Để chẩn đoán huyết học lấy máu khoảng 10 ngày sau phát bệnh ( lấy 10 mẫu ) lấy mẫu theo bảng sau: Bảng 1.cách lấy mẫu chẩn đốn huyết học Tìm virus Thú ăn Đầu hay não thịt Hạch amygdale Tìm kháng thể Não Thú ăn cỏ Tủy sống vùng ngứa ( không định vị vị đầu) Não Heo Lấy 10 mẫu Hạch amugdale Nguyên heo bệnh Thai sảy 10 ngày sau phát triển bệnh lần ( vào lúc sớm lúc trễ ) 1.1.4.2 Phân lập giám định virus Nuôi cấy tế bào: virus giả dại mọc tế bào phôi gà con, tế bào thận heo, thỏ, dê, bê Có thể lần cấy chuyền phát thể vùi trung nhân Đặc điểm mọc tế bào phơi thai gà có ý nghĩa quan trọng chẩn đoán Kết nhận từ 24 đến 15 ngày Đâ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... dụng kỹ thuật này, kết này, tiếp tục gia tăng (Krumbholz ctv., 2003; Mumford ctv., 2004; Ozoemena ctv., 2004) Trong báo cáo sử dụng kỹ thuật nested PCR real- time PCR xác định tần số thực tế số lượng. .. âm tính (Jacobs và ctv, 1996; McCaw ctv, 1997) Những kỹ thuật khác phát triển để phát định lượng nhiễm PrV tiềm ẩn (Schang and Osorio, 1994; Denis ctv., 1997) Kỹ thuật này, dựa vào cấy chuyển... dụng kỹ thuật phân tử giúp ích với việc nâng cao độ nhạy độ xác (McFarlane ctv., 1986; Lokensgard ctv., 1991) Đặc biệt, kỹ thuật PCR dự đoán trước gia tăng đáng kể khả xác định tồn định lượng virus