PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM lá mía BẰNG kỹ THUẬT ELISA và bước đầu NGHIÊN cứu PHÁT HIỆN BỆNH cằn mía gốc BẰNG kỹ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  … NGUYỄN ANH KHOA PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp HCM, 8/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  … PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ANH KHOA Niên khóa: 2002 - 2006 Tp HCM, 8/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING SUGARCANE MOSAIC DISEASE BY ELISA AND THE FIRST STEP TO RESEARCH AND DETECT RATOON STUNTING DISEASE BY PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor BUI CACH TUYEN Student NGUYEN ANH KHOA Term: 2002- 2006 HCMC, 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  … KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng / 2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  … PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ANH KHOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng / 2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iii LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:  PGS TS Bùi Cách Tuyến tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn tất khóa luận tốt nghiệp  TS Bùi Minh Trí bảo cho nhiều kiến thức thời gian thực đề tài  ThS Nguyễn Văn Cƣờng anh chị Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh – trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực tập tốt nghiệp  ThS Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng Bến Cát giúp đỡ tơi q trình thu mẫu  Xin chân thành cảm ơn đến q Thầy Cơ mơn Cơng Nghệ Sinh Học nhiệt tình dạy nhƣ đóng góp ý kiến chân thành cho tơi suốt thời gian làm khóa luận  Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 ủng hộ, động viên giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Sinh viên thực Nguyễn Anh Khoa LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iv TÓM TẮT NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng năm 2006 “PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS TS Bùi Cách Tuyến Đề tài khảo sát nhiễm bệnh khảm mía (Sugarcane Mosaic) cằn mía gốc (Ratoon stunting disease) đƣợc thực Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng (TTNCMĐ) tỉnh Bình Dƣơng nông trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai Đây nghiên cứu nhằm góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm mía cằn mía gốc số giống mía sản xuất nhập nội vùng trồng mía Đặc biệt đề tài bƣớc nghiên cứu, phát bệnh cằn mía gốc vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli (Lxx) gây mía nƣớc ta kỹ thuật PCR Nghiên cứu góp phần quan trọng cơng tác tuyển chọn giống bệnh nhƣ công tác phịng chống kiểm sốt dịch bệnh có mía hiệu Kết đạt đƣợc - Các giống mía sản xuất nhập nội đƣợc khảo sát khơng bị nhiễm bệnh khảm mía thơng qua kết chẩn đoán ELISA - Phát đƣợc bệnh cằn mía gốc phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi nhuộm mơ mẫu Kết quả: tỉ lệ mơ khoẻ mạnh giống mía khảo sát TTNCMĐ 70,5%, nông trƣờng Thọ vực 75,18% - Xác định sơ nhân tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy vi khuẩn Lxx - Đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn Lxx hồn thiện quy trình phát vi khuẩn Lxx kỹ thuật PCR LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com v SUMMARY This is Nguyen Anh Khoa studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9th 2006 The thesis entiled “Surveying sugarcane mosaic disease by ELISA and the first step to research and detect ratoon stunting disease by PCR ” Surveying sugarcane mosaic disease and ratoon stunting disease (RSD) on some sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong and at Tho Vuc farm at Dong Nai That is basic to contribute statistics to situation of sugarcane mosaic disease at the areas Specially, the thesis is the first step to research and detect RSD caused by bacteria Leifsonia xyli subsp xyli (Lxx) on sugarcane in our country The researching is an important contribution to select pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane effectively The results of this research are as follows: - DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not found SCMV - Detecting Lxx by microscopy and STM stainning Results: 70,5% of phloem vessel not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and 75,18% phloem of vessel not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm - Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process - Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria detecting process by PCR LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vi MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT .iv MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ HÌNH CHỤP x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi Phần MỞ ĐẦU 1.1 Cơ sở tiến hành ý nghĩa nghiên cứu 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Giới hạn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc mía 2.1.1 Lịch sử phát .3 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Nguồn gốc phân bố .3 2.1.4 Nhân giống 2.1.5 Sản lƣợng 2.1.6 Chế biến sử dụng 2.2 Bệnh mía .5 2.3 Bệnh khảm mía .7 2.3.1 Nguồn gốc phân bố .7 2.3.2 Triệu chứng 2.3.3 Tác nhân gây bệnh .8 2.3.4 Các chủng virus gây bệnh khảm mía 2.3.5 Qui luật phát sinh phát triển bệnh .9 2.3.6 Tầm quan trọng kinh tế .9 2.3.7 Phòng trừ 10 2.3.8 Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm mía 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vii 2.3.8.1 Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh 10 2.3.8.2 Phƣơng pháp chẩn đốn dùng kính hiển vi 10 2.3.8.3 Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) 10 2.3.8.4 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 12 2.4 Bệnh cằn mía gốc 14 2.4.1 Nguồn gốc phân bố .14 2.4.2 Triệu chứng 14 2.4.2.1 Triệu chứng bên .14 2.4.2.2 Triệu chứng bên .15 2.4.3 Tác nhân gây bệnh 16 2.4.4 Quy luật phát sinh phát triển bệnh 16 2.4.5 Tầm quan trọng kinh tế 17 2.4.6 Kiểm soát bệnh 17 2.4.7 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc mía 17 2.4.7.1 Phƣơng pháp chẩn đốn trực tiếp kính hiển vi .17 2.4.7.2 Phƣơng pháp huyết học 17 2.4.7.3 Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng kí chủ) .19 2.4.7.4 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử 19 2.5 Tình hình nghiên cứu bệnh khảm mía bệnh cằn mía gốc 19 2.5.1 Trên giới 19 2.5.2 Trong nƣớc 20 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Nội dung nghiên cứu .22 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.3 Vật liệu nghiên cứu 22 3.3.1 Các giống mía nghiên cứu .22 3.3.2 Virus gây bệnh .22 3.3.3 Vi khuẩn gây bệnh 22 3.3.4 Hóa chất thí nghiệm 23 3.3.5 Thiết bị dụng cụ 23 3.4 Phƣơng pháp tiến hành 23 3.4.1 Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu 23 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 ruộng bị thiếu dinh dƣỡng hay bị sâu bệnh phá hoại Kết có ý nghĩa thực tiễn việc thống kê tình hình nhiễm bệnh RSD giống mía khảo sát 4.2.2 Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy vi khuẩn Lxx nhận dạng khuẩn lạc mơi trƣờng ni cấy Vi khuẩn Lxx vi khuẩn khó nuôi cấy môi trƣờng nhân tạo, khuẩn lạc vi khuẩn theo nghiên cứu phải đến khoảng 22 ngày ni cấy mơi trƣờng đặc trƣng hình thành đƣợc (Stevens Brumbley, 2003) Do thời gian tháng để nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn Lxx môi trƣờng nhân tạo ngắn kết thu đƣợc hạn chế, khơng có bào tử vi khuẩn Lxx hình thành Tuy nhiên, sau trình nghiên cứu thu đƣợc số kết định cụ thể nhƣ sau: - Quan sát theo dõi trình hình thành khuẩn lạc vi khuẩn Lxx môi trƣờng nuôi cấy hàng ngày kể từ lúc bắt đầu cấy đến khoảng 15 - 22 ngày (ủ 28OC) Theo sau cấy mẫu dịch chiết vào môi trƣờng nuôi cấy ngày vi khuẩn bắt đầu mọc môi trƣờng nuôi cấy Đặc biệt vào ngày đầu tiên, có xuất khuẩn lạc giống nhƣ khuẩn lạc vi khuẩn Lxx đƣợc Davis (1980) mơ tả ,đó khuẩn lạc nhỏ đƣờng kính từ 0,1 - 0,3 mm, khơng màu Tuy nhiên sau vài ngày nuôi cấy khuẩn lạc lớn dần lên có màu vàng (Hình 4.4) Thậm chí sau 15 - 20 ngày ni cấy cịn số vùng đĩa ni cấy có khuẩn lạc có kích thƣớc hình dạng tƣơng tự, nhiên phân lập môi trƣờng đĩa khác lại khơng phải Lxx mà loại vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng A B Hình 4.4 Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx môi trƣờng sau ngày nuôi cấy (A); khuẩn lạc sau phân lập (B) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 - Theo quan sát có khoảng loại vi khuẩn tồn mơi trƣờng ni cấy số lồi nấm Các loại phát triển môi trƣờng nuôi cấy đôi lúc nhanh (sau vài ngày) nhƣng có lúc chậm (nhiều đĩa ni cấy có vi khuẩn mọc lên với hình dạng kích thƣớc giống mơ tả, khuẩn lạc giữ ngun hình dạng kích thƣớc 20 ngày sau nuôi cấy) Tuy nhiên vi khuẩn Lxx, mà loại vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng Do hạn chế mặt tài liệu nghiên cứu nên môi trƣờng mà sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Lxx mơi trƣờng SC (Davis, 1980) có bổ sung thêm số thành phần theo Stevens Brumbley (2003) chƣa hoàn chỉnh Theo nghiên cứu Stevens Brumbley mơi trƣờng thích hợp thời gian hình thành bào tử ngắn (khoảng 15 ngày) vi khuẩn đƣợc nuôi môi trƣờng MSC (Teakle, 12992) có bổ sung thêm methionine (L E.Camargo ctv, 2004) Có tạp nhiễm thành phần mơi trƣờng ni cấy khơng thích hợp, kháng sinh acid amin khơng tinh nên khó tan dung dịch nƣớc Mặt khác dịch vi khuẩn đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy dịch không vô trùng nên có nhiều vi khuẩn hình thành mơi trƣờng giàu dinh dƣỡng cho vi khuẩn Lxx Do cần thiết lập quy trình chuẩn bị mẫu vô trùng dành cho nuôi cấy vi khuẩn có hiệu đƣợc 4.2.3 PCR phát vi khuẩn Lxx Song song với việc nuôi cấy vi khuẩn Lxx, tiến hành chạy PCR trực tiếp dịch chiết mía bị bệnh Sau nhiều lần tiến hành thí nghiệm, thay đổi quy trình sử dụng chất bổ sung khác vào phản ứng PCR, nhƣng kết PCR dựa vào cặp mồi Stevens Brumbley (2003) không đạt đƣợc kết mong đợi - Kết thí nghiệm 1: PCR theo protocol Stevens Brumbley (2003) Kết điện di: Khơng có sản phẩm gel điện di Nhận xét: Nguồn mẫu DNA đƣợc chuẩn bị theo quy trình Stevens Brumbley (2003) để chạy phản ứng PCR Primer đƣợc đặt cơng ty Biorad với trình tự đƣợc blast NCBI có kết cho bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn Lxx ngân hàng gen Tuy nhiên kết điện di khơng có ngun nhân quy trình thực chƣa tối ƣu DNA mẫu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 đƣa vào chƣa đƣợc biến tính tốt - Thí nghiệm 2: Thay đổi cách chuẩn bị mẫu Khảo sát hiệu hai phƣơng pháp chuẩn bị mẫu: Biến tính nhiệt li trích DNA vi khuẩn Lxx Chạy PCR theo thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt nhƣ thí nghiệm Mẫu đƣợc chuẩn bị đem đo OD, tính kết lƣợng DNA có mẫu thêm vào thành phần phản ứng PCR với nồng độ thƣờng dùng 0,5 μM Kết quả: khơng có băng DNA gel điện di Nhận xét: Do OD khơng có tác dụng trƣờng hợp dịch chiết nƣớc mía có chứa nhiều nhân tố ức chế nên lƣợng DNA đo đƣợc khơng xác với thực tế DNA mẫu vi khuẩn mẫu Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng PCR lên 1,5 lần không cho kết điều đồng nghĩa với việc tăng nhân tố ức chế phản ứng PCR Hút DNA từ lớp dịch biến tính đem chạy PCR Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng với nồng độ gấp 1,5 lần, lần Kết quả: khơng có băng DNA gel điện di Nhận xét: DNA sau biến tính nằm lớp dung dịch chúng tơi sử dụng lớp chạy PCR nhằm thu lƣợng DNA sạch, Tuy nhiên kết PCR khơng cho sản phẩm khuyếch đại biến tính Lxx Có lẽ q trình biến tính vi khuẩn cách gia nhiệt, thành tế bào vi khuẩn bị phá vỡ DNA vi khuẩn Lxx ngồi, nhiên q trình giải phóng enzym phân hủy làm hƣ hỏng DNA vốn tồn tế bào Do chúng tơi thử nghiệm ly trích DNA vi khuẩn từ dịch chiết nƣớc mía Thực lọc mẫu dịch vi khuẩn màng lọc 0,4 μm; chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR, tƣơng tự nhƣ quy trình Stevens Brumbley (2003) Nhận xét: Dùng màng lọc 0,4 μm lọc Lxx kiểm tra vi khuẩn có qua lỗ lọc khơng cách quan sát dƣới kính hiển vi Kết quan sát dƣới kính hiển vi kiểm tra khơng thấy có diện vi khuẩn Lxx dịch lọc Chúng tơi nhận định màng lọc 0,4 μm có kích thƣớc nhỏ nên vi khuẩn Lxx khơng qua đƣợc, có qua nhƣng khơng thể quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi Do chúng tơi tiếp tục thực cách biến tính mẫu nhƣ quy trình Stevens Brumbley đem OD sản phẩm, hút DNA mẫu lớp dịch biến tính để chạy PCR nhƣng khơng đạt đƣợc kết Kết luận: Không LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 thể loại bỏ đƣợc nhân tố ức chế phản ứng PCR trực tiếp dịch chiết nƣớc mía cách ly tâm đƣợc Li trích vi khuẩn Lxx dịch chiết nƣớc mía theo quy trình ly trích vi khuẩn thơng thƣờng Kết quả: Khơng có băng DNA vi khuẩn gel điện di sau li trích Nhận xét: Có thể lƣợng vi khuẩn Lxx dịch chiết nƣớc mía có nên thực li trích DNA khơng có kết - Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu sử dụng PVP PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía Kết quả: khơng có sản phẩm PCR đích Nhận xét: Tăng hàm lƣợng PVP vào phản ứng nhằm mục đích tăng cƣờng khả khử nhân tố ức chế phản ứng PCR, nhiên có lẽ nồng độ PVP cao quay lại ức chế phản ứng PCR chúng tơi khơng tăng nồng độ PVP thí nghiệm Do chúng tơi tiếp tục làm thí nghiệm theo hai hƣớng Thứ giữ nguyên cách chuẩn bị mẫu DNA cho PCR theo Stevens Brumbley (2003) thay đổi quy trình phản ứng Thứ hai thay đổi quy trình chuẩn bị mẫu DNA cho PCR - Thí nghiệm 4: Chuẩn bị mẫu theo quy trình Stevens Brumbley Khảo sát ảnh hƣởng thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt Kết thí nghiệm: Khơng có sản phẩm gel điện di Tóm lại, PCR hệ thống tƣơng thích thành phần hóa chất chu trình nhiệt Nhiều trƣờng hợp phản ứng PCR đƣợc thực từ dịch DNA mẫu ly trích với mồi chuyên biệt nhƣng khơng kết Vì PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía vấn đề khó thực nguồn mẫu ban đầu dịch chiết nƣớc mía khơng sạch, có chứa nhiều nhân tố ức chế phản ứng PCR Kết điện di sản phẩm sau lần chạy PCR mà băng DNA đích gel điện di nhiều nguyên nhân: - Có thể nguồn DNA mẫu đƣa vào phản ứng PCR không tinh Chúng tiến hành dịch chiết có nhiều chất lơ lửng, ức chế phản ứng PCR Nguồn mẫu dịch chiết mà dùng để chạy phản ứng PCR đƣợc thu từ có triệu chứng điển hình ngồi đồng ruộng, kết hợp với kiểm tra quan sát xuất vi khuẩn Lxx dịch chiết mía dƣới kính hiển vi dƣơng tính nhuộm STM Tuy nhiên xác định đƣợc lƣợng mẫu đƣa LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 vào có vi khuẩn đích nhƣng cịn q nhiều yếu tố khơng thể kiểm sốt đƣợc nhƣ chất ức chế phản ứng có dịch chiết nƣớc mía, lƣợng mẫu DNA thích hợp đƣa vào phản ứng - Có thể hóa chất mà chúng tơi sử dụng sau nhiều lần thực phản ứng làm đông lạnh rã đơng nhiều lần dẫn đến hoạt tính hóa chất đặc biệt Taq DNA polymerase primer - Mặt khác máy PCR khác cho kết khác Hiện TTPT có loại máy PCR máy có chế độ lên xuống nhiệt độ theo chu kỳ nhiệt khác (nhanh hay chậm) nguyên nhân loại trừ Tuy nhiên sau thực PCR ln phiên loại máy khơng có kết LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 Phần KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Các giống mía đƣợc khảo sát khơng bị nhiễm SCMV - Tỉ lệ mô không bị nhiễm bệnh cằn mía gốc giống mía khảo sát phƣơng pháp nhuộm STM TTNCMĐ 70,5%, nông trƣờng Thọ vực 75,18% - Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx chƣa thu đƣợc khuẩn lạc - Phát vi khuẩn Lxx dựa vào kỹ thuật PCR trực tiếp dịch chiết nƣớc mía chƣa đạt đƣợc kết mong muốn 5.2 Đề nghị - Tiến hành điều tra khảo sát tình hình bệnh khảm mía cằn mía gốc nhiều giống mía giai đoạn tăng trƣởng khác nhau, thực vùng mía lận cận để có nhìn tổng qt xác tình hình diễn biến bệnh khu vực Đặc biệt bệnh cằn mía gốc, cần tiến hành bố trí thí nghiệm nhiều giống khác đối chứng với giống khơng bị bệnh, để cuối có số thống kê xác tình hình mức độ gây hại bệnh nay, từ có khuyến cáo thích hợp việc phịng trừ kiểm sốt bệnh - Qua trình tìm hiểu bệnh với hỗ trợ kiến thức GS Stevens Brumbley (Australia), ngƣời có kinh nghiệm nghiên cứu lâu năm bệnh cằn mía gốc vi khuẩn Lxx, chúng tơi xin đề nghị quy trình ni cấy thu khuẩn lạc vi khuẩn Lxx, nhƣ quy trình PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía nhƣ sau thí nghiệm nhƣ sau:  Quy trình ni cấy vi khuẩn Lxx  Xác định triệu chứng đồng ruộng  Xác định nhiễm bệnh cằn mía gốc phƣơng pháp nhuộm STM  Thu dịch chiết (tiến hành vô trùng), kiểm tra diện Lxx dƣới kính hiển vi điện tử hay đối pha (Phụ lục 1)  Nuôi cấy vi khuẩn mơi trƣờng MCS có bổ sung thành phần theo Stevens Brumbley (2003) L E Camargo (2004) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42  Tăng sinh môi trƣờng lỏng S8 để thu sinh khối (Thành phần môi trƣờng nuôi cấy cho Bảng phụ lục 2)  Quy trình PCR phát vi khuẩn Lxx:  Nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn Lxx, thực li trích DNA vi khuẩn Lxx theo quy trình cho Phụ lục  Thực phản ứng PCR phát vi khuẩn Lxx  Sau ổn định quy trình tiến hành PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía dựa đối chứng dƣơng vi khuẩn Lxx nuôi cấy đƣợc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ nông nghiệp phát triển nơng thơn, 8/2006 Báo cáo tổng kết mía đường năm 2005-2006 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử Nhà xuất nông nghiệp Đỗ Ngọc Diệp, 2002 Nghiên cứu sâu đục thân hại mía biện pháp phịng trừ vùng Đơng Nam Bộ Luận án tiến sỹ, Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội Hà Đình Tuấn, 2004 Điều tra thành phần hại mía số giống nhập nội khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng vùng mía ngun liệu vùng Đơng Nam Bộ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Lê Song Dự, Nguyễn Thị Q Mùi, 1997 Cây mía Nhà xuất Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh Lê Lƣơng Tề Vũ Triệu Mân, 1999 Bệnh vi khuẩn virus hại trồng Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Nguyễn Huy Ƣớc, 1994 Kỹ thuật trồng mía Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Văn Tuất, 2002 Kỹ thuật chẩn đoán giám định bệnh hại trồng Nhà xuất Nông nghiệp 10 Phạm Văn Ty, 2001 Miễn dịch học Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội 11 Phan Gia Tân, 1990 Cây mía Tủ sách ĐH Nông Lâm 12 Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005 Điều tra phát bệnh khảm (Sugarcane Mosaic Virus) mía (Sacccharum spp) kỹ thuật ELISA bước đầu xây dựng kỹ thuật RT-PCR Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 13 Vũ Triệu Mân, 2003 Chẩn đoán bệnh hại thực vật Nhà xuất Nơng nghiệp TIẾNG NƢỚC NGỒI 14 Andreas Westphal and T Eril Mirkov, 2003 Need for improved detection of Ratoon stunting disease in Sugarcane in South Texas Phytopathology 7: p 133 136 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 15 Alfred Hercules, 2000 Aurum Total RNA Mini Kit Instruction Manual Bio-Rad Laboratories, p 26-27 16 Chemicon International, Inc - 28820 Single Oak Drive - Temecula, CA 92590, Introduction to Antibodies - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 17 Damann K.E, Jr 1988 Alkaline-induced metaxylem autofluorescence: a diagnostic symptom of ratoon stunting disease of sugarcane Phytopathology 78: p 233 - 236 18 Fegan, 1999 Sensitive and specific detection of Clavibacter xyli subsp xyli, causal agent of ratoo stunting disease os sugarcane , with a polymerase chain reaction-based assay Phytopathology, p 33 - 36 19 John R Crowther, 2001, The Elisa Guidebook – Volume 149, p 12 – 34 20 Gillaspie Jr., A.G Davis, M.J (1992): Ratoonstunting disease of sugarcane In Plant disease of International Importance Disease of sugar, Forestand Plantation Crops, vol4 (A.N Mukhopadhyay,J Kamar, H.S Chaube, U.S.Singh, eds) EnglewoodCliffs: New Jersey, Prentice Hall, p 41 – 61 21 G.P Rao, A Salem Saumtally, Phillippe Rott (2004) Sugarcane pathology Volume III: Bacteria and nematode diseases, p – 225 22 Hoy J W; Grisham M P and Damann K.E, 1999 Spread and increase of ratoon stunting disease and comparison of disease detection methods In Plant disease 23 Koike H, and Gillaspie A.G, 1989 Mosaic In: Diseases of Sugarcane: Major diseases, (Edited by C Recaud, B T Egan, A.G Gillaspie, C G Hughes) International Society of Sugarcane Technologist, p 301-322 24 P Taylor and Stevens Brumbley, 2003 Development of PCR –based markers for detection of Leifsonia xyli subsp xyli in fibrovascular fluid of infected sugarcane plants CSIRO publishing 25 Y Pan, 1998 A polymerase chain reaction protocol for detection of Clavibacter xyli subsp xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting Phytopathology: p – 26 Biowave vol.6 No.23 2004, tomato spotted wilt virus 27 G.A Dafalla, Plant Pathology Centre, Faculty of Agricultural Sciences,University of Gezira, Wad Medani, Sudan 28 Introduction to Microbiology: Virus Genomes, 2005 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com xii PHỤ LỤC Phụ lục 1: Qui trình thu dịch chiết nƣớc mía (Quy trình đƣợc đƣa Stevens Brumbley - 2006) Cắt hết thân bị nhiễm bệnh - Phụ thuộc vào chiều dài mắt mía mà cắt đoạn thân có chứa - mắt mía - Vì nồng độ vi khuẩn cao dƣới thân lấy phần thân sát gốc mía Rửa thân bàn chải lau cho khô giấy lau Rửa nƣớc Ngâm thân mía vào dung dịch thuốc tẩy 10 % 10 phút Rửa sach dƣới vòi nƣớc máy Khử trùng thân mía cồn 70 % đốt hết cồn dƣ Cắt đoạn thân mía khử trùng đoạn thân Dùng bơm đẩy khí từ đầu thu dịch chiết đầu eppendorf vô trùng Đổ dịch chiết vào môi trƣờng nuôi cấy MSC Kiểm tra môi trƣờng nuôi cấy hàng ngày LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com xiii Phụ lục 2: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli (Quy trình đƣợc đƣa Stevens Brumbley - 2006) MÔI TRƢỜNG MSC ( CHO 1L MÔI TRƢỜNG)  Thành phần hấp vô trùng:  Thành phần lọc Corn meal agar = 17 g Glucose = g Bacto-agar Cysteine = 0.5 g =4g Bacto-peptone = g Bovine serum albumin = g MgSO47H2O = 0.2 g H2O = 100 ml K2HPO4 (0.1 M ) = 13 ml Bovine hemin chloride = 30 ml KH2PO4 (0.1 M ) = 87 ml H2O = 800 ml Hòa tan thành phần hấp nƣớc chỉnh pH = 7,5 với N NaOH Hấp vô trùng Hòa tan thành phần lọc vào nƣớc thêm vào môi trƣờng đƣợc hấp chúng 55OC màng lọc vơ trùng 0.22 m MƠI TRƢỜNG LỎNG S8  Thành phần hấp vô trùng  Thành phần lọc: Bacto - Soytone = g Glucose = g Hemin chloride = 15 ml Cysteine = 0.5 g MgSO4 7H2O = 0.2 g Bovine serum albumin = g K2HPO4 = 0.35 g H2O = 100 ml KH2PO4 = 1.1 g H2O = 885 ml 1) Hòa tan tất thành phần nƣớc chỉnh pH 6,6 NaOH 5N 2) Hấp vô trùng trữ nhiệt độ phòng đến thêm thành phần lọc vô trùng vào LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com xiv Phụ lục 3: Quy trình li trích DNA vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli (Quy trình đƣợc đƣa Stevens Brumbley - 2006) Quy trình gồm 14 bƣớc nhƣ sau: 1) Ni Lxx 50 ml môi trƣờng lỏng S8 2) Thu tế bào (ly tâm 6000 vòng 10 phút) 3) Huyền phù tế bào ml lysis buffer (50 mM Tris, pH 8; mM EDTA) 4) Ủ 37OC 30 phút 5) Thêm 1/10 thể tích SDS vào để đạt nồng độ 1% SDS 6) Thêm proteinase K đến nồng độ cuối 50 μg/ml 7) Ủ 50 - 55OC 8) Ly trích với phenol trung tính: chloroform : isoamyl alcohol bề mặt đƣợc rửa 9) Thêm ethanol lạnh vào với thể tích tăng lần nhằm làm kết tủa acid nucleic 10) Thu DNA pipet, rửa cẩn thận cồn 70% 11) Xử lí Rnase 12) Tiếp tục thêm phenol : chloroform để kết tủa ethanol 13) Thu DNA pipet rửa cồn 70% 14) Huyền phù DNA TE LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com xv Phụ lục 4: Danh sách bệnh hại mía quan trọng phổ biến Tên Việt Nam Tên tiếng Anh Tác nhân gây hại I Bệnh nấm Bệnh sọc nâu Brown stripe Cohliobalus stenospilus (Drechs) Bênh mốc sƣơng Downy mildew Peronosclerospora sacchri (T Miyake) Bệnh đốm mắt én Eye spot Bipolaris sacchari shoemaker Bênh đốm trắng White speck Bipolaris sacchari T.C.Lo Bệnh cháy Leaf scorch Stagonospora sacchari Lo and Ling Bệnh dứa Pinapple disease Ceratosystis paradoxa Moreau Bệnh xoắn cổ Pokkah boeng Fusarium moniliform Sheldon Bệnh thối đỏ Red rod Colectotrichum falcatum Went Bệnh rỉ sắt đỏ Rust Puccinia melanopcephala H &P Syd 10 Bệnh rỉ sắt vàng Rust orange P kuehnii Butl 11 Bệnh than Smut Ustilago senaminea Syd 12 Bệnh đốm vàng Yellow spot Mycovellosiella koepket 13 Bệnh đốm vòng Ring spot Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan Gumming diease Xanthomonas camestris pv Vasculorum Leaf scald Xanthomonas alibilineans (Ashby 1929) Bệnh vi khuẩn 14 15 Bệnh gôm Bệnh thân đâm chồi Ratoon stunting 16 Bệnh cằn mía gốc 17 Sọc đỏ II Bệnh Phytoplasma 18 Bênh chồi cỏ Grassy shoot 19 Bệnh trắng White leaf disease Red stripe Leifsonia xyli subsp xyli (Davis et al, 1980) Pseudomonas rubrilineans (Lee et al) III Bệnh virus 20 Bênh sọc vàng Chlorotich streak Chƣa rõ 21 Bệnh Fiji Fiji disease Fiji disease virus 22 Bệnh khảm Mosaic Sugarcane mosaic virus 23 Bệnh đốm sọc Streak Sugarcane streak virus 24 Vàng gân Sugarcane yellow leaf virus LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com xvi Phụ lục 4: Một số hình ảnh q trình nghiên cứu bệnh khảm mía cằn mía gốc Hình PL1 Nhận dạng triệu chứng Hình PL2 Lá mía có triệu chứng khảm thu mẫu Hình PL3 Kết âm tính phân tích Hình PL4 Bệnh đốm vịng thƣờng ELISA xuất khảo sát Hình PL5 Quá trình điều tra thu mẫu Hình PL6 Gốc mía bị cằn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com xvii Hình PL7 Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên Hình PL8 Thân mía bị bệnh có đƣờng ngắn lại kính nhỏ thân bình thƣờng Hình PL9,10 Vết đổi màu bên thân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  … PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT... VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  … PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT... 2006 “PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT PCR? ?? Giáo viên hƣớng dẫn: PGS TS Bùi Cách Tuyến Đề tài khảo sát nhiễm bệnh khảm