Báo cáo thiết bị công nghệ và kỹ thuật công nghệ sinh học 1.2

PHÁT HIỆN VIRUS FERALINE PAULEUKOPENIA FPV GÂY BỆNH GIẢM BẠCH CẦU Ở MÈO BẰNG CÔNG NGHỆ nanoPCRTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.. GIỚI THIỆUGiảm bạch cầu ở mèo FP hay còn gọi là bệnh viêm ruột

PHÁT HIỆN VIRUS FERALINE PAULEUKOPENIA

(FPV) GÂY BỆNH GIẢM BẠCH CẦU Ở MÈO

BẰNG CÔNG NGHỆ nanoPCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

Thủ Đức, ngày 24 tháng 10 năm 2023

CHỦ ĐỀ

Sinh viên thực hiện:

TRẦN NGỌC BẢO CHÂU – 21126288 TRẦN THỊ THU HÀ – 21126321

TRANG THỊ DIỆU HIỀN – 21126339

MÔN HỌC: THIẾT BỊ & KỸ THUẬT CNSH

GVHD: TS HUỲNH VĂN BIẾT

ThS TRƯƠNG QUANG TOẢN

1

GIỚI THIỆU

I

NỘI DUNG

KẾT QUẢ THẢO LUẬN

2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II

III

IV

I GIỚI THIỆU

 Giảm bạch cầu ở mèo (FP) hay còn gọi là bệnh viêm ruột truyền nhiễm ở mèo là một bệnh nhiễm trùng cấp tính, rất dễ lây lan do virus giảm bạch cầu ở mèo virus Feline Panleukopenia (FPV) gây ra.

 FPV gây sốt nặng, nôn mửa và tiêu chảy ở động vật bị nhiễm bệnh, cũng như giảm lượng bạch cầu lớn.

 Gây bệnh cho mèo ở tất cả các lứa tuổi, tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết cao.

Hình: Tế bào virus Feline Panleukopenia (FPV) Hình: Hình ảnh mèo bị nhiễm virus FPV 3

Phương pháp nanoPCR

- NanoPCR là một phương pháp thêm các hạt nano vàng có đường kính nhỏ hơn 100 nm vào phản ứng PCR Trong quá trình thay đổi nhiệt độ phản ứng, các hạt như vậy sẽ hình thành chất lỏng nano, tăng cường độ dẫn nhiệt ,giảm thời gian phản ứng, tăng cường sự tiếp xúc động học của các thành phần chất phản ứng

- Các hạt nano vàng liên kết thuận nghịch với enzyme Taq ở nhiệt độ thấp Vật liệu này cũng có vai trò tương tự như protein liên kết chuỗi đơn (SSB), có thể hấp thụ có chọn lọc DNA chuỗi đơn

4

Quá trình virus xâm nhiễm vào cơ thể:

Quá trình virus xâm nhiễm

Ban đầu, virus nhân lên trong mô bạch huyết

hầu họng

FPV được thải ra từ tất

cả các chất bài tiết của

cơ thể trong thời gian

bệnh thường được tìm

thấy nhiều nhất trong

phân.

Virus lây lan qua hệ bạch huyết và máu đến nhiều mô Nhiễm trùng các mô bạch huyết dẫn đến hoại tử mô bạch

huyết

FPV xâm nhập vào các

tế bào bằng cách sử

dụng thụ thể transferrin

13 và sao chép trong

các tế bào ở pha S của

chu kỳ phân bào

5

1 Nguyên vật liệu:

 83 con mèo có triệu chứng lâm sàn điển hình nghi mắc giảm bạch cầu

 Vật tư, hóa chất: bao gồm hệ thống máy móc và vật tư phục vụ thực hiện phương pháp nanoPCR:

bộ kit MyTaqTM Mix, plasmid mini kit; bộ kit tách chiết DNA QIAamp của hãng Qiagen (Đức), máy PCR; máy điện di, máy chụp ảnh gel Bộ kit chẩn đoán nhanh Feline Parvovirus Antigen Test do công

ty Careside (Hàn Quốc) sản xuất.

6

2 Phương pháp nghiên cứu:

 Thu thập thông tin và quan sát triệu chứng lâm sàng:

 Mèo được mang đến khám và điều trị tại phòng khám thú y đều thu thập thông tin và lập hồ sơ

bệnh án.

 Quan sát triệu chứng lâm sàn của mèo mắc bệnh: thân nhiệt, phản xạ nôn, mức độ tiêu chảy, biểu

hiện mất nước.

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Chẩn đoán FPV bằng Kit chẩn đoán nhanh.

 Phương pháp nanoPCR:

 Tách chiết DNA virus:

Chủng FPV YBYJ-1 đã được phân lập và bảo quản trước bằng bộ chiết DNA QIAamp của hãng

Qiagen (Đức) và giữ ở -80oC.

 Thiết kế primer:

 Trình tự gen FPV VP2 được lấy từ ngân hàng gene và các đoạn mồi để khuếch đại gen VP2 có chiều

dài đầy đủ của FPV được xây dựng bằng phần mềm Oligo 7:VP2-F:

5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC-3’ và VP2-R: 5′- GTATACCATATAACAAACCTTC-3’, với độ dài

khuếch đại dự đoán là 1932 bp.

 Để xây dựng các plasmid mẫu dương tính tiêu chuẩn, các mồi đặc hiệu được thiết kế theo vùng bảo

tồn của gen VP2: VP2-U: TATATAGCACATCAGATACG-3′ và VP2-L:

5′-TGCATCAGGATCATATTCATT-3′, mức khuếch đại dự kiến chiều dài đoạn là 698 bp

Hình: Quy trình nanoPCR (a) DNA trộn với MPN; (b) chiếu đèn xanh lên MPN; (c) enzyme DNA polymerase được

thêm vào hỗn hợp; (d), (e), (f), (g) DNA theo cấp số nhân qua nhiều chu kỳ; (h), (i), (k), (l) nam châm được sử dụng tách MPN khỏi mẫu.; (m) tổng quan bên ngoài của máy nanoPCR

8

 Phương pháp nanoPCR:

III KẾT QUẢ:

9

1 Kết quả khi kiểm tra bằng Kit test nhanh:

Hình: Kết quả khi kiểm tra bằng Kit test nhanh (a) Dương tính với FPV; (b) Kết

quả nghi ngờ; (c) Âm tính với FPV.

2 Kết quả phản ứng nanoPCR:

10

Hình: Kết quả phản ứng nanoPCR Giếng 2 giếng 4: Mẫu test dương tính với FPV bằng Kit test nhanh; Giếng 5

-giếng 7: Mẫu nghi ngờ FPV bằng Kit test nhanh; Giếng 8 - -giếng 10: mẫu âm tính với FPV bằng Kit test nhanh; Giếng

11: Đối chứng dương (DNA từ vacxin); Giếng 12: Đối chứng âm (free water DNA).

11

IV THẢO LUẬN

Tỷ lệ lây nhiễm và tử vong cao của căn bệnh này, sự nguy hiểm và thiếu phương pháp điều trị hiệu quả, nên cần có một xét nghiệm nhanh chóng, nhạy cảm, đơn giản và chi phí thấp để phát hiện và phòng

ngừa bệnh FPV

Việc kết hợp các hạt nano vàng vào hệ thống phản ứng PCR truyền thống, dựa vào tính dẫn nhiệt tuyệt vời của các hạt vàng để phát triển phương pháp phát hiện FPV nanoPCR có độ nhạy cao và đặc hiệu.

Chi phí thấp, thao tác đơn giản, nhanh

chóng, không cần dụng cụ đặc biệt và phù hợp cho việc quảng bá trên quy mô lớn

Bất chấp việc sử dụng

rộng rãi các loại vắc

xin có bán trên thị

trường, nhiễm trùng

FPV vẫn tiếp tục giết

chết một số lượng lớn

ở mèo.

12

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Ikeda, Y.; Shinozuka, J.; Miyazawa, T.; Kurosawa, K.; Izumiya, Y.; Nishimura, Y.; Nakamura, K.; Cai, J.; Fujita, K.; Doi, K.; et al Apoptosis in feline

panleukopenia virus-infected lymphocytes J Virol 1998, 72, 6932–6936 [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed ][Green Version]

2 Johnson, R.H Feline panleucopaenia I Identification of a virus associated with the syndrome Res Vet Sci 1965, 6, 466–471 [Google Scholar] [

3 Steinel, A.; Munson, L.; Vuuren, M.V.; Truyen, U Genetic characterization of feline parvovirus sequences from various carnivores J Gen

Virol 2000, 81, 345–350 [Google Scholar] [CrossRef]

4 Garigliany, M.; Gilliaux, G.; Jolly, S.; Casanova, T.; Bayrou, C.; Gommeren, K.; Fett, T.; Mauroy, A.; Lévy, E.; Cassart, D.; et al Feline panleukopenia

virus in cerebral neurons of young and adult cats BMC Vet Res 2016, 12, 28 [Google Scholar] [CrossRef]

5 Reed, A.P.; Jones, E.V.; Miller, T.J Nucleotide sequence and genome organization of canine parvovirus J Virol 1988, 62, 266–276 [

6 Christensen, J.; Tattersall, P Parvovirus initiator protein NS1 and RPA coordinate replication fork progression in a reconstituted DNA replication

system J Virol 2002, 76, 6518–6531 [Google Scholar ] [CrossRef][Green Version]

7 Kariatsumari, T.; Horiuchi, M.; Hama, E.; Yaguchi, K.; Ishigurio, N.; Goto, H.; Shinagawa, M Construction and nucleotide sequence analysis of an

infectious DNA clone of the autonomous parvovirus, mink enteritis virus J Gen Virol 1991, 72 Pt 4, 867–875 [Google Scholar ] [CrossRef]

8 Govindasamy, L.; Hueffer, K.; Parrish, C.R.; Agbandje-McKenna, M Structures of host range-controlling regions of the capsids of canine and feline

parvoviruses and mutants J Virol 2003, 77, 12211–12221 [Google Scholar ] [CrossRef][Green Version]

9 Mani, B.; Baltzer, C.; Valle, N.; Almendral, J.M.; Kempf, C.; Ros, C Low pH-dependent endosomal processing of the incoming parvovirus minute virus

of mice virion leads to externalization of the VP1 N-terminal sequence (N-VP1), N-VP2 cleavage, and uncoating of the full-length genome J

Virol 2006, 80, 1015–1024 [Google Scholar ] [CrossRef][Green Version] 13

10 10.Mullis, K.; Faloona, F.; Scharf, S.; Saiki, R.; Horn, G.; Erlich, H Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain

reaction Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, 51 Pt 1, 263–273 [Google Scholar] [CrossRef ][Green Version]

11 Green, M.R.; Sambrook, J Nested Polymerase Chain Reaction (PCR) Cold Spring Harb Protoc 2019, 2019, 436–456 [Google Scholar] [

12 Wang, S.; Yang, F.; Li, D.; Qin, J.; Hou, W.; Jiang, L.; Kong, M.; Wu, Y.; Zhang, Y.; Zhao, F.; et al Clinical application of a multiplex genetic

pathogen detection system remaps the aetiology of diarrhoeal infections in Shanghai Gut Pathog 2018, 10, 37 [Google Scholar] [CrossRef]

13 Harshitha, R.; Arunraj, D.R Real-time quantitative PCR: A tool for absolute and relative quantification Biochem Mol Biol Educ 2021, 49, 800–

812 [Google Scholar] [CrossRef]

14 Liu, Y.; Wu, H.; Zhou, Q.; Song, Q.; Rui, J.; Zou, B.; Zhou, G Digital quantification of gene methylation in stool DNA by emulsion-PCR coupled

with hydrogel immobilized bead-array Biosens Bioelectron 2017, 92, 596–601 [Google Scholar] [CrossRef]

15 Wanzhe, Y.; Jianuan, L.; Peng, L.; Jiguo, S.; Ligong, C.; Juxiang, L Development of a nano-particle-assisted PCR assay for detection of duck

tembusu virus Lett Appl Microbiol 2016, 62, 63–67 [Google Scholar ] [CrossRef][Green Version]

16 Hsieh, M.J.; Yang, W.C A Field-Deployable Insulated Isothermal PCR (iiPCR) for the Global Surveillance of Toxoplasma gondii Infection in

Cetaceans Animals 2022, 12, 506 [Google Scholar] [CrossRef]

17 Song, S.; Liu, Z.; Abubaker, M.A.; Ding, L.; Zhang, J.; Yang, S.; Fan, Z Antibacterial polyvinyl alcohol/bacterial cellulose/nano-silver hydrogels

that effectively promote wound healing Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2021, 126, 112171 [Google Scholar ] [CrossRef] [PubMed]

18 Liu, M.; Liu, T.; Chen, X.; Yang, J.; Deng, J.; He, W.; Zhang, X.; Lei, Q.; Hu, X.; Luo, G.; et al Nano-silver-incorporated biomimetic

polydopamine coating on a thermoplastic polyurethane porous nanocomposite as an efficient antibacterial wound dressing J

Nanobiotechnol 2018, 16, 89 [Google Scholar] [CrossRef]

14

19 Abram, S.L.; Fromm, K.M Handling (Nano)Silver as Antimicrobial Agent: Therapeutic Window, Dissolution Dynamics, Detection Methods and

Molecular Interactions Chem Eur J 2020, 26, 10948–10971 [Google Scholar ] [CrossRef] [PubMed]

20 Kumar, A.; Hosseindoust, A.; Kim, M.; Kim, K.; Choi, Y.; Lee, S.; Lee, S.; Lee, J.; Cho, H.; Kang, W.S.; et al Nano-sized Zinc in Broiler

Chickens: Effects on Growth Performance, Zinc Concentration in Organs, and Intestinal Morphology J Poult Sci 2021, 58, 21–29 [

21 Swain, P.S.; Rao, S.B.N.; Rajendran, D.; Dominic, G.; Selvaraju, S Nano zinc, an alternative to conventional zinc as animal feed supplement: A

review Anim Nutr (Zhongguo Xu Mu Shou Yi Xue Hui) 2016, 2, 134–141 [Google Scholar] [CrossRef]

22 Li, M.; Lin, Y.C.; Wu, C.C.; Liu, H.S Enhancing the efficiency of a PCR using gold nanoparticles Nucleic Acids Res 2005, 33, e184 [

23 Rudramurthy, G.R.; Swamy, M.K Potential applications of engineered nanoparticles in medicine and biology: An update JBIC J Biol Inorg

Chem 2018, 23, 1185–1204 [Google Scholar] [CrossRef]

24 Li, H.; Rothberg, L Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles Proc Natl

Acad Sci USA 2004, 101, 14036–14039 [Google Scholar ] [CrossRef] [PubMed]

15

THANK YOU

16