Báo cáo thiết bị công nghệ và kỹ thuật công nghệ sinh học 2.2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌCBÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THẬT CNSH PHÁT HIỆN NHANH SALMONELLA SPP., SALMONELLA ENTERICA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

THIẾT BỊ VÀ KỸ THẬT CNSH

PHÁT HIỆN NHANH SALMONELLA SPP., SALMONELLA

ENTERICA HIỆN DIỆN TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ

THUẬT PCR ĐA MỒI (MULTIPLEX PCR)

TP.THỦ ĐỨC, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

THIẾT BỊ VÀ KỸ THẬT CNSH

PHÁT HIỆN NHANH SALMONELLA SPP., SALMONELLA

ENTERICA HIỆN DIỆN TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ

THUẬT PCR ĐA MỒI (MULTIPLEX PCR)

ĐỖ TẤN THÀNH

LÊ HOÀNG PHÚC

TP THỦ ĐỨC, 10/2023

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn bộ quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, thầy cô đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên phụ trách môn học- Thầy Huỳnh Văn Biết, người đã nhiệt tình hướng dẫn em thực hiện báo cáo này

TÓM TẮT

Việc phát hiện và định danh vi sinh vật trong thực phẩm một cách nhanh chóng để xác định các nguyên nhân và ngăn ngừa một cách có hiệu quả các tác hại từ ngộ độc thực phẩm Trong số các vi khuẩn gây bệnh truyền qua thực phẩm thì không thể không nói đến

Salmonella Tuy nhiên, các phương pháp nuôi cấy hiện nay chủ yếu là truyền thống, tốn

nhiều thời gian, phức tạp và độ đặc hiệu chưa cao Kỹ thuật multiplex PCR ứng dụng nhanh chóng và đơn giản, có độ nhạy cao Đồng thời khuếch đại hai hay nhiều chuỗi gen trong phản ứng tương tự nhằm phát hiện một loạt các tác nhân gây bệnh chỉ trong một phép phân tích Kỹ thuật PCR đa mồi để khuếch đại các gen mục tiêu invA và spvC đã được phát triển thành công Trong tổng số 260 mẫu thực phẩm được thu thập từ các chợ khác nhau để kiểm

tra về sự hiện diện của Salmonella Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm phát triển qui trình PCR sử dụng hai cặp mồi chuyên biệt để phát hiện Salmonella enteritica trong thục phẩm Từ khóa: gen invA, gen spvC, PCR đa thành phần, Salmonella enteritica, multiplex PCR,

ngộ độc thực phẩm

1.2.Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đặc điểm hình thái Salmonella 3

2.2 Phân loại Salmonella 3

2.3 Cụm gen inv và spv 4

2.4 Các phương pháp chuẩn đoán 5

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 7

3.1 Vật liệu 7

3.2 Phương pháp nghiên cứu 7

3.2.1 Chuẩn bị mẫu và tăng sinh 7

3.2.2 Thiết kế mồi PCR từ vi khuẩn Salmonella 8

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ DỰ KIẾN 12

4.1 Kết quả khuếch đại gen mục tiêu bằng phản ứng PCR dự kiến 12

4.1.1.Kết quả PCR được tiến hành thử trên web Primer- BLAST 12

4.1.2 Kết quả sản phẩm PCR 13

4.2 Sử dụng PCR đa mồi phát hiện vi khuẩn trong thực phẩm 15

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN 17

TÀI LIỆU THAM KHẢO 18

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR : Polymerase Chain Reaction dNTP: deoxyribonucleotide triphosphate RV : Rappaport Vassiliadis

BPW : Buffered Peptone Water XLD : Xylose Lysine Deoxycholate HE : Hektoen Enteric

BHI : Brain Heart Infusion TSA : Tryptone Soya Agar BSA : Bovine Serum Albumin KIA : Kligler iron agar

TSI : Triple sugar iron agar

Hình 2.4.Vung spv được tìm thấy trên các plasmid ở chủng phân loại 1 5

Hình 3.1 Chu trình PCR của một chu kì 9

Hình 3.2 Multiplex PCR 10

Hình 4.1: Kết quả PCR gen invA được tiến hành trên Primer-BLAST 12

Hình 4.2: Kết quả PCr gen invA được tiến hành trên Primer-BLAST 12

Hình 4.3 Kết quả PCR dự kiến với cặp mồi invA 13

Hình 4.2 Kết quả PCR dự kiến với cặp mồi spvC 14

Hình 4.3 Kết quả PCR dự kiến với 2 cặp mồi invA và spvC 15

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học Nhiều kết quả nghiên cứu đưa ra cảnh báo về tình trạng mất an toàn vệ sinh thực phẩm đặc biệt là tình trạng nhiễm vi khuẩn trong thực phẩm tươi sống Trong các

vi khuẩn gây bệnh truyền qua thực phẩm thì không thể không nói đến Salmonella, nhiễm khuẩn Salmonella enterica là mối lo ngại lớn về sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới

Chủ yếu thông qua việc ăn phải thực phẩm hoặc thức ăn bị ô nhiễm, chúng gây ra bệnh đường tiêu hóa tự giới hạn ở nhiều vật chủ là động vật có vú Theo ước tính có 75% trường

hợp ở người mắc phải bệnh do Salmonella do ăn phải thức ăn bị nhiễm khuẩn bao gồm

thịt bò, thịt heo, thịt gia cầm và trứng

Hình 1.1 Hình ảnh 3D của vi khuẩn Salmonella spp

Đánh giá chất lượng và an toàn thực phẩm là những tiêu chuẩn rất quan trọng trong bảo vệ sức khỏe con người để tránh tình trạng ngộ độc thực phẩm, ứng dụng các phương pháp phát hiện nhanh và chính xác các sản phẩm đã ô nhiễm là một trong những việc cần

thiết Vì vậy, hiện nay đã có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện vi khuẩn

Salmonella Phương pháp nuôi cấy truyền thống và những phương pháp kiểm tra rất nhạy

và nhanh sự hiện diện của các dòng vi khuẩn mà không cần đến giai đoạn nuôi cấy tách dòng

Nhiều xét nghiệm PCR thời gian thực đã được phát triển để phát hiện nhanh vi khuẩn

salmonellae trong thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi có khả năng bị ô nhiễm Kỹ thuật

phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction PCR) là một kỹ thuật dùng để khuếch đại các đoạn DNA chuyên biệt bằng cách sử dụng các cặp mồi chuyên biệt

PCR có thể được sử dụng để phát hiện một lượng rất nhỏ của DNA mục tiêu đã bị pha lẫn trong các mẫu DNA khác nhau

1.2.Mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella spp, S

enterica với kiểu huyết thanh S enteritidis và S typhimurium trong thực phẩm

1.3 Nội dung thực hiện: phát hiện nhanh sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella spp, S

enterica với kiểu huyết thanh S enteritidis và S typhimurium trong 260 mẫu thực phẩm

lấy từ chợ địa phương bằng kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR)

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm hình thái Salmonella

Salmonella enterica thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là trực

khuẩn Gram âm, hình que, kích thước trung bình 3,0 x 0,5 um, có nhiều lông xung quanh thân Là vi khuẩn sống kỵ khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, có thể mọc trên 1 số môi trường có chất ức chế chọn lọc được dùng trong phân lập vi khuẩn này từ phân, phần lớn gây bệnh ở người và động vật Hầu hết các

loài Salmonella có thể Hydro sulfide Salmonella không lên men lactose (trừ Salmonella arizona) và sucrose nhưng lên men được dulcitol, mannitol và glucose

Hình 2.1 Salmonella trên thạch McConkey Hình 2.2 Salmonella Sp trên thạch XLD 2.2 Phân loại Salmonella

Salmonella được chia làm 2 loại S enterica và S bongori Phân loại khoa học Salmonella được xếp vào :

Giống: Salmonella lignieres 1900 Loài : S enterica và S bongori

Phân loại theo cấu trúc kháng nguyên: Chia thành các nhóm, các loài và các kiểu huyết thanh

Lúc đầu, các Salmonella được đặt theo hội chứng gây ra như S.typhi và các S paratyphi A, B, C(bệnh thương hàn) hoặc theo vật chủ như S.typhimurium gây bệnh ở

chuột

Sau này, người ta thấy 1 loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể

phân lập nhiều Vì vậy, người ta gọi các loài mới phát hiện theo tên địa phương ở đó nó

được phân lập như S teheran, S congo, S London Đến nay người ta phát hiện được 2500 kiểu huyết thanh Salmonella

2.3 Cụm gen inv và spv

Salmonella mang cụm gen inv (invasion) hệ thống gen SPI-1 (Salmonella

pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella nhưng không hiện diện ở

Escherichia coli và các vi sinh vật khác InvA là một bản gen luôn có mặt trong hệ thống

gen inv Mã hóa cho chuỗi polypeptide chứa 686 acid amin,là gen đầu tiên của một operon bao gồm ít nhất hai gen xâm lấn bổ sung Gen invA có vai trò trong việc xâm nhiễm vào

tế bào biểu mô được chứng minh có mặt rộng rãi trong 245 chủng Salmonella spp khác

nhau được phân lập từ người, gà, nước thải Giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu tiến trình gây bệnh Do vậy, gen invA thường được

chọn là gen đích trong việc phát hiện Salmonella spp

Hình 2.3 Vùng gen inv-spa

Locus spv có liên quan chặt chẽ với các chủng gây bệnh nhiễm khuẩn huyết không thương hàn Vùng spv chứa ba gen cần thiết cho kiểu hình độc: điều hòa phiên mã spvR và hai

gen cấu trúc spvB và spvC SpvB và SpvC được chuyển vào tế bào chủ nhờ hệ thống bài

tiết đảo loại 2 loại 3 gây bệnh Salmonella Cụm gen spv (Salmonella plasmid virulence)

chứa 5 gen spvRABCD, các gen spv biểu hiện khi Salmonella đã xâm nhiễm vào bên trong tế bào vật chủ, làm tăng tính độc của Salmonella, giúp vi khuẩn xâm nhiễm và tồn tại bên

ngoài ruột như gan, tụy

Hình 2.4 Vùng spv được tìm thấy trên các plasmid ở chủng phân loại 1

Gen spvR được phiên mã tách biệt với gen spvABCD SpvR cho thấy câu trúc chung của protein SpvB với các miền đầu N và C được tách bằng một chuỗi dư lượng proline(P) EAE biểu thị dư lượng tại vị trí hoạt động cho hoạt động ribosy hoá ADP

2.4 Các phương pháp chuẩn đoán

Multiplex PCR là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằm khuếch đại nhiều trình tự ADN chỉ trong một phản ứng PCR Trong quá trình phân tích PCR đa mồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng Như một phương pháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phương pháp này giúp rút ngắn thời gian thực hiện mà lại không ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu

Mẫu thực phẩm trong thí nghiệm sử dụng tổng cộng 260 mẫu bao gồm có 40 mẫu thịt heo, 60 mẫu thịt gà, 40 mẫu thịt bò, 20 mẫu lòng trắng , đỏ trứng gà, 20 mẫu vỏ trứng gà, 20 mẫu nem chua, 20 mẫu chả lụa, 19 mẫu ba khía, 10 mẫu da heo và 20 mẫu sò huyết được thu mua ở chợ vào các buổi trong ngày

Các nguồn vi sinh được lấy từ Viện Công nghệ sinh học ở Đại học Cần Thơ gồm

S.enteritidis, Salmonella spp, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và E.coli

3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Chuẩn bị mẫu và tăng sinh

Mẫu được tăng sinh và thu sinh khối bằng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh theo tiêu chuẩn Việt nam (TCVN 4829:2005)

Đồng nhất và tăng sinh trong môi trường BPW , ủ 37oC 24 giờ

Cấy 0,1ml dịch tăng sinh vào môi trường chọn lọc RV, ủ ở 42oC 24 giờ

Phân lập khuẩn lạc đơn trên 2 môi trường XLD và HE

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella cấy sang bHI và TSA ủ qua đêm

Thử nghiệm sinh hóa : KIA/TSI , Urea, Indol, VP

Phản ứng sinh hóa để xác định chủng vi khuẩn Salmonella spp, tiến hành tăng sinh mật độ,

chuyển dịch cấy tế bào vào môi trường BPW qua bình tam giác chứa 50ml có chứa 9ml môi trường RV nuôi ở 42oC trong 15 giờ

Khi mẫu được tăng sinh sẽ được ly trích DNA để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn

Salmonella bằng kĩ thuật PCR

3.2.2 Thiết kế mồi PCR từ vi khuẩn Salmonella

Đoạn mồi được thiết kế cho Salmonella spp và S.enterica dựa trên trình tự gen invA

và gen spvC Trình tự của 2 gen invA và spvC có sẵn từ ngân hàng gen Đoạn mồi được thiết kế trên phần mềm DNAMAN 4.0

Bảng 3.1 Trình tự của các mồi dùng để phat hiện gen invA và spvC

InvA For 5' TGGCATTATCGATCAGTACCAG 3’ 600bp InvA Rev 5' AACAGCTGCGTCATGATATTCC 3’

spvC For 5' TCCCTCCTTTGAATATTGTAGCTG3’ 400bp SpvC Rev 5’ GGGCTTGTTGAACGACCTTC 3’

3.2.3 Ly trích DNA

Bước 1:Cho 2ml dịch khuẩn được tăng sinh, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút Loại bỏ dịch nổi, hòa tan 1ml TE ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 2:Tiếp tục bỏ phần dịch nổi và hòa tan 350µl TE với 30ml lysozyme lắc nhẹ Cho 40µl SDS 10% lắc đều và cho thêm 40ul proteinase K lắc đều và ủ 30oC trong 3 giờ Sau 3 giờ ủ thêm 800ul phenol (pH=7) ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 3: Hút phần dịch phía trên cho vào ống tuýp 1.5ml có sẵn 150 µl TE Thêm vào một lượng tương đương 700µl Phenol-Chloroform-isoamyl Alcohol (25:24:1) lắc cho đến khi dung dịch có màu trắng đục, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 4: Sau khi ly tâm, chuyển phần dịch phía trên sang tuýp nhựa 1,5 ml mới có chứa sằn 75 ul Natri axetat (3M, pH 7,2), lắc đếu Thêm vào 1 ml ethanol 96%, lắc đều, đặt trong nước đá 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, hút bỏ phần dịch phía trên, giữ lại phần tủa

Bước 5: Thêm ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, đổ bỏ dung dịch, làm khô phần tủa và hòa tan DNA với 30 µl nước cất vô trùng, bảo quản ở -20 °C

Phản ứng khuếch đại được tiến hành ở 95oC trong 5 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ với các bước như sau: biến tính ở 95oC trong 30 giây, bắt cặp mồi vào khuôn ở 60oC trong 30 giây, kéo dài ở 72oC trong 1 phút Cuối cùng phản ứng được duy trì 72oC trong 10 phút

Hình 3.1 Chu trình PCR của một chu kì

3.2.4.2 Phản ứng PCR đa mồi

Với PCR đa mồi (invA và spvC) được sử dụng trong cùng 1 phản ứng PCR và sử dụng các thành phần như ở PCR với một cặp mồi với các thành phần sau (Bảng 3.3)

Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR đa mồi gồm biến tính ở 94oC trong 2 phút, tiếp theo tổng số 35 chu kỳ gồm giai đoạn biến tính ở 94oC trong 45s , gắn mồi ở 60oC trong 1 phút và kéo dài ở 72oC trong 90s, sau cùng phản ứng được duy trì 72oC trong 7phút

Hình 3.2 Multiplex PCR

3.2.5 Điện di

Sau 35 chu kì thu được các bản sao chép với số lượng 235 lượng bản sao DNA được khuếch đại bằng PCR được đem đi điện di trên gel agarose và được chụp lại bằng Biorad UV

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ DỰ KIẾN

4.1 Kết quả khuếch đại gen mục tiêu bằng phản ứng PCR dự kiến 4.1.1.Kết quả PCR được tiến hành thử trên web Primer- BLAST

Hình 4.1 Kết quả PCR gen spvC được tiến hành trên Primer-BLAST

Thông số ở mục Self complementarity có kết quả xấp xỉ bằng 5 cụ thể là 6.00 và 4.00 chứng tỏ khả năng xuất hiện dimer thấp Bên cạnh đó kết quả còn hiển thị có thể nhận biết

được Salmonella

Hình 4.2 Kết quả PCR gen invA được tiến hành trên Primer-BLAST

Thông số ở mục Self complementarity có kết quả lớn hơn 5 cụ thể là 8.00 và 6.00 chứng tỏ khả năng xuất hiện dimer cao Bên cạnh đó kết quả còn hiển thị có thể nhận biết được

Salmonella

4.1.2 Kết quả sản phẩm PCR

Dự kiến khuếch đại thành công gen mục tiêu invA, spvC có độ dài lần lượt là 600bp,

400bp từ các dòng vi khuẩn Salmonella Sản phẩm PCR được kiểm tra, phân tích bằng

phương pháp điện trên gel agarose 1.5% trong dung dịch đệm TBE 1X

Đánh giá sự chuyên biệt của mồi invA, người ta khảo sát trên các dòng vi khuẩn như

Salmonella spp , S typhimurium, S.enteritidis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và E coli Theo kết quả sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di (Hình 4.3)

cho thấy kết quả dự kiến khuếch đại được gen mục tiêu có độ dài 600bp từ các dòng vi

khuẩn Salmonella nhưng riêng các dòng khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và E coli lại không có sản phẩm Điều đó thấy được rằng cặp mồi invA có tính chuyên biệt cao đối với dòng vi khuẩn Salmonella spp

Hình 4.3 Kết quả PCR dự kiên với cặp mồi invA Giếng 1: thang chuẩn 100bp

(Fermentas); giếng 2-3:B subtilis; giếng 4: đối chứng âm; giếng 5-6: S aureus; giếng 7-8: E.coli; giếng 9: S typhimurium; giếng 10: S enteritidis; giếng 11-12: Salmonella

spp

600bp