Báo cáo thực hành sinh hóa

Giải thích kết quả:- Ống nghiệm 3.1.1: Vì glycine là một amino axit khi tác dụngvới thuốc thử ninhydrin thì lượng NH3 được giải phóng ra từaxit amin phản ứng với ninhydrin có trong ống t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP HỒ CHÍ MINH KHOA

SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HÓA

+ Ống 1: Cho 1 mL dung dịch glycine 0,02%.

+ Ống 2: Cho 1 mL dung dịch protein trứng đã pha loãng

- Thêm vào mỗi ống 5 giọt thuốc thử ninhydrin 0.1%

- Đun nóng 2 ống nghiệm bằng đèn cồn cho đến khi 2 ống đổi màu. Kết quả:

Ống nghiệm Kết quả quan sát

Ống nghiệm 3.1.1 Màu xanh tím nhạt

Ống nghiệm 3.1.2 Màu xanh tím đậm

Giải thích kết quả:

- Ống nghiệm 3.1.1: Vì glycine là một amino axit khi tác dụngvới thuốc thử ninhydrin thì lượng NH3 được giải phóng ra từaxit amin phản ứng với ninhydrin có trong ống tạo thànhdung dịch có màu xanh tím nhạt trong

- Ống nghiệm 3.1.2: Vì lòng trắng trứng là protein để thực hiệnđược thí nghiệm thì phải loại bỏ protein ra khỏi lòng trắngtrứng bằng cách pha loãng 20 lần và lọc sẽ thu được dung dịchkhông lẫn protein Dung dịch tác dụng với ninhyrin tạo màuxanh tím đậm vì có axit amin và lượng NH giải phóng từ trong3 mẫu nhiều

Thí nghiệm 2 Định tính protein bằng phản ứng biuret

Tiến trình:

- Lấy 2 ống nghiệm đánh số 3.2.1 và 3.2.2

+ Ống 3.2.1: Cho 0,1g tinh thể urea Đun nóng Để nguội. + Ống 3.2.2: Cho 1 mL dung dịch protein trứng đã pha loãng

- Thêm vào mỗi ống 1 mL dung dịch NaOH 10% và 1

giọt dung dịch CuSO4 1% rồi lắc đều

Kết quả:

Ống nghiệm Kết quả quan sátỐng nghiệm 3.2.1 Màu tím hồng

- Màu của phản ứng phụ thuộc vào lượng đồng và số lượngcác liên kết peptide trong phân tử chất tham gia phản ứng.+ Ống nghiệm 3.2.1: Phản ứng biuret được tạo thành từ

urea trong điều kiện nhiệt độ cao và gặp ion Cu trongmôi trường kiềm mạnh Dung dịch có màu tím hồng.

+ Ống nghiệm 3.2.2: Dung dịch protein trứng trong môitrường kiềm mạnh có mặt Cu nên chuyển sang tím.2+

Thí nghiệm 3 Tìm điểm đẳng điện của protein bằng phương pháp tạo pH khác nhau

Tiến trình:

- Lấy 3 ống nghiệm đánh số 3.3.1, 3.3.2 và 3.3.3

+ Ống 3.3.1: 0,34 mL dd Na2HPO4 0,2M + 0,66 mL dd C6H8O7 (pH = 3,7)

+ Ống 3.3.2: 0,48 mL dd Na2HPO4 0,2M + 0,52 mL dd C6H8O7 (pH = 4,7)

+ Ống 3.3.3: 0,66 mL dd Na2HPO4 0,2M + 0,34 mL dd C6H8O7 (pH = 5,7)

- Lắc đều 3 ống nghiệm

- Thêm vào mỗi ống 1 mL dd protein trứng, lắc nhẹ

- Thêm vào mỗi ống 1 mL cồn 98 độ, lắc đều, để yên 5 phút.Kết quả:

Quan sát, so sánh và xác định pHi của albumin trứng:

- Lượng kết tủa giảm dần: 3.3.2, 3.3.1, 3.3.3

- pHi của albumin trứng là 4,6

Giải thích kết quả:

- Ống nghiệm 3.3.2 kết tủa nhiều nhất vì độ pH = 4,7 của môitrường xấp xỉ với độ pHi = 4,6 của albumin trứng nên tại đó tạo nêntrạng thái cân bằng điện tích Vì vậy tại pH = 4,7 các amino acid vàprotein sẽ không di động trong điện trường đó Các phân tửprotein dễ kết tủa với nhau tạo nên kết tủa protein nhiều hơn so với

2 ống còn lại

- Ống nghiệm 3.3.1 kết tủa nhiều hơn ống nghiệm 3.3.3 vì khi độ

pH < 7, các cation H sẽ ngăn cản sự phân li của các nhóm cacboxyl+nên độ pH = 3,7 của môi trường trong ống nghiệm 3 là độ pH củamôi trường axit mạnh sẽ tạo thành kết tủa protein nhiều hơn so với

độ pH = 5,7 của môi trường axit yếu

Ống nghiệm Kết quả quan sát

Thí nghiệm 4 Kết tủa protein bằng muối trung tính (NH4)2SO4 và bằng cách đun sôi trong các môi trường khác nhau

Tiến trình:

a Kết tủa thuận nghịch protein:

- Lấy 2 ống nghiệm đánh số 3.4.1a và 3.4.2a , cho 1mL

lòng trắng trứng nguyên chất vào cả 2 ống

+ Ống 3.4.1a: Thêm vào 1 mL dd (NH4)2SO4 bão hòa, lắc nhẹ.+ Ống 3.4.2a : Thêm từ từ tinh thể (NH4)2SO4 vào, lắc đến khi ddbão hòa

- Sau đó thêm nước cất vào 2/3 mỗi ống, khuấy nhẹ từ từđến khi kết tủa tan thành dd protein trong suốt

Kết quả:

Khi chưa thêm nước cất

=>> Khối lượng kết tủa trong ống 3.4.2a nhiều hơn khối lượng kết tủa trong ống 3.4.1a

Ống nghiệm 3.4.1a Tạo kết tủa thể vẩn trắng đục

globulinỐng nghiệm 3.4.2a Tạo kết tủa trắng đặc như sữa

chua

Sau khi đã thêm nước cất và khuấy nhẹ

Giải thích kết quả:

- Các anion và cation của dung dịch muối trung tính có tác dụngloại bỏ vỏ hydrate hóa của phân tử protein, tác dụng tương hỗvới các nhóm điện tích trái dấu làm trung hòa điện tích, tạo nênprotein kết tủa Su khi thêm nước cất vào thì nước cất sẽ loạimuối ra khỏi dd làm dd loãng ra trở lại thành dd protein trứng. Tiến trình:

b Kết tủa không thuận nghịch protein:

Ống nghiệm 3.4.1a Tủa protein tan hoàn toàn thành dd

protein trong suốtỐng nghiệm 3.4.2a Tạo thành dd protein trong suốt

Kết quả:

Ống nghiệm 3.4.1b Tạo kết tủa trắng

Ống nghiệm 3.4.2b Tạo kết tủa trắng

Ống nghiệm 3.4.3b Biến tính Dd trong suốtỐng nghiệm 3.4.4b Tạo kết tủa trắng

Ống nghiệm 3.4.5b Tạo dd trong suốt

Giải thích kết quả:

- Ống nghiệm 3.4.1b: Vì hầu hết các protein không ổn địnhdưới tác dụng của nhiệt Ở nhiệt độ cao (50 C - 55 C), các liêno okết như liên kết hydrogen, liên kết kị nước bị đứt làm cácphân tử protein bị biến tính, đông tụ tạo nên kết tủa trắng

- Ống nghiệm 3.4.2b: Vì protein có tính chất acid nên kết tủatrong môi trường acid yếu

- Ống nghiệm 3.4.3b: Vì trong môi trường acid có nồng độ cao,khi đun nóng đến sôi thì các phân tử protein tích điện trái dấu,chủ yếu mang điện tích dương nên protein bị biến tính khôngtạo nên kết tủa protein

- Ống nghiệm 3.4.4b: Vì ở ống 3.4.4b tuy là môi trường axityếu nhưng nồng độ cao và khi tác dụng với NaCl là một chấtđiện ly, đem đun nóng thì các ion muối bị hấp phụ trên bề mặtcủa phân tử protein, gây tác dụng trung hòa về điện tạo nênlực liên kết giữa các phân tử mạnh hơn lực đẩy, dẫn đếnprotein kết tủa

- Ống nghiệm 3.4.5b: Vì NaOH 10% là môi trường kiềm mạnh, protein mang điện tích âm, khi đun nóng thì các phân tử protein cùng dấu đẩy nhau nên không tạo kết tủa.

Thí nghiệm 5 Định lượng protein niệu (Kỹ thuật Mestrezat)

Tiến trình:

- Lấy 11 ống nghiệm đánh số 3.5.1 – 3.5.11 (M)

- Cho lượng thuốc thử vào mỗi ống như sau:

Ống nghiệm 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.5.5 3.5.6 3.5.7 3.5.8 3.5.9 3.5.10 3.5.11 (M)Protein mẫu (mL) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 0

- Từ hình ảnh kết quả trên thì so sánh ống 3.5.11 (M) với ống 3.5.1

và 3.5.2

 Độ mờ giảm dần: 3.5.11 (M), 3.5.1, 3.5.2

Tên thành viên

BÀI 2 PROTEIN (tiếp theo)

Thí nghiệm 1 Định lượng protein bằng phương pháp

MicroKjeldahl:

Giai đoạn vô cơ hóa:

- Hút 1 mL sữa vào ống phá mẫu Kjeldahl, tiếp tục cho vào 1g chất xúc tác

- Hút 10 mL H SO₂ ₄

- Cho 200mg hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 với tỉ lệ

9/, đậy kín bình, để yên 30p

- Đặt ống phá vào máy phá mẫu cài đặt nhiệt độ và thời

– 15p, 420°C – 45p, bắt đầu vô cơ hóa mẫu

- Trong quá trình đun, dung dịch chuyển màu từ nâu sẫm

sang màu nâu cánh dán đến màu vàng nhạt và cuối cùng

được dung dịch màu trắng trong, kết thúc giai đoạn vô cơ hóa

Giai đoạn cất đám:

- Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3

hợp vào bình tam giác 250 mL

- Dùng máy chưng cất bán tự động để hứng NH3 vào

bình tam giác 250 mL đã chuẩn bị

Giai đoạn chuẩn độ:

- Chuẩn độ lượng H₂SO₄ 0,1N còn dư trong bình (V2) bằng NaOH 0,1N

- Quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ

màu tím đỏ sang xanh lá mạ.

Kết quả:

- Dung dịch trong bình hứng chuyển sang màu xanh lá mạ

Tính kết quả:

 P: Hàm lượng protein có trong mẫu đem phân tích

NH3 bị đẩy ra sau khi cất đạm (mL)

 0,0014: Số gam nitrogen tương đương với 1ml H₂SO₄ 0, 1N

 N1: Nồng độ đương lượng của kiềm

 N2: Nồng độ đương lương của Fixanal H₂SO₄ 0,1N

 V: Số ml dung dịch mẫu pha loãng

 Vc: Số ml dung dịch mẫu cất đạm

 Vm: Số ml dung dịch mẫu nguyên liệu đem vô cơ hóa 1000: Quy

ra lít

Lượng H₂SO₄ 0,1N dư sau khi đã cất đạm (V2) là 8 mL

Sau khi đo OD vẽ biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của

mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn

3' 150 0,448

Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng protein

có trong mẫu khử hỗn hợp thuốc thử Folin – Ciocalteu để xác định hàm lượng protein

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận vớinồng độ protein tinh khiết trong một phạm vi nhất định.Hàm lượng protein càng cao, màu của phức chất càngđậm

Máy đo quang phổ giúp xác định mật độ quang phổ của dung dịch protein tinh khiết và dựa theo đường chuẩn ta

có thể dễ dàng tính được hàm lượng (Phương pháp này sửdụng đối với protein hòa tan.)

Bao gồm 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Phản ứng với Biure (Phản ứng đặc trưng cho liên kết peptide) Ở môi trường kiềm các mẫu dung dịch chứa từ 2 liên kết peptide trở lên có thể

phản ứng với CUSO tạo thành phức chất có màu xanh,4

xanh tím (Cường độ màu sẽ thay đổi tùy thuộc vào độ dày của mạch peptide)

Giai đoạn 2: Phản ứng với thuốc thử Folin đây là một chất làm tăng độ nhạy của phản ứng Biure Trong phân

tử protein các axit phosphomolybden, phoshowolframatnày sẽ cùng tham gia trong phản ứng tạo phức chất có màu xanh trời, giúp tăng hấp thụ cực lại bước sóng ở 250nm

mL từ ống số 10 bỏ đi.

- Cho vào mỗi ống 2 mL dung dịch tinh bột 0,1% trong dung

dịch đệm pH = 5,8% Lắc đều, giữ ở 37 C trong 30 phút (dùng tủo

ấm hoặc nồi cách thủy có điều nhiệt) Sau đó lấy ra, làm lạnh ,

cho vào mỗi ống 1 giọt dung dịch Iode 0,02N Ghi ống có độ phaloãng lớn nhất mà có khả năng phân giải hoàn toàn tinh bột (ống

có màu vàng và ống tiếp sau nó vẫn còn màu đỏ nâu hoặc tím)

Kết

quả:

- Ống nghiệm số 5 có độ pha loãng lớn nhất mà có khả năng phân giải hoàn toàn tinh bột.

Tính kết quả:

Hoạt độ amylase trong 1 mL dịch

chiết enzyme là: 2 x 2 Với 2: Hệ n

số pha loãng

n: Số thứ tự ống nghiệm

- Thêm vào mỗi ống khoảng 1 gam bột đậu nành.

- Đặt giấy quỳ tím vào thành miệng ống nghiệm và đậy ống bằng nút bông Lắc đều

Ống nghiệm Kết quả quan sát

Ống nghiệm 2.2.1 xanh.Quỳ tím chuyển sang màu tímỐng nghiệm 2.2.2 Quỳ tím không đổi màu.

So sánh màu quì tím: Ống nghiệm 2.2.1 quì tím đổi thành màu xanh; ống nghiệm

- Enzyme urease (có trong đậu nành) xúc tác cho phản ứng

thủy phân urea (CO(NH2)2 tạo thành Carbonic (CO ) và 2

amonia (NH ) theo phản ứng sau:3

=> Amonia được tạo thành sẽ làm biến đổi màu giấy quì tím đỏ

thành xanh

- Acetamide ( CH3CONH2) khi thực hiện phản ứng

thủy phân (H ) có xúc tác Urease sẽ tạo ra ammonium acetate 2

(CH COONH3 4) Khi thiếu nhiệt độ cao thì CH3COONH4

không thể phân hủy thành axit axetic và anomia => Quì tím

không thể đổi màu

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt lực

enzyme, xác định pH tối thích (pH otp) của enzyme

amylase malt đại mạch

Tiến trình:

- Lấy 7 ống nghiệm lớn, đánh số từ 1 đến 7, cho vào mỗi

ống một lượng dung dịch Na2HPO4 0,2M và C6H8O7 0,1M theo

số lượng ghi trong bảng, lắc đều

- Cho vào mỗi ống 5 mL dung dịch tinh bột 0,2% trong NaCl 0,1%, lắc đều

- Thêm vào mỗi ống 1 mL dịch chiết enzyme amylase của

đại mạch nảy mầm, lắc đều.

- Sau 12 phút, cho vào tất cả các ống, mỗi ống 3 giọt thuốc thử Lugol, lắc đều

- Ghi màu của mỗi ống vào bảng, xác định pH thích hợp

của amylase của malt đại mạch (nghĩa pH của ống nghiệm

cho phản ứng âm tính với thuốc thử Lugol)

Kết

quả:

pH dung dịch tươngứng

Dung dịch tinh bột 0,2%, (mL)

Dịch chiếtenzyme, (mL)

Màu với Lugol

- pH tối thích của enzyme malt đại mạch là: 5,8

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất

kìm hãm lên hoạt độ của enzyme

- Lắc đều, cho vào mỗi ống 1 mL dịch chiết enzyme amylase của đại mạch nảy mầm và 1 mL dung dịch tinh bột 0,5% Lắc đều.

- Sau 5 phút, cho vào tất cả các ống, mỗi ống 1 giọt thuốc thử Lugol, lắc đều

Kết quả:

Ống nghiệm Kết quả quan sát

Ống nghiệm 2.4.1 Trong suốt

Ống nghiệm 2.4.2 Trong suốt

Ống nghiệm 2.4.3 Màu tím xanh

=>> Hoạt độ của ống 2 là cao nhất, sau đó đến ống 1

và cuối cùng là ống 3 Giải thích kết quả:

- Ống 1: Ban đầu, hỗn hợp sẽ có màu xanh đậm do sự tạo thành phức chất giữa tinh bột và thuốc thử Lugol Sau khi enzyme amylase bắt đầu phân hủy tinh bột thành

đường, màu xanh sẽ dần chuyển sang màu vàng và sau đó trởnên trong suốt do không còn tinh bột để tạo phức chất vớithuốc thử Lugol Điều này cho thấy sự phân hủy của tinh bộtbởi enzyme amylase.

- Ống 2: Ban đầu, hỗn hợp sẽ có màu xanh đậm do sự tạo thành phức chất giữa tinh bột và thuốc thử Lugol Sự hiện diện của ion Cl có thể ổn định cấu trúc của enzyme và tăng cường -tương tác giữa enzyme và chất cần phản ứng, làm tăng hoạt độ của enzyme Sau khi enzyme amylase bắt đầu phân hủy tinh bột thành đường, màu xanh sẽ dần chuyển sang màu vàng và sau đó trở nên trong suốt do không còn tinh bột để tạo phức chất với thuốc thử Lugol

- Ống 3: Hỗn hợp sẽ có màu xanh đậm do sự tạo thành phức chất giữa tinh bột và thuốc thử Lugol Enzyme amylase không thể phân hủy tinh bột thành đường do bị kìm hãm bởi sulfate đồng (CuSO4)

Thí nghiệm 5: Khảo sát enzyme catalase

Tiến trình:

Nghiền 20 gan tươi cho vào cối chày sứ nghiền nát Cho 1g gan

đã nghiền vào ống nghiệm, thêm thật nhanh H2O2 10% vào đầyống, lộn ngược ống vào 1 chậu nước, khí sẽ bốc mạnh và nổi bọt đầy ống Khi ống nghiệm đã đầy khí, bỏ ống ra khỏi chậu, dốc hết nước thật nhanh và cho vào đáy ống nghiệm đóm tàn lửa, đóm sẽ cháy bùng lên chứng tỏ có oxy

Kết

quả:

Giải thích kết quả:

Catalase (Có trong gan) xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 thành nước và oxy Nên khi cho đóm tàn lửa vào ống nghiệm, đóm sẽ cháy bùng lên do có oxy

Tên thành viên

1 Nguyễn Ngọc Bảo Trâm (viết báo cáo)

2 Ngụy Văn Tuấn

3 Nguyễn Mạnh Tùng

BÀI 4: GLUCIDE

Thí nghiệm 1 Định tính monosaccharide bằng phản ứng tráng gương.

Tiến trình:

- Lấy 1 ống nghiệm, cho vào đó 1mL AgNO3 5% và từng giọt NH4OH đặc để tạo thành kết tủa

- Sau đó, thêm từ từ NH4OH chco đến khi tủa tan

hoàn toàn (không cho thừa NH4OH)

- Tiếp tục cho 3mL glucose

5%, đun sôi trong 1 phút Kết

quả:

- Nhỏ 1 giọt đầu tiên

- Nhỏ 1 giọt thứ 2.

- Kết quả khi cho 3mL glucose 5%, đun sôi trong 1 phút

Ống nghiệm Kết quả quan sát

2.1.1 Tủa bao phủ thành ống nghiệm,

tạo thành một lớp tráng gương

- Lấy 3 ống nghiệm, đánh số 1,2 và 3, đánh số theo

quy tắc 1.2.1 (tổ 1, thí nghiệm 2, ống nghiệm 1), cho

Ống nghiệm Kết quả quan sát

2.2.2 Mầu đỏ gạch2.2.3 Màu xanh thẫmKết quả:

- So sánh kết quả tủa trong 3 ống nghiệm: Ống 2.2.2 tủa nhiều, tiếp đến ống 2.2.1 và cuối cùng là ống 2.2.3

Giải thích kết quả: thuốc thử fehling A và B là dung dịch muối K – Na - tartrate Muối phức này là hợp chất không bền

- Trong môi trường kiềm, các monosaccharide (glucose, mantose, galactose, fructose,…) và một số saccharide

(maltose, cellobiose, lactose) có thể dễ dàng khử Cu2+

trong thuốc thử Fehling thành Cu+, tạo thành kết tủa đỏ

gạch

- Saccarose là đường đôi, không có nhóm aldehyd tự

do Do đó, khi gặp thuốc thử Fehling, saccarose không thểkhử Cu2+, không tạo thành kết tủa Vì phản ứng Fehlingchỉ xảy ra khi có sự tồn tại của aldehid hoặc ceton trongvật liệu cần kiểm tra

Thí nghiệm 3 Xác định đường cetose bằng phản ứng Seliwanoff.

Tiến trình:

- Lấy 2 ống nghiệm, đánh số 1 và 2, đánh số theo quy tắc1.3.1 (tổ 2, thí nghiệm 3, ống nghiệm 1), cho vào:

+ Ống 2.3.1: 1mL Glucose 1%

Ống nghiệm Kết quả quan sát

monosaccharide chứa nhóm chức aldehyde thuộc nhóm aldose, chứa nhóm chức cetone là nhóm cetose

- Fructose và các cetohexose khi đun nóng với các acid hydrochloric (HCl) bị mất nước sẽ tạo thành oxymethylfurfurol:

- Oxymethylfurfurol kết hợp với resorcine tạo thành sản phẩm màu đặc trưng Phản ứng như sau:

Thí nghiệm 4 Thủy phân

- Kể từ khi nước trong nồi cách thủy bắt đầu đạt 80oC:+ Sau 1 phút lấy ra 1 giọt dung dịch (1) cho vào ống số 1, lắc đều.+ Sau 3 phút lấy 1 giọt dung dịch (1) cho vào ống số 2, lắc đều.+ Sau 5 phút lấy 1 giọt dung dịch (1) cho vào ống số 3, lắc đều.+ Sau 10 phút lấy 1 giọt dung dịch (1) cho vào ống số 4, lắc đều

- Quan sát màu trong ống số 4, nếu dung dịch có màu vàng nhạt chứng tỏ quá trình thủy phân tinh bột đã kết

thúc