khảo sát hoạt tính kháng tiểu đường của các cao chiết từ hạt mướp đắng theo cơ chế ức chế men α glucosidase

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: SINH HÓA ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG TIỂU ĐƯỜNG CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ HẠT MƯỚP ĐẮNG THEO CƠ CHẾ ỨC CHẾ MEN α- GLUCOSIDASE GV

TOÅNG QUAN 1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY MƯỚP ĐẮNG 1.1 Mô tả

Phaân boá

Mướp đắng được phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp các châu lục Mướp đắng được trồng lần đầu tiên từ thời xa xưa ở Ấn Độ, Nam Trung Quốc và châu Phi, sau đó cây được du nhập sang châu Mỹ Quần thể mướp đắng trồng đã trở nên rất phong phú với các giống cây đa dạng được tạo ra trong quá trình chọn giống và lai tạo Ở Việt Nam, mướp đắng được trồng ở hầu hết các tỉnh từ đồng bằng đến trung du và miền núi Ở một số vùng núi cao lạnh như Sa Pa (Lào Cai), Phó Bảng (Hà Giang)…không thấy có mướp đắng

Trên thế giới, mướp đắng cũng có mặt ở hầu hết các nước nhiệt đới từ châu Phi, sang châu Á và châu Mỹ Cây có biên độ sinh thái tương đối rộng, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng từ 20 đến 24 0 C hoặc cao hơn Lượng mưa hàng năm từ dưới 2000 mm đến 2400 mm Cây sinh trưởng nhanh trong mùa mưa ẩm, ra hoa quả sau 7 - 8 tuần gieo trồng Hoa thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng Sau khi quả già, cây tàn lụi và kết thúc vòng đời sau 4 – 5 tháng tồn tại.

Công dụng chữa bệnh của các bộ phận của cây mướp đắng trong dân gian 1 Reã

Hầu hết các bộ phận của cây như rễ, thân, lá, hoa, trái, hạt đều có thể dùng làm thuốc chữa bệnh [1]

Rễ mướp đắng tươi, sắc nước uống, mỗi ngày một thang, từ 1000 ml nước với 60g rễ mướp đắng tươi, sắc còn 400 ml, chia làm 2-3 lần uống, có thể áp dụng cho mọi dạng bệnh Tại Ấn Độ, dịch rễ (cũng như lá, trái) mướp đắng được dùng trị bệnh tiểu đường, do có tác dụng làm giảm đường huyết Rễ mướp đắng

Dây mướp đắng được dùng làm thuốc chữa viêm xoang, chảy nước mũi có mùi hôi hoặc bệnh gan làm vàng da [17]

Lá có vị đắng, tính mát Nước ép của lá là thuốc gây nôn, thuốc tẩy trong những bệnh về đường mật, trị giun [3] hoặc trị mụn nhọt, rôm sẩy [1] Ngoài ra, lá còn có thể trị được rắn cắn, làm thuốc nhuận trường, hạ sốt [7]

Hoa mướp đắng được dùng để chữa đau dạ dày, lỵ cấp tính Hoa còn là một thành phần trong bài thuốc trị hen [1]

Trái còn xanh có vị đắng, khi chín thì ít đắng hơn Trái mướp đắng có tính hàn (mát), không độc Trái xanh có tính giải nhiệt, làm tiêu đờm, nhuận trường, bổ thận, bớt mệt mỏi, giảm stress, xoa dịu thần kinh, giải độc, lợi tiểu, làm bớt đau khớp Khi chín mướp đắng có tính bổ thận, dưỡng huyết, diệt giun (sán, lãi) Ở Trung Quốc, trái mướp đắng còn dùng để trị đột quị tim, bệnh sốt, khô miệng, viêm họng Ở Ấn Độ, dịch trái mướp đắng được dùng trị rắn cắn Người ta còn dùng bột trái mướp đắng để hàn các vết thương (làm kéo da non), vết loét ác tính Ở Thái Lan, dịch trái được dùng trị bệnh về gan và lá lách [7]

Với tính diệt khuẩn và chống oxi hóa, trái mướp đắng làm da mịn màng, trị mụn trứng cá hay bệnh vẩy nến và ngay cả với những vết thương do côn trùng cắn, nhiễm trùng da Mặt khác, trái mướp đắng còn cung cấp nguồn năng lượng dồi dào và tăng khả năng chịu đựng cho cơ thể [2]

Ngoài công dụng làm rau ăn, trái mướp đắng còn được dùng để trị nhiều bệnh như: trị ho, sốt, kiết lỵ, dạ dày, đau tức, đái dắt (mắc đi tiểu luôn, nhưng mỗi lần rất ít), trị sáng mắt, mắt đỏ đau nhức, bổ tim, bổ máu, mát gan, phù thủng do gan nóng, đau lá lách, giải nhiệt, hồi hộp, buồn phiền, tắm cho trẻ em, trị rôm sảy, làm hạ đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 (không phụ thuộc insulin) [5],[8]

Hạt có chất béo, vị đắng, hơi ngọt, tính ấm, thanh nhiệt, giải độâc, giải cảm, trị ho, lợi tiểu Hạt còn chữa rắn cắn, chữa nhọt độc sưng tấy, vết thương nhiễm trùng, hạ sốt [7],[9] và chống thụ thai [17] Ở tại nhiều nước, hạt mướp đắng được dùng để trị bệnh tiểu đường [2],[11]

Ngoài ra, theo một số nghiên cứu gần đây, cho biết các hoạt chất trong hạt mướp đắng còn có tác dụng chống ung thư, làm hạ huyết áp, [5]

2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÂY MƯỚP ĐẮNG 2.1 Các nghiên cứu trong nước:

Về thành phần hóa học: Các tác giả Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Phùng Văn Trung ở Viện Công nghệ Hóa học đã chiết tách được từ hạt già mướp đắng hai hợp chất Momordicosid A và Momordicosid B và từ trái mướp đắng bốn hợp chất Momordicosid K, L, 3-O-[β-D-glucopyranosyl]- stigmasta-5,25(27)-diene và 23-O-β-D-allopyranosyl 5,19-epoxycucurbita-6,24- dien-3β,22,23-triol 3-O-β-D-allopyranoside được đặt tên là charantinoside [20]

Các tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng và Lê Minh Phương của Viện Dược liệu Hà Nội đã thống kê và khảo sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây mướp đắng và khảo sát tác dụng hạ đường huyết của của dịch chiết glycosid trong trái mướp đắng trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng aloxan [15]

Về tác dụng dược lí, nhóm tác giả trên đã chứng minh nhóm các glycosid có khả năng làm giảm 40,28% mức tăng đường huyết đối với thỏ gây đái tháo đường bằng aloxan Tuy nhiên, ở cao cồn 40 o có tác dụng làm giảm đường huyết tới 70,47% mức tăng của đường huyết so với lô đối chứng Điều này cho phép các tác giả trên giả thiết rằng trong trái còn có những thành phần mà bản thân nó tuy không có hoạt tính gây hạ đường huyết nhưng có tác dụng bổ trợ làm tăng hoạt tính gây hạ đường huyết của glycosid [15].

Các nghiên cứu trên thế giới 1 Thành phần hóa học

2.2.1 Thành phần hóa học 2.2.1.1 Quả mướp đắng [3], [31]

- Các glucosid triterpenic: charantin và hỗn hợp các chất thuộc nhóm stigmastadienol, các glucosid đắng là momordicosid K và L, các glucosid không đắng là momordicosid F1, F2, I, G

- Các acid amin như: acid aspartic, threonin, serin, acid glutamic, prolin, alanin, glycin, valin, cystein, methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, histidin, lysin và arginin

- Các lipit 0,76% (theo trọng lượng khô)

- Các sắc tố, chủ yếu là lycopen, hàm lượng thay đổi theo kích thước và độ chín của quả

- Các hợp chất thuộc nhóm saponin như: Goyasaponin I, II, III

- Các chất khoáng như Ca, Mg, Fe, Cu, Zn…

- Các alcol bậc nhất, các aldehyd

- Chất dẫn dụ côn trùng là [1-O-(β galactopyranosyl)- 2-3-di-O-linolenoyl x glycerol], [6- linolenogl β-D-glucopyranosyl (1-3) β clerosterol

- Các glucosid - β-D-glucosid cuûa β sitosterol - Các terpen glucosid: Momordicosid A, B, C, D, E

MAP – 30 MCI -1, MCI -2, MCI -3 MCT I, II

MCEI -I α, β momorcharin I,II Momorcharin I, II

- Các chất acid béo như: Acid palmitic, Acid stearic, Acid oleic, Acid linoleic, Acid arachidic, Acid oleostearic… trong đó acid stearic và acid oleostearic chiếm phần lớn, các acid béo khác chiếm tỉ lệ không đáng kể

2.2.1.3 Lá và thân mướp đắng [29], [30]

- Momordicin I, II, III - Các sterol và chitinase

- Các cucurbitan triterpenoid I, II, III

- Calceolariosid E là một phenylpropanoid glucosid

Cao cồn mướp đắng cho chuột cống trắng uống 500 mg/kg làm giảm mức glucose 6% sau 2 giờ ở chuột bình thường và 26% sau 3,5 giờ ở chuột gây tiểu đường với streptozotocin

Cao nước quả mướp đắng khi cho chuột cống trắng đã được gây tăng đường máu với aloxan (120 mg aloxan/kg tiêm dưới da) uống hàng ngày trong hai tháng làm chậm sự xuất hiện bệnh võng mạc

Dịch ép quả mướp đắng có tác dụng loại bỏ những gốc superoxyd và hydroxyl Những gốc chứa oxy này có liên quan đến bệnh tiểu đường, tác dụng chống tiểu đường của mướp đắng có thể một phần do cơ chế này Một số nghiên cứu cho thấy hạt mướp đắng cũng có những hoạt chất gây hạ đường máu [3]

Cao thô từ mướp đắng có hoạt tính chống ung thư có ý nghĩa đối với nhiều loại tế bào ung thư ở chuột nhắt trắng với liều tối ưu 8 àg protein tiờm phỳc mạc

MAP 30, một protein kháng siêu vi khuẩn, có thể ức chế nhiễm siêu vi khuẩn HIV – 1 ở tế bào lympho T và bạch cầu đơn nhân to, nó không độc với tế bào bình thường không bị nhiễm [3]

Hạt và vỏ quả mướp đắng chứa một chất nhựa, một saponin glycosid, và những alcaloid gây nôn và tiêu chảy Nhiều protein có hoạt tính dược lý được phân lập từ mướp đắng Các protein α – momorcharin và β – momorcharin từ hạt của mướp đắng có tác dụng độc hại gan trên tế bào gan chuột cô lập [3] Ở Trung Quốc, người ta đã phân tách được hai hoạt chất có tác dụng hạn chế sinh sản là α – protein và β – protein từ hạt mướp đắng Các thí nghiệm nuôi cấy, ghép phôi in vitro cho thấy α –, β – protein hạt mướp đắng có tác dụng ức chế quá trình làm dày đặc nguyên bào phôi trước khi làm tổ và hình thành phôi ở thai kỳ đầu, từ đó phôi ngừng phát triển, thoái hóa phân hủy dẫn đến sẩy thai

Những nghiên cứu gần đây cho thấy α – protein và β – protein mướp đắng cũng có ảnh hưởng đến sự sinh sản của phôi chuột nhắt trắng và ảnh hưởng đến việc tổng hợp phân tử lớn tế bào nội mô tử cung; chúng cũng có khả năng ức chế tổng hợp ADN, ARN và protein, làm cho sự phát triển của nội mạc tử cung bị ức cheá

Phân tích cơ chế tác dụng chống thụ thai của α – protein và β – protein hạt mướp đắng ta thấy ngay là ở thai kỳ đầu của động vật mang thai protein này tác động trực tiếp lên tế bào phôi và tế bào nội mạc tử cung ở các giai đoạn phát triển khác nhau, làm chúng không thể phát triển và làm tổ bình thường, nên bị saồy thai [17]

3 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG (ĐÁI THÁO ĐƯỜNG) 3.1 Thống kê sơ bộ về bệnh tiểu đường ở thế giới và Việt Nam

- Theo công bố của WHO năm 1985 có khoảng 30 triệu người mắc bệnh tiểu đường, năm 1994 có 98,9 triệu Theo ước tính của Viện nghiên cứu tiểu đường quốc tế thì năm 2010 có khoảng 215,6 triệu người bị tiểu đường

- Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường ở Singapore 1975 là 1,9%; 1985 là 4,7%; 1992 là 8,6%, Pháp là 1,4%, Châu Âu là 3%, Philippin là 4,27%, Thái Lan là 3,58%, Malaysia là 3,01% Theo công bố tại Hội nghị tiểu đường 12/1997 tại Singapore số người mắc bệnh tiểu đường ở một số quốc gia tiêu biểu như: Ấn Độ có 19,4 triệu, Nga có 8,9 triệu, Trung Quốc có 16 triệu, Mĩ có 13,9 triệu, Nhật có 6,3 triệu [13], [14] Giữa những chủng tộc người khác nhau cũng có sự khác biệt, tỉ lệ người mắc bệnh ở thành thị cao hơn nông thôn [16]

- Tại Việt Nam: Hiện chưa thống kê được tỷ lệ tiểu đường toàn quốc mà mới chỉ tiến hành điều tra ở một số thành phố lớn Các tác giả Lê Huy Liệu, Mai Thế Trạch cho thấy tỷ lệ tiểu đường ở Hà Nội là 1,1% (1990-1991) ở Thành phố Hồ Chí Minh là 2,8% (1992-1993), Huế là 0,98% (1980) ở Hải Phòng là 0,3% daân soá [13], [14].

Bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường là một loại bệnh mãn tính do rối loạn sự trao đổi đường glucose, protein và mỡ trong cơ thể Đây là một trong những loại bệnh thường gặp nhất trong các chứng bệnh nội tiết Đặc trưng của nó là lượng đường trong máu quá cao và trong nước tiểu có đường Khi đường trong máu quá cao thì có triệu chứng bệnh 3 nhiều 1 ít, tức là uống nhiều, tiểu nhiều, ăn nhiều và giảm thể trọng Ngoài ra còn có tình trạng mệt mỏi, không có sức lực và tinh thần không phấn chấn Khi nghiêm trọng có thể sinh ra trúng độc acid thể ceton

Bệnh tiểu đường tính thẩm thấu cao, chứng không ceton gây hôn mê và có thể kèm theo các loại bệnh nhiễm trùng Người bệnh lâu năm có thể sinh ra biến chứng bệnh lý như xơ vữa động mạch, bệnh thần kinh, thận và võng mạc maét [16]

Người ta chia bệnh tiểu đường thành 2 loại:

- Loại 1: Phụ thuộc hoàn toàn vào insulin Nguyên nhân là do tuyến tụy không sản xuất được insulin vì thế người bệnh phải được điều trị bằng cách tiêm bổ sung insulin thường xuyên

- Loại 2: Không phụ thuộc vào insulin Đây là nhóm bệnh phổ biến, chiếm hơn 90% bệnh nhân tiểu đường Nguyên nhân là do tuyến tụy không sản xuất đủ insulin hoặc insulin bị giảm chức năng vận chuyển glucose vào trong tế bào, làm cho glucose bị ứ lại và tăng lên ở trong máu

Có 3 rối loạn chính tạo ra sự bất dung nạp glucose trong bệnh tiểu đường không phụ thuộc vào insulin Đó là sự rối loạn bài tiết insulin của tụy tạng, sự sản xuất glucose ở gan không bị ức chế, sự đề kháng với tác dụng của insulin của các mô ví dụ như mô cơ [12]

Lờn insulin và không dung nạp glucose là giai đoạn khởi đầu của bệnh tiểu đường loại 2 Tụy tạng vẫn tiết đủ insulin nhưng chất này không phát huy được tác dụng [21].

Nguyên nhân phát sinh bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường có thể phân làm 2 loại: tính nguyên phát và thứ phát

Bệnh tiểu đường tính nguyên phát còn chưa rõ nguyên nhân Người ta cho rằng bệnh tiểu đường tính nguyên phát là một loại bệnh di truyền, rất có thể trong tương lai tìm ra nguyên nhân gây bệnh đối với một số bệnh nhân, và sẽ xếp họ vào loại bệnh thứ phát Nguyên nhân bệnh tiểu đường thứ phát thường gặp nhất là do bị cắt bỏ toàn bộ tụy (lá lách), viêm tuyến tụy mãn tính và bệnh tiểu đường do một số bệnh nội tiết gây ra [16]

Sau bữa ăn, glucose vào máu nhiều, gan tồn trữ glucose dưới dạng glycogen Hàm lượng glycogen trong gan phụ thuộc vào lượng thức ăn chứa glucid và ở người có thể lên đến 150g Một lượng glycogen có thể hình thành từ sản phẩm phân giải protein Sự hình thành glycogen trong gan có ý nghĩa rất lớn đối với cơ thể Khi đói, glucose huyết thấp, gan thủy phân glycogen để phóng thích glucose nhằm ổn định glucose huyết Nói cách khác, gan là kho an toàn, gan thực hiện dưới sự chỉ đạo của insulin (và một vài nội tiết tố khác)

Bình thường Sau bữa ăn

Khi bị bệnh tiểu đường, gan chẳng những không tích trữ glucose dưới dạng glycogen mà còn thủy phân glycogen để phóng thích glucose, hậu quả là glucose huyết cao lúc no cũng như lúc đói [20]

Tiểu đường Sau bữa ăn

Dù no hay đói Glycogen ở gan

Hóa dược trị tiểu đường

3.4.1 Ức chế α - glucosidase: Acarbose và Miglitol

Dùng cho bệnh nhân tiểu đường loại 2

Cơ chế: Acarbose và Miglitol ức chế men α - glucosidase trong ruột khiến các polysaccharid (tinh bột, đường mía saccharose ) chậm thủy phân thành glucose, kết quả là glucose vào máu từ từ nên glucose huyết không tăng nhiều sau bữa ăn

Khoõng duứng thuoỏc Duứng thuoỏc

Carbohydrat Carbohydrat α - glucosidase Acarbose, Miglitol (trong ruột non) (ức chế α - glucosidase) glucose huyết tăng glucose huyết ít dao động

3.4.2 Nhóm Sulfonylurea: Được dùng đầu tiên trị tiểu đường loại 2, hiện nay rất phổ biến nhưng không dùng cho tiểu đường loại 1 Sulfonylurea hiệu quả với 75% người mới bị bệnh tiểu đường

Cơ chế: Nhóm Sulfonylurea này có tác dụng kích thích tế bào β tuyến tụy tiết ra insulin Sulfonylurea chỉ tăng tiết insulin chứ không liên quan đến tổng hợp chất này Đối với bệnh tiểu đường loại 1, tế bào β bị thoái hóa nên Sulfonylurea khoõng coõng hieọu

Repaglinid là một nhóm riêng khác với Sulfonylurea Repaglinid cũng có tác dụng kích thích tế bào β tuyến tụy tiết ra insulin gioỏng nhử Sulfonylurea

So với Sulfonylurea, nó có tác dụng nhanh hơn nhưng ngắn hơn Do Repaglinid có nhiều tính năng giống Sulfonylurea nên ít dùng

3.4.4 Meformin (nhóm Biguanid) Giúp giảm đường huyết theo 3 cách: Một là giúp cơ thể sử dụng insulin hiệu quả hơn, hai là làm cơ thể giảm tiết đường và ba là làm giảm hấp thu đường từ thức ăn

Dùng cho bệnh nhân tiểu đường loại 2 mà ăn kiêng và thay đổi nếp sống vẫn không khống chế được glucose huyết

Cơ chế: Meformin ức chế sự thủy phân glycogen thành glucose ở gan, giảm hấp thụ glucose ở ruột và cải thiện độ cảm nhận insulin ở cơ quan ngoại vi (tăng hấp thụ và sử dụng glucose ở ngoại vi)

Meformin không làm tăng tiết insulin mà chỉ tăng khả năng dùng insulin

Chặn hấp thụ glucose Chặn thủy phân glycogen glucose không tăng khi no glucose không tăng khi đói

Kết hợp Meformin và Sulfonylurea làm tăng tác dụng

Sulfonylurea + Meformin tăng tiết insulin tăng hiệu lực insulin

Glucose ở ruột Glycogen Sulfonylurea ở gan

Tế bào β của tụy tạng

(ứùc chế sinh glucose) (giảm glucose huyết)

Kết hợp Meformin và Acarbose : cả hai cùng ức chế hấp thụ glucose ở ruột nghĩa là làm giảm dao động glucose sau bữa ăn, Meformin lại làm giảm glucose huyết khi đói do ức chế gan thủy phân glycogen Như vậy glucose không dao động khi no cũng như khi đói: đó chính là nguyên tắc mới điều trị tiểu đường

Gồm 2 thuốc là Troglitazon và Rosiglitazon: Tác dụng của thuốc là làm tăng việc sử dụng glucose ở mô ngoại biên (mô mỡ, cơ) dưới tác dụng của insulin (tức là làm tăng độ nhạy của mô với insulin)

Có độc tính gan cao

3.4 6 Insulin (chổ tieõm, khoõng uoỏng)

Bệnh nhân tiểu đường loại 1 do tế bào β của tụy tạng suy thoái Bệnh nhân tiểu đường loại 2 mãn tính, thuốc uống không hiệu nghiệm Trị các biến chứng acidoz, thẩm áp cao…

4 MEN ∝ -GLUCOSIDASE VÀ PHƯƠNG PHÁP ỨC CHẾ MEN

∝-GLUCOSIDASE TRONG ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƯỜNG

4.1.1 Vai trò và tác dụng của enzym [18]

Enzym là những protein đóng vai trò là chất xúc tác, tăng cường tốc độ các phản ứng hóa học bằng cách tương tác trực tiếp với chất tham gia phản ứng, trong đó chúng không hề bị biến đổi thành phần, vì vậy enzym được sử dụng nhieàu laàn

Enzym xúc tác các phản ứng bằng cách đầu tiên liên kết với cơ chất (chất chất tham gia phản ứng bị bẻ gãy và được thành lập, và cuối cùng các sản phẩm được giải phóng khỏi enzym

Phức hệ enzym - cơ chất

Sau khi sản phẩm được giải phóng, enzym lại được tái sử dụng, enzym là chất xúc tác có tính đặc thù đối với các phân tử và phản ứng nhất định Vì vậy ở cơ thể người có đến hàng nghìn phản ứng sẽ có đến hàng nghìn enzym đặc thù khác nhau

Mã số: EC 3.2.1.20 Tên khác: maltase glucoinvertase glucosidosucrase maltase-glucoamylase α -glucopyranosidase glucosidoinvertase α -D-glucosidase α -glucoside hydrolase α -1,4-glucosidase Nhóm: Hydrolaza Nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân.

Vai trò của α - glucosidase trong quá trình hình thành glucose

Dưới tác dụng của men amylase, tinh bột (kết hợp với nhiều phân tử đường glucose) sẽ bị thủy phân thành maltose (gồm 2 phân tử đường glucose)

Sau đó, với sự xúc tác của men α - glucosidase, đường maltose sẽ tiếp tục bị thủy phân thành đường glucose Đường glucose này sẽ được hấp thụ vào mạch máu trong cơ thể con người và trở thành glucose huyết cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động sống

Nhưng với sự xuất hiện của một chất ức chế nào đó, men α - glucosidase sẽ hạn chế hoạt động, quá trình thủy phân maltose diễn ra chậm vì vậy hàm lượng glucose không tăng mạnh sau khi ăn.

Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế men α - glucosidase

Phương pháp ức chế men α-glucosidase trong điều trị tiểu đường loại 2 là phương pháp được ưu tiên sử dụng vì có cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hoá đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào β tuỵ tạng… như các phương pháp khác

Phương pháp in vitro để khảo hoạt tính ức chế men α-glucosidase dựa trên nguyên tắc: men α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt nối này để giải phóng đường D-glucose Hoạt động này sản sinh ra nhiều glucose sau khi ăn và làm gia tăng hàm lượng glucose trong máu, do đó cần ức chế hoạt động của men α-glucosidase để làm chậm sự chuyển hoá một số loại thức ăn thành glucose Vì vậy, người ta sử dụng các chất nền có liên kết α với đường D- glucose như: p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, maltose… để xây dựng phương pháp thử hoạt tính ức chế men α-glucosidase trong phòng thí nghiệm.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ: 1.1 Hóa chất

Thieát bò

Tuû saáy Tuû uû (Incubator) Caân phaân tích Precisa XB 220A Máy đo pH WTW 720

Bộ chiết Soxhlet Máy khuấy từ Máy cô quay chân không Máy đo quang phổ DR 2000 Sắc ký cột pha thường sử dụng với silica gel 60, Merck

2 XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU VÀ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Trái mướp đắng được thu mua tại các chợ ở TP Hồ Chí Minh là những trái lớn, màu xanh đậm, tách lấy hạt và chọn những hạt già.

Xử lý nguyên liệu

Hạt được xử lý enzym bằng cồn 70 o rồi đem sấy khô ở 60 o C đến khi trọng lượng không đổi sau đó đem xay các mẫu nguyên liệu đã sấy khô thành những hạt nhỏ có kích thước khoảng 1 mm

❖ Xác định độ ẩm nguyên liệu

Sấy m(g) mẫu ở 60 o C đến khối lượng không đổi x(g) Độ ẩm mẫu được tính: Độ ẩm (%)= 100% m x m−

Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của hạt mướp đắng

2.3.1 Phương pháp xác định flavonoid [4], [6], [18]

Trong dung dịch, flavonoid tạo kết tủa màu vàng cam hoặc màu đỏ với acetat chì, tạo kết tủa màu xanh lục, đôi khi màu nâu đỏ với FeCl3

Flavonoid được xác định bởi phản ứng Shibata, còn gọi là phản ứng Cyanidin của Willstater Thêm vào trong ethanol dung dịch HCl đậm đặc, bột Mg kim loại Nếu có flavonoid, dung dịch sẽ có màu đỏ nâu

2.3.2 Phương pháp xác định sterol [4], [6], [18], [22]

Không có thuốc thử riêng đặc trưng cho sterol mà chỉ có phản ứng chung cho steroid

Anhydrid acetic 20 ml H2SO4 đậm đặc 1 ml

Cho 1 giọt thuốc thử vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ có màu xanh nhạt, lục, hồng hoặc đỏ bền vững trong một thời gian

Cho vài giọt dung dịch acid tricloacetic 90% vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ xuất hiện màu tím, sau 20 phút chuyển sang màu xanh lơ

Dung dịch tách làm 2 lớp: lớp H2SO4 có màu xanh, lớp CHCl3 có màu nâu đỏ

2.3.3 Phương pháp xác định tanin [6]

- Dung dịch gelatin mặn: Gelatin: 2g

Dung dịch NaCl bão hoà: 10 ml - Dung dịch acetat chì bão hoà cho kết tủa màu vàng nhạt

- Dung dịch FeCl 3 1% trong nước tạo phức màu đen

2.3.4 Phương pháp xác định alkaloid [4], [6], [18]

Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc kết tủa với alkaloid

Dung dịch A: hòa tan 850mg BiNO3 trong 40 ml H2O và 10 ml CH3COOH đđ

Dung dịch B: hoà tan 8g KI trong 20 ml H2O

Khi sử dụng trộn hai thể tích bằng nhau của hai dung dịch A và B lại

Nhận biết: Phản ứng cho kết tủa màu từ vàng cam đến đỏ

Công thức: 1,35g HgCl2 hòa tan trong 100 ml dung dịch KI 5%

Nhận biết: Tạo kết tủa vô định hình màu trắng vàng

Công thức: hoà tan 5g iod trong 100 ml dung dịch KI 10%

Nhận biết: Tạo kết tủa màu nâu sáng đến nâu đen

Công thức: I2 2,5g KI 5g Nước cất 10 ml Nhận biết: Cho kết tủa màu nâu hoặc vàng đậm

2.3.5 Phương pháp xác định saponin [4], [18]

2.3.5.1 Căn cứ vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin:

Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500 ml chứa sẵn 100 ml nước sôi Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đến 100 ml (thu được nước sắc) Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,4,5,… 10 ml nước sắc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 ml Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây Mỗi giây lắc 2 lần Để yên trong 15 phút Sau đó đo chiều cao các cột bọt Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1 cm thì chỉ số bọt là dưới 100, nghĩa là không có saponin

Chỉ số bọt được tính theo công thức: CSB = 100x i

CSB: Chỉ số bọt i : ống nghiệm thứ i có cột bọt cao 1 cm

Thí dụ: bọt ở ống thứ 2 có chiều cao 1 cm Khối lượng này coi như đã pha loãng 100x

210= 500 lần Như vậy bột nguyên liệu có chỉ số tạo bọt bằng 500

Cách thực hiện: hoà tan mẫu bằng 1ml anhydrid acetic, thêm từ từ 0,3–0,5 ml H2SO4

Nếu vòng ngăn cách có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpen

Nếu vòng ngăn cách có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid

Cách thực hiện: hoà tan mẫu bằng 0,5 ml dung dịch SbCl3 bão hoà trong cloroform, khuấy đều, đem soi UV

Nếu có huỳnh quang màu xanh thì sơ bộ nhận định có saponin triterpen

Nếu huỳnh quang màu vàng thì sơ bộ nhận định có saponin steroid

2.3.6 Phương pháp xác định các hợp chất glycosid [6], [18]

Xác định theo đường khử trong glycosid

Công thức: pha 0,5 ml dung dịch AgNO3 10% với 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Sau đó nhỏ từ từ dung dịch NH4OH đến khi tan hết tủa

Nhận biết: có Ag kết tủa

Công thức: nhỏ 1-2 giọt dung dịch thymol 2% vào 1 ml H2SO4 đậm đặc

Nhận biết: xuất hiện màu đỏ thắm

Công thức: pha dung dịch acid picric 1% trong cồn với dung dịch NaOH 10% trong nước theo tỉ lệ thể tích 1:1

Nhận biết: nhỏ 3-4 giọt thuốc thử vào 1mg chất thử, nếu có màu vàng cam hoặc hồng xỉn là phản ứng dương tính

Phản ứng: hòa tan 1mg chất thử trong 2-3 giọt pyridin, thêm 1 giọt dung dịch Natri nitroprussiat 0,5% mới pha, sau đó cho từ từ từng giọt dung dịch KOH 2N vào

Nhận biết: xuất hiện màu đỏ tím.

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG TIỂU ĐƯỜNG THEO CƠ CHẾ ỨC CHEÁ MEN α-GLUCOSIDASE 1 Xây dựng quy trình thử nghiệm 1.1 Dựng đường chuẩn

3.1 Xây dựng quy trình thử nghiệm [32]

Pha các mẫu chuẩn theo bảng dưới Với mỗi mẫu, thực hiện lặp lại 3 lần để lấy kết quả trung bình

Theồ tớch dd PNP 100àM (ml) 0 2 4 6 8 10

Thể tích dd đệm pH = 9.6 (ml) 10 8 6 4 2 0

❖ Kết quả : Đo độ hấp thu A trên máy quang phổ DR 2000 Từ đó dựng đường chuẩn

Vẽ đường biểu diễn giữa độ hấp thu (A) và nồng độ dung dịch chuẩn, từ đó xác định phương trình đường chuẩn

3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất nền

Pha các dung dịch theo bảng sau:

Tác chất Mẫu 0 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Nước khử ion (G) 0,7 ml 0,5 ml 0,3 ml 0,1 ml 0 ml Đệm phosphat (D) 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml

Enzym (C) 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml Ủ ở 37 o C trong 30 phút sau đó thêm PNP – Glc

Theồ tớch 0 ml 0,2 ml 0,4 ml 0,6 ml 0,7 ml

Hỗn hợp trên được lắc thật đều rồi ủ tiếp ở 37 o C trong đúng 20 phút nữa

Lấy 2 ml hỗn hợp, cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 8 ml dung dịch đệm carbonat pH = 9,6; lắc đều rồi đem đo độ hấp thu A ở 400nm

3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym

Pha các dung dịch theo bảng sau

Tác chất Mẫu 0 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Nước khử ion (G) 0,4 ml 0,3 ml 0,2 ml 0,1 ml 0 ml Đệm phosphat (D) 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

Theồ tớch 0 ml 0,1 ml 0,2 ml 0,3 ml 0,4 ml

Nồng độ 0 0,015U 0,03U 0,045U 0,06U Ủ ở 37 o C trong 30 phút sau đó thêm:

Hỗn hợp trên được lắc thật đều rồi ủ tiếp ở 37 o C trong đúng 20 phút nữa

Lấy 2 ml hỗn hợp, cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 8 ml dung dịch đệm carbonat pH = 9,6; lắc đều rồi đem đo độ hấp thu A ở 400 nm

3.1.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng T r

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng gồm:

Tác chất Mẫu trắng Mẫu thử

Nước khử ion (G) 0,4 ml 0,2 ml Đệm phosphat (D) 5,0 ml 5,0 ml

Enzym (C) 0 ml 0.2 ml Ủ ở 37 o C trong 30 phút sau đó thêm:

Hỗn hợp trên được lắc thật đều rồi tiếp tục duy trì ở 37 o C, sau mỗi 5 phút lấy ra đo độ hấp thu A ở 400 nm đến khi A không đổi ở 3 lần đo kế tiếp nhau

3.1.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hoạt hoá T a

Chuẩn bị 7 mẫu tương tự nhau gồm:

Tác chất Mẫu trắng Mẫu thử

Nước khử ion (G) 0,4 ml 0,1 ml Đệm phosphat (D) 5,0 ml 5,0 ml

Mỗi mẫu ủ ở 37 o C trong 0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 phút sau đó thêm:

Mỗi hỗn hợp trên được lắc thật đều rồi ủ tiếp ở 37 o C trong đúng 20 phút nữa Lấy 2 ml hỗn hợp, cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 8 ml dung dịch đệm carbonat pH = 9.6 (E), lắc đều rồi đem đo độ hấp thu A ở 400 nm

3.2 Thử hoạt tính của các cao chiết [23], [24], [25], [32]

3.2.1 Nguyeân taéc p-Nitrophenyl-α-D-Glucopyranoside α -Glucosidase α-D-Glucose + p- nitrophenol (PNP)

Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP Vì vậy có thể đo độ hấp thu của PNP ở 400 nm để xác định lượng glucose sinh ra So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có chất ức chế và mẫu không có chất ức chế để xác định % ức chế Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50 Điều kiện phản ứng: T7 o C, pH = 6,8

- Chuẩn bị các dung dịch thử chuẩn (enzym, chất nền, các dung dịch đệm, chất ức chế…)

- Trộn lẫn các dung dịch gồm: đệm pH = 6,8; enzym; chất ức chế với thể tích đã định trước

- Hoạt hóa hỗn hợp ở 37 o C trong thời gian Ta - Thêm chất nền, duy trì phản ứng ở 37 o C, trong thời gian Tr - Kết thúc phản ứng bằng đệm pH = 9,6

- Đo độ hấp thu A ở 400 nm, xác định chỉ số IC50

3.2.2 Điều chế các mẫu cao từ hạt mướp đắng 3.2.2.1 Sơ đồ chiết cao

Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết các hợp chất trong hạt mướp đắng

Bột hạt mướp đắng khô được đun hoàn lưu với eter petroleum (EP) trong khoảng 2 giờ Sau đó đem lọc thu dịch chiết EP, đem cô quay để loại dung môi

Tiếp tục cho phần bã còn lại sau khi lọc đun tiếp 2 lần nữa với dung môi EP, lọc và cô ở áp suất thấp phần dịch chiết ta được cao H1

Phần bã còn lại tiếp tục đun hoàn lưu 3 lần, mỗi lần 2 giờ với cloroform, lọc lấy dịch chiết và cô quay loại dung môi thu được cao H2 Thực hiện tương tự với ethanol thu được cao H3

- Chieát baèng Soxhlet vôiù 3 lít eter petroleum dung moâi - Lọc, cô chân không loại dung môi (dm)

- Chiết bằng Soxhlet với CHCl3

- Lọc, cô chân không loại dm

- Lọc, cô chân không loại dm

3.2.3 Thử hoạt tính các mẫu cao

Chuẩn bị các dịch chiết H1, H2, H3 có nồng độ 2.95mg/ml tương ứng với nồng độ 100àg/ml trong hỗn hợp phản ứng Pha loóng để cú cỏc nồng độ 75, 50, 25àg/ml Thực hiện đối với mỗi nồng độ của từng loại cao chiết theo bảng sau:

Mẫu trắng Mẫu ức chế

Nước khử ion (G) 0,2 ml 0 ml Đệm phosphat (D) 5,0 ml 5 ml

Chất ức chế (F) có nồng độ Ci 0,2 ml 0,2 ml Ủ ở 37 o C trong 30 phút sau đó thêm:

Hỗn hợp trên được lắc thật đều rồi ủ tiếp ở 37 o C trong đúng 20 phút nữa Lấy 2 ml hỗn hợp, cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 8 ml dung dịch đệm carbonat có pH = 9,6 ; lắc đều rồi đem đo độ hấp thu A ở 400nm.

4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4.1 Chiết tách các hoạt chất của các cao chiết [4], [6]

Cao H1 (50g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với 70g silica gel 60 (70-230 mesh), đường kính cột 4 cm, dung môi sử dụng là hệ EP-Aceton theo tỉ lệ độ phân cực tăng dần cho 20 phân đoạn, mỗi phân đoạn 300 ml Theo dõi cột

Cao H2 (15g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với 50g silica gel 60 (70-230 mesh), đường kính cột 3 cm, dung môi sử dụng là hệ EP-CHCl3-MeOH theo tỉ lệ độ phân cực tăng dần cho 23 phân đoạn, mỗi phân đoạn 250 ml Theo dõi cột bằng sắc ký bản mỏng

4.2 Xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc hóa học được xác định sơ bộ bằng các hằng số vật lý, điểm nóng chảy, chỉ số Rf …Sau đó xác định lại bằng các phương pháp phổ nghiệm.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 1 HIỆU SUẤT THU HỒI SẢN PHẨM 1.1 Độ ẩm của nguyên liệu

Hiệu suất của quá trình chiết

Sau khi chiết và cô quay các dịch chiết ta thu được các loại cao có khối lượng lần lượt là H1 = 42g, H2 = 15g, H3 = 25g

Hiệu suất của quá trình chiết:

42x Tương tự với các loại cao còn lại:

KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HẠT MƯỚP ĐẮNG 1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid

2.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid

2.1.1 Cách tiến hành: Đun hoàn lưu 5g bột hạt mướp đắng trong 50 ml alcol 95% trong 30 phút, và đem lọc

Lấy 1 ml dịch alcol vào ống nghiệm, thêm vài giọt HCl đậm đặc, sau đó cho một ít bột Mg vào và lắc thì thấy có kết tủa màu hồng

2.1.2 Kết quả: Có flavonoid trong bột hạt

2.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất sterol

Hoà tan 1g bột hạt khô trong 20 ml cloroform Đem lọc, dịch lọc dùng làm mẫu thử

- Thuốc thử Liebermann-Burchard: dung dịch từ vàng nhạt chuyển sang xanh luùc

- Thuốc thử Salkowski: thêm 0,5 ml H2SO4 đậm đặc Dung dịch tách làm 2 lớp: lớp H2SO4 có màu xanh và lớp CHCl3 có màu nâu đỏ

2.2.2 Kết quả: có sterol trong bột hạt

2.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin

Lấy 5g bột hạt, thêm 100 ml nước cất rồi đun sôi trong 10 phút Đem lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử:

- Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2-4 giọt dung dịch acetat chì bão hòa thấy xuất hiện tủa màu vàng nhạt

- Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 ml dung dịch FeCl3 1%, dung dịch chuyển thành màu nâu đen

2.3.2 Kết quả : Bột hạt có tanin

2.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alcaloid

Tẩm 10g bột hạt mướp đắng bằng 5 ml NH4OH 25% Đậy kín bằng giấy lọc rồi để qua đêm Sau đó đem chiết với 25 ml CHCl3 Dịch CHCl3 được lắc với 10 ml dung dịch H2SO4 2% Lấy dịch acid làm mẫu thử

Thuốc thử Dragendorff: tạo kết tủa màu cam Thuốc thử Mayer: kết tủa màu trắng đục

2.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin

Cân 1g bột hạt mướp đắng cho vào erlen 500 ml chứa sẵn 100 ml nước sôi

Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa Lọc, để nguội Cho khoảng 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ và lắc mạnh trong 15 giây thì thấy rất nhiều bọt (cột bọt cao tối đa 6 cm)

2.5.2 Kết quả: Hạt mướp đắng có chứa saponin

2.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycosid

Lấy 10g bột hạt mướp đắng khô, loại các chất không phân cực bằng eter petroleum Chiết tiếp bằng dung môi ethanol 50% Dịch lọc ethanol 50% được loại tạp bằng acetat chì cho đến khi không còn trầm hiện Sau đó, loại acetat chì dư bằng Na2SO4 bão hoà Cô cạn dịch lọc được cao glycosid thô Hòa tan cao bằng ethanol 95% và lấy dung dịch này làm mẫu thử

Dùng thuốc thử Tollen: xuất hiệt kết tủa trắng

Dùng thuốc thử Molish: có màu đỏ son

2.6.2 Kết quả : Hạt mướp đắng có glycosid

Bảng 2.1: Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong hạt mướp đắng

TT HỢP CHẤT PHẢN ỨNG

THUỐC THỬ HIỆN TƯỢNG KẾT

1 Flavonoid Mg/HCl ủủ Keỏt tuỷa hoàng +

Salkowski Dung dịch tách làm

- Acetat chì Kết tủa vàng nhạt - Gelatin Keát tuûa traéng +

4 Alkaloid Dragendoff Kết tủa màu cam +

Mayer Kết tủa trắng đục +

+ Thuốc thử Tollens Kết tủa trắng +

3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA CÁC CAO CHIẾT 3.1 Xây dựng quy trình thử hoạt tính

Các mẫu chuẩn được pha thành các dung dịch có nồng độ PNP lần lượt là 0 mM/l; 0,02 mM/l; 0,04 mM/l; 0,06 mM/l; 0,08 mM/l và 0,1 mM/l

Hình 3.1: Dung dịch PNP chuẩn ở các nồng độ Đem đo trên máy quang phổ hấp thu lần lượt các nồng độ dung dịch p-nitrophenol, thu được kết quả như sau:

Bảng 3.1: Độ hấp thu của dung dịch PNP chuẩn ở các nồng độ

Mẫu [PNP] mM/l Độ hấp thu A

[PNP] mM/l A Đồ thị 3.1: Đồ thị đường chuẩn

Từ đồ thị trên ta được phương trình đường chuẩn y = 8,585x

3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất nền

Pha dung dịch chất nền ở các nồng độ khác nhau rồi đem đo độ hấp thu A ở 400nm Kết quả như sau:

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất nền

Mẫu PNP-G (mM) Độ hấp thu A

4 0,12 0,21 ± 0,007 Ảnh hưởng của nồng độ chất nền

0 0.05 0.1 0.15 mM A Đồ thị 3.2: Thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ chất nền đến độ hấp thu

❖ Nhận xét: Độ hấp thu A thay đổi tuyến tính bậc 1 với nồng độ chất nền

Tuy nhiên, nếu sử dụng ở nồng độ cao hơn 0,1mM thì tỉ lệ không còn là tuyến tính bậc 1 Vì vậy chọn nồng độ chất nền là 0,085mM (tương ứng với 0,5 ml) là thích hợp cho quy trình

3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym

Pha dung dịch enzyme ở các nồng độ khác nhau rồi đem đo độ hấp thu A ở 400nm

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym

Mẫu Enzym (U) Độ hấp thu A

4 0,06 0,203 ± 0,003 Ảnh hưởng của nồng độ enzym

U A Đồ thị 3.3: Thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến độ hấp thu

❖ Nhận xét: Độ hấp thu A tăng tuyến tính bậc 1 trong khoảng nồng độ enzym dưới 0,03U/ml (tương ứng với 0,2 ml)

3.1.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng T r

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, sau mỗi 5 phút lấy ra đo độ hấp thu A ở 400 nm đến khi A không đổi hoặc thay đổi không đáng kể ở 3 lần đo kế tiếp nhau

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Thời gian (phút) Độ hấp thu A

40 0,252 ± 0,003 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Phuùt A Đồ thị 3.4: Thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ hấp thu

❖ Nhận xét: Độ hấp thu A tăng tuyến tính bậc 1 trong khoảng 20 phút đầu tiên của phản ứng

3.1.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa T a

Chuẩn bị 7 mẫu dung dịch tương tự nhau, đem ủ với các khoảng thời gian khác nhau, sau đó đem đo độ hấp thu A ở 400 nm

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa

Thời gian (phút) Độ hấp thu A

60 0,23 ± 0,003 Ảnh hưởng của thời gian hoạt hoá

Phuùt A Đồ thị 3.5: Thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa đến độ hấp thu

❖ Nhận xét: thời gian hoạt hóa tốt nhất để quy trình cho kết quả ổn định là

3.2 Kết quả thử hoạt tính của các cao chiết

Sau khi cho ủ các hỗn hợp dung dịch ở 37 o C trong 30 phút và thêm p- nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-Glc) vào, trong thời gian tiếp tục ủ 20 phút nữa thì lượng PNP sinh ra

Cho phản ứng kết thúc bằng cách lấy 2 ml hỗn hợp, cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 8 ml dung dịch đệm carbonat pH = 9,6; lắc đều rồi đem đo độ hấp thu A với λ = 400 nm

Hình 3.2 : Lượng PNP- Glc sinh ra trong dung dịch có chất ức chế là cao H1

Bảng 3.6: Kết quả thử hoạt tính của cao H1

Mẫu Nồng độ (àg/ml) Độ hấp thu A % Ức chế

❖ Nhận xét: Độ hấp thu A của các mẫu có chứa cao H1 lớn hơn so với mẫu trắng nên cao H1 không có hoạt tính ức chế

Hình 3.3 : Lượng PNP- Glc sinh ra trong dung dịch có chất ức chế là cao H2

Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính của cao H2

Mẫu Nồng độ (àg/ml) Độ hấp thu A % Ức chế

❖ Nhận xét: Độ hấp thu A của các mẫu có chứa cao H2 nhỏ hơn so với mẫu trắng nên cao H2 có hoạt tính ức chế

Hình 3.4 : Lượng PNP- Glc sinh ra trong dung dịch có chất ức chế là cao H3

Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính của cao H3

Mẫu Nồng độ (àg/ml) Độ hấp thu A % Ức chế

❖ Nhận xét: Độ hấp thu A của các mẫu có chứa cao H3 nhỏ hơn so với mẫu trắng nên cao H3 có hoạt tính ức chế

Hoạt tính ức chế của H1, H2, H3

H2 H3 Đồ thị 3.6: Thể hiện hoạt tính ức chế của các cao H1, H2, H3

❖ Kết luận: cao H1 không có hoạt tính ức chế men α-glucosidase Cao H2 và H3 cú hoạt tớnh ức chế với IC50 = 62,66àg/ml và IC50 = 31,25àg/ml

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4.1 Điều chế các phân đoạn sắc ký:

Bảng 4.1: Kết quả sắc ký của cao H1

PĐ Dung môi Tỉ lệ Thể tích Kết quả TLC PĐ chính

Vết loang rộng, kéo dài H1-1

Sắc ký cột cao H1 lần thứ nhất thu được 5 phân đoạn chính Các phân đoạn từ 1 đến 4 được xác định là dầu béo; các phân đoạn từ 5 đến 7 để yên nhiều ngày cho kết tinh màu trắng; các phân đoạn từ 14 đến 17 có 4 vết được gộp lại để thực hiện sắc ký cột lần 2, kí hiệu là H1-4

Gạn lấy các tinh thể của phân đọan H1-2 và rửa nhiều lần bằng EP cho đến khi thử trên sắc ký bản mỏng cho 1 vết rõ, ký hiệu là chất 1

4.1.1.2 Sắc ký cột phân đoạn H1-4

Phân đoạn H1-4 (3g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với 30g silica gel 60 (70-230 mesh), đường kính cột 1,5 cm, dung môi sử dụng là hệ EP-Aceton theo tỉ lệ độ phân cực tăng dần cho 17 phân đoạn, mỗi phân đoạn 100 ml Theo dõi cột bằng sắc ký bản mỏng

Bảng 4.2: Kết quả sắc ký của cao H1-4

PĐ Dung môi Tỉ lệ Thể tích Kết quả TLC PĐ chính

Nhiều vết, một vết rõ

Sắc ký cột phân đoạn H1-4 thu được 4 phân đoạn chính Phân đoạn H1-4- 4 có một vết tương đối rõ được thực hiện sắc ký cột tiếp theo để thu chất sạch

4.1.1.3 Sắc ký cột phân đoạn H1-4-4

Phân đoạn H1-4-4 cũng được tinh chế bằng sắc ký cột với loại silica gel trên, khối lượng là 15g, cột sắc ký có đường kính 1,5 cm, hệ dung môi giải ly duy nhất là CHCl3-MeOH 9:1 thu được 15 phân đoạn, mỗi phân đoạn 15ml

Bảng 4.3: Kết quả sắc ký cao H1-4-4

PĐ Dung môi Tỉ lệ Thể tích Kết quả TLC Kí hiệu

9 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml 10 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml

Nhieàu veát 11 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml

12 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml 13 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml 14 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml 15 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml

Sắc ký cột cao H1-4-4 thu được 1 chất sạch kí hiệu là chất 2

Bảng 4.4: Kết quả sắc ký của cao H2

PĐ Dung môi Tỉ lệ Thể tích Kết quả TLC PĐ chính

Sắc ký cột cao H2 lần thứ nhất thu được 6 phân đoạn chính Các phân đoạn từ 10 đến 14 có 2 vết rõ được gộp lại để thực hiện sắc ký cột lần 2 Kí hiệu là H2-4

Sắc ký cột phân đoạn H2-4

Phân đoạn H2-4 cũng được tinh chế bằng sắc ký cột với loại silica gel trên, khối lượng là 10g, cột sắc ký có đường kính 1,5 cm, hệ dung môi giải ly duy nhất là CHCl3-MeOH 9:1 thu được 10 phân đoạn, mỗi phân đoạn 15 ml

Bảng 4.5: Kết quả sắc ký cao H2-4

PĐ Dung môi Tỉ lệ Thể tích Kết quả TLC Kí hiệu

1 veát Chaát 3 7 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml

8 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml 9 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml 10 CHCl3-MeOH 9:1 15 ml

Sắc ký cột cao H2-4 thu được 2 chất sạch kí hiệu là chất 2 và chất 3

4.2 Xác định cấu trúc hóa học