khảo sát hoạt tính kháng tiểu đường của các cao chiết từ hạt mướp đắng theo cơ chế ức chế men α glucosidase

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: SINH HÓA ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG TIỂU ĐƯỜNG CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ HẠT MƯỚP ĐẮNG THEO CƠ CHẾ ỨC CHẾ MEN α- GLUCOSIDASE GV

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH: SINH HÓA

ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG TIỂU ĐƯỜNG CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ HẠT MƯỚP ĐẮNG THEO CƠ CHẾ ỨC CHẾ MEN α- GLUCOSIDASE

GVHD: TH.S PHÙNG VĂN TRUNG SVTH: BÙI NGUYỄN THANH MỸ KHÓA HỌC: 2001- 2005

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

 2005 

LỜI CÁM ƠN

Xin chân thành cám ơn TS Nguyễn Ngọc Hạnh đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện về vật chất lẫn tinh thần giúp tôi hoàn thành luận văn Xin chân thành cám ơn Th.S Phùng Văn Trung đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành luận văn

Xin chân thành cám ơn các Cán bộ của Phòng Hóa học và Công nghệ các hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cám ơn Th.S Nguyễn Minh Hoàng đã góp ý, truyền đạt những kinh nghiệm để tôi hoàn thành luận văn

Xin chân thành cám ơn các thầy cô ở trường ĐH Mở, đặc biệt là các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học đã dạy dỗ và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt những năm qua

Xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè trong lớp SHO1A1 đã động viên, giúp đỡ, và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU 1

PHẦN 2 : TỔNG QUAN 1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY MƯỚP ĐẮNG 1.1 Mô tả 3

2.2.2 Tác dụng dược lý 11

3 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG (ĐÁI THÁO ĐƯỜNG) 3.1 Thống kê sơ bộ về bệnh tiểu đường ở thế giới và Việt Nam 12

3.2 Bệnh tiểu đường 13

3.3 Nguyên nhân phát sinh bệnh tiểu đường 14

4 MEN ∝ -GLUCOSIDASE VÀ PHƯƠNG PHÁP ỨC CHẾ MEN

∝-GLUCOSIDASE TRONG ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƯỜNG

4.1 Sơ lược về enzyme

4.1.1 Vai trò và tác dụng của enzym 18

4.1.2 Enzym α - glucosidase 19

4.2 Vai trò của α - glucosidase trong quá trình hình thành glucose 20

4.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế men α - glucosidase 21

PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU1 HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ: 1.1 Hóa chất 22

1.2 Thiết bị 23

2 XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU VÀ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 2.1 Nguyên liệu 24

2.2 Xử lý nguyên liệu 24

2.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của hạt mướp đắng 24

3. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG TIỂU ĐƯỜNG THEO CƠ CHẾ ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE 3.1 Xây dựng quy trình thử nghiệm 3.1.1 Dựng đường chuẩn 28

3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 29

3.2 Thử hoạt tính của các cao chiết 31

4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4.1 Chiết tách các hoạt chất của các cao chiết 4.1.1 Sắc ký cột cao H1 33

4.1.2 Sắc ký cột cao H2 34

4.2.Xác định thành phần hóa học 34

PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 1 HIỆU SUẤT THU HỒI SẢN PHẨM 1.1 Độ ẩm của nguyên liệu 35

1.2 Hiệu suất của quá trình chiết 35

2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HẠT MƯỚP ĐẮNG 2.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid 36

2.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất sterol 36

2.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin 36

2.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alcaloid 37

2.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin 37

2.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycosid 37

3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA CÁC CAO CHIẾT 3.1 Xây dựng quy trình thử hoạt tính 3.1.1 Phương trình đường chuẩn 39

3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất nền 40

3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym 42

3.1.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng Tr 43

3.1.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa Ta 44

3.2 Kết quả thử hoạt tính của các cao chiết 45

4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

4.1 Điều chế các phân đoạn sắc ký

4.1.2 Sắc ký cột cao H2 52 4.2 Xác định cấu trúc hóa học 54

PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

1 Bảng 2.1: Kết quả định tính các nhóm hợp chất 38 2 Bảng 3.1: Độ hấp thu của dung dịch PNP chuẩn ở các nồng độ 40 3 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất nền 41 4 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym 42 5 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng 43 6 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa 44 7 Bảng 3.6: Kết quả thử hoạt tính của cao H1 46 8 Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính của cao H2 47 9 Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính của cao H3 48 10 Bảng 4.1: Kết quả sắc ký cao H1 49 11 Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cao H1-4 50 12 Bảng 4.3: Kết quả sắc ký cao H1-4-4 51 13 Bảng 4.4: Kết quả sắc ký cao H2 52 14 Bảng 4.5: Kết quả sắc ký cao H2-4 54

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

2 Hình 1.2: Hoa và lá mướp đắng 4

5 Hình 3.1: Dung dịch PNP chuẩn ở các nồng độ 39

6 Hình 3.2: Lượng PNP- Glc sinh ra trong dung dịch có chất ức chế là cao H1 45

7 Hình 3.3: Lượng PNP- Glc sinh ra trong dung dịch có chất ức chế là cao H2 46

8 Hình 3.4: Lượng PNP- Glc sinh ra trong dung dịch có chất ức chế là cao H3 47 9 Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết các hợp chất trong hạt mướp đắng 32

10 Đồ thị 3.1: Đồ thị đường chuẩn 40 11 Đồ thị 3.2: Sự ảnh hưởng của nồng độ chất nền đến độ hấp thu 41 12 Đồ thị 3.3: Sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến độ hấp thu 42 13 Đồ thị 3.4: Sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ hấp

14 Đồ thị 3.5: Sự ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa đến độ hấp thu 44 15 Đồ thị 3.6: Thể hiện hoạt tính ức chế của các cao H1, H2, H3 48 16 Hình 4.1: Sắc kí bản mỏng silicagel của chất 1 55 17 Hình 4.2: Sắc kí bản mỏng silicagel của chất 2 56

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của nền công nghiệp, mức sống của người dân ngày một nâng cao, tỷ lệ người mắc bệnh tiểu đường tăng lên một cách nhanh chóng Đây là một trong các bệnh hiểm nghèo (sau ung thư và tim mạch) có tốc độ phát triển nhanh, gây tỉ lệ tử vong cao Bệnh tiểu đường gây nhiều biến chứng nguy hại đến sức khoẻ và khả năng lao động của con người

Do tiến bộ về điều trị, trình độ nhận thức của người dân được nâng cao cho nên đời sống của bệnh nhân tiểu đường được kéo dài rõ rệt, nhưng đã tạo điều kiện cho các biến chứng mãn tính phát triển, đáng chú ý nhất là biến chứng mạch máu - nguyên nhân chính gây tử vong ở bệnh nhân bị bệnh tiểu đường [8]

Mặc dù cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu nguyên nhân phát bệnh cũng như thuốc để điều trị nhưng các nhà khoa học vẫn nỗ lực tìm kiếm những phương thuốc hữu hiệu, ít tác dụng phụ hơn Nếu không có biện pháp ngăn ngừa tích cực thì tiểu đường cùng các biến chứng của bệnh sẽ là gánh nặng cho từng gia đình và cả xã hội [5], [7]

Cho đến nay, ngoài việc tiêm bổ sung insulin thường xuyên đối với bệnh nhân tiểu đường type 1, đã có nhiều loại thuốc để điều trị bệnh nhân tiểu đường type 2 và được chia thành 3 nhóm, trong đó nhóm ức chế men α - glucosidase là nhóm thuốc được sử dụng khá phổ biến, được lựa chọn ưu tiên do không có tác dụng hạ đường huyết trên cơ địa bình thường mà chỉ có hiệu lực làm hạ đường huyết gia tăng sau khi ăn Nhóm thuốc này thường được sử dụng phối hợp với chế độ ăn uống và vận động Thuốc không có tác dụng kích thích tế bào β tụy tạng cũng như không cải thiện chức năng insulin mà chỉ có tác dụng làm chậm sự hấp thu cacbonhydrate ở ruột

Loại thuốc có tác dụng ức chế men α-glucosidase phổ biến hiện nay là Acarbose và Miglitol Tuy nhiên, nhóm thuốc này thường gây đầy hơi và tiêu chảy sau khi sử dụng Trong y học cổ truyền nước ta và một số nước khác, trái mướp đắng được xem như là một vị thuốc trị tiểu đường rất hữu hiệu

2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hạt mướp đắng

Phương pháp thử hoạt tính kháng tiểu đường theo cơ chế ức chế men α - glucosidase

3 GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI

Điều chế các cao chiết từ hạt mướp đắng bằng các dung môi

Khảo sát hoạt tính kháng tiểu đường của các cao chiết từ hạt mướp đắng theo cơ chế ức chế men α-glucosidase và đưa ra các giá trị IC50.

Cô lập các chất từ cao chiết có hoạt tính và xác định cấu trúc hóa học

PHAÀN 2: TOÅNG QUAN

1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY MƯỚP ĐẮNG

- Tên khoa học: Momordica charantia L

- Tên khác: Khổ qua, lương qua, cẩm lệ chi - Họ: Bầu bí (Cucurbitaceae)

1.1 Mô tả:

Cây mướp đắng thuộc loại dây leo bằng tua cuốn đơn, mảnh Thân có cạnh Lá mọc so le, chia 5- 7 thùy, mép khía răng, gân lá nổi rõ ở mặt dưới, phiến lá có lông ngắn

Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá, có cuống dài, màu vàng nhạt, hoa đơn tính cùng gốc; hoa đực có đài và ống rất ngắn, chia 5 thùy màu vàng nhạt, tràng 5 cánh mỏng hình bầu dục, bao phấn cong hình chữ S, hoa cái có đài và tràng giống hoa đực

Quả hình thoi dài, gốc và đầu thon nhọn, mặt ngoài có nhiều u lồi không bằng nhau, khi chín màu vàng hồng [1]

Hạt mướp đắng dẹt, hình răng ngựa, thắt đột ngột ở hai đầu Vỏ hạt cứng, màu nâu vàng hay nâu nhạt, có nốt sần nhỏ và có nếp nhăn ở cả hai mặt Kích thước thay đổi tùy theo từng giống: dài 6 - 13 mm, rộng 4 - 8 mm, dày 1,5 - 2,5 mm [2]

Mùa hoa: tháng 2 - 4; mùa quả: tháng 5 - 6 Mướp đắng có 2 loại:

- Momordica charantia L var charantia L., quả to

- Momordica charantia L var abreviata Ser., quả nhỏ [3]

Hình 1.1: Trái mướp đắng

Hình 1.3: Giàn mướp đắng

Hình 1.4: Hạt mướp đắng

1.2 Phân bố [3]

Mướp đắng được phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp các châu lục Mướp đắng được trồng lần đầu tiên từ thời xa xưa ở Ấn Độ, Nam Trung Quốc và châu Phi, sau đó cây được du nhập sang châu Mỹ Quần thể mướp đắng trồng đã trở nên rất phong phú với các giống cây đa dạng được tạo ra trong quá trình chọn giống và lai tạo

Ở Việt Nam, mướp đắng được trồng ở hầu hết các tỉnh từ đồng bằng đến trung du và miền núi Ở một số vùng núi cao lạnh như Sa Pa (Lào Cai), Phó Bảng (Hà Giang)…không thấy có mướp đắng

Trên thế giới, mướp đắng cũng có mặt ở hầu hết các nước nhiệt đới từ châu Phi, sang châu Á và châu Mỹ Cây có biên độ sinh thái tương đối rộng, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng từ 20 đến 240C hoặc cao hơn Lượng mưa hàng năm từ dưới 2000 mm đến 2400 mm Cây sinh trưởng nhanh trong mùa mưa ẩm, ra hoa quả sau 7 - 8 tuần gieo trồng Hoa thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng Sau khi quả già, cây tàn lụi và kết thúc vòng đời sau 4 – 5 tháng tồn tại

1.3 Công dụng chữa bệnh của các bộ phận của cây mướp đắng trong dân gian

Hầu hết các bộ phận của cây như rễ, thân, lá, hoa, trái, hạt đều có thể dùng làm thuốc chữa bệnh [1]

1.3.1 Rễ

Rễ mướp đắng tươi, sắc nước uống, mỗi ngày một thang, từ 1000 ml nước với 60g rễ mướp đắng tươi, sắc còn 400 ml, chia làm 2-3 lần uống, có thể áp dụng cho mọi dạng bệnh Tại Ấn Độ, dịch rễ (cũng như lá, trái) mướp đắng được dùng trị bệnh tiểu đường, do có tác dụng làm giảm đường huyết Rễ mướp đắng

1.3.4 Hoa

Hoa mướp đắng được dùng để chữa đau dạ dày, lỵ cấp tính Hoa còn là một

thành phần trong bài thuốc trị hen [1]

1.3.5 Trái

Trái còn xanh có vị đắng, khi chín thì ít đắng hơn Trái mướp đắng có tính

hàn (mát), không độc Trái xanh có tính giải nhiệt, làm tiêu đờm, nhuận trường, bổ thận, bớt mệt mỏi, giảm stress, xoa dịu thần kinh, giải độc, lợi tiểu, làm bớt đau khớp Khi chín mướp đắng có tính bổ thận, dưỡng huyết, diệt giun (sán, lãi) Ở Trung Quốc, trái mướp đắng còn dùng để trị đột quị tim, bệnh sốt, khô miệng, viêm họng Ở Ấn Độ, dịch trái mướp đắng được dùng trị rắn cắn Người ta còn dùng bột trái mướp đắng để hàn các vết thương (làm kéo da non), vết loét ác tính Ở Thái Lan, dịch trái được dùng trị bệnh về gan và lá lách [7]

Với tính diệt khuẩn và chống oxi hóa, trái mướp đắng làm da mịn màng, trị mụn trứng cá hay bệnh vẩy nến và ngay cả với những vết thương do côn trùng cắn, nhiễm trùng da Mặt khác, trái mướp đắng còn cung cấp nguồn năng lượng dồi dào và tăng khả năng chịu đựng cho cơ thể [2]

Ngoài công dụng làm rau ăn, trái mướp đắng còn được dùng để trị nhiều

mỗi lần rất ít), trị sáng mắt, mắt đỏ đau nhức, bổ tim, bổ máu, mát gan, phù thủng do gan nóng, đau lá lách, giải nhiệt, hồi hộp, buồn phiền, tắm cho trẻ em, trị rôm sảy, làm hạ đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 (không phụ thuộc insulin) [5],[8]

1.3.6 Hạt (Hột)

Hạt có chất béo, vị đắng, hơi ngọt, tính ấm, thanh nhiệt, giải độâc, giải cảm, trị ho, lợi tiểu Hạt còn chữa rắn cắn, chữa nhọt độc sưng tấy, vết thương nhiễm trùng, hạ sốt [7],[9] và chống thụ thai [17] Ở tại nhiều nước, hạt mướp đắng được dùng để trị bệnh tiểu đường [2],[11]

Ngoài ra, theo một số nghiên cứu gần đây, cho biết các hoạt chất trong hạt mướp đắng còn có tác dụng chống ung thư, làm hạ huyết áp, [5]

2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÂY MƯỚP ĐẮNG

2.1 Các nghiên cứu trong nước:

Về thành phần hóa học: Các tác giả Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Phùng Văn Trung ở Viện Công nghệ Hóa học đã chiết tách được từ hạt già mướp đắng hai hợp chất Momordicosid A và Momordicosid B và từ trái mướp đắng bốn hợp chất Momordicosid K, L, 3-O-[β-D-glucopyranosyl]- stigmasta-5,25(27)-diene và 23-O-β-D-allopyranosyl 5,19-epoxycucurbita-6,24-

dien-3β,22,23-triol 3-O-β-D-allopyranoside được đặt tên là charantinoside [20]

Các tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng và Lê Minh Phương của Viện Dược liệu Hà Nội đã thống kê và khảo sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của

cây mướp đắng và khảo sát tác dụng hạ đường huyết của của dịch chiết glycosid

trong trái mướp đắng trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng aloxan [15]

Về tác dụng dược lí, nhóm tác giả trên đã chứng minh nhóm các glycosid có khả năng làm giảm 40,28% mức tăng đường huyết đối với thỏ gây đái tháo đường bằng aloxan Tuy nhiên, ở cao cồn 40o có tác dụng làm giảm đường huyết tới 70,47% mức tăng của đường huyết so với lô đối chứng Điều này cho phép các tác giả trên giả thiết rằng trong trái còn có những thành phần mà bản thân nó tuy không có hoạt tính gây hạ đường huyết nhưng có tác dụng bổ trợ làm tăng hoạt tính gây hạ đường huyết của glycosid [15]

2.2 Các nghiên cứu trên thế giới

2.2.1 Thành phần hóa học

2.2.1.1 Quả mướp đắng [3], [31]

- Các glucosid triterpenic: charantin và hỗn hợp các chất thuộc nhóm stigmastadienol, các glucosid đắng là momordicosid K và L, các glucosid không đắng là momordicosid F1, F2, I, G

- Các glucosylsterol - Các protein

- Các acid amin như: acid aspartic, threonin, serin, acid glutamic, prolin, alanin, glycin, valin, cystein, methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, histidin, lysin và arginin

- Các lipit 0,76% (theo trọng lượng khô)

- Các sắc tố, chủ yếu là lycopen, hàm lượng thay đổi theo kích thước và độ chín của quả

- Các hợp chất thuộc nhóm saponin như: Goyasaponin I, II, III - Các vitamin B1, B2, PP, E, β-caroten

- Các chất khoáng như Ca, Mg, Fe, Cu, Zn… - Các alcol bậc nhất, các aldehyd

- Chất dẫn dụ côn trùng là [1-O-(β galactopyranosyl)- 2-3-di-O-linolenoyl x glycerol], [6- linolenogl β-D-glucopyranosyl (1-3) β clerosterol

2.2.1.2 Hạt mướp đắng [3], [26], [27]

- Các glucosid

- β-D-glucosid của β sitosterol

- Các terpen glucosid: Momordicosid A, B, C, D, E - Các polypeptid – lectin:

- Các chất acid béo như: Acid palmitic, Acid stearic, Acid oleic, Acid linoleic, Acid arachidic, Acid oleostearic… trong đó acid stearic và acid oleostearic chiếm phần lớn, các acid béo khác chiếm tỉ lệ không đáng kể

2.2.1.3 Lá và thân mướp đắng [29], [30]

- Momordicin I, II, III - Các sterol và chitinase

- Các cucurbitan triterpenoid I, II, III

- Calceolariosid E là một phenylpropanoid glucosid

2.2.2 Tác dụng dược lý

Cao cồn mướp đắng cho chuột cống trắng uống 500 mg/kg làm giảm mức glucose 6% sau 2 giờ ở chuột bình thường và 26% sau 3,5 giờ ở chuột gây tiểu đường với streptozotocin

Cao nước quả mướp đắng khi cho chuột cống trắng đã được gây tăng đường máu với aloxan (120 mg aloxan/kg tiêm dưới da) uống hàng ngày trong hai tháng làm chậm sự xuất hiện bệnh võng mạc

Dịch ép quả mướp đắng có tác dụng loại bỏ những gốc superoxyd và hydroxyl Những gốc chứa oxy này có liên quan đến bệnh tiểu đường, tác dụng chống tiểu đường của mướp đắng có thể một phần do cơ chế này Một số nghiên cứu cho thấy hạt mướp đắng cũng có những hoạt chất gây hạ đường máu [3]

Cao thô từ mướp đắng có hoạt tính chống ung thư có ý nghĩa đối với nhiều loại tế bào ung thư ở chuột nhắt trắng với liều tối ưu 8 µg protein tiêm phúc mạc

MAP 30, một protein kháng siêu vi khuẩn, có thể ức chế nhiễm siêu vi khuẩn HIV – 1 ở tế bào lympho T và bạch cầu đơn nhân to, nó không độc với tế bào bình thường không bị nhiễm [3]

Hạt và vỏ quả mướp đắng chứa một chất nhựa, một saponin glycosid, và những alcaloid gây nôn và tiêu chảy Nhiều protein có hoạt tính dược lý được phân lập từ mướp đắng Các protein α – momorcharin và β – momorcharin từ hạt của mướp đắng có tác dụng độc hại gan trên tế bào gan chuột cô lập [3]

Ở Trung Quốc, người ta đã phân tách được hai hoạt chất có tác dụng hạn chế sinh sản là α – protein và β – protein từ hạt mướp đắng Các thí nghiệm nuôi

cấy, ghép phôi in vitro cho thấy α –, β – protein hạt mướp đắng có tác dụng ức chế quá trình làm dày đặc nguyên bào phôi trước khi làm tổ và hình thành phôi

ở thai kỳ đầu, từ đó phôi ngừng phát triển, thoái hóa phân hủy dẫn đến sẩy thai Những nghiên cứu gần đây cho thấy α – protein và β – protein mướp đắng cũng có ảnh hưởng đến sự sinh sản của phôi chuột nhắt trắng và ảnh hưởng đến việc tổng hợp phân tử lớn tế bào nội mô tử cung; chúng cũng có khả năng ức chế tổng hợp ADN, ARN và protein, làm cho sự phát triển của nội mạc tử cung bị ức chế

Phân tích cơ chế tác dụng chống thụ thai của α – protein và β – protein hạt mướp đắng ta thấy ngay là ở thai kỳ đầu của động vật mang thai protein này tác động trực tiếp lên tế bào phôi và tế bào nội mạc tử cung ở các giai đoạn phát triển khác nhau, làm chúng không thể phát triển và làm tổ bình thường, nên bị sẩy thai [17]

3 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG (ĐÁI THÁO ĐƯỜNG)

3.1 Thống kê sơ bộ về bệnh tiểu đường ở thế giới và Việt Nam

- Theo công bố của WHO năm 1985 có khoảng 30 triệu người mắc bệnh tiểu đường, năm 1994 có 98,9 triệu Theo ước tính của Viện nghiên cứu tiểu đường quốc tế thì năm 2010 có khoảng 215,6 triệu người bị tiểu đường

- Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường ở Singapore 1975 là 1,9%; 1985 là 4,7%; 1992 là 8,6%, Pháp là 1,4%, Châu Âu là 3%, Philippin là 4,27%, Thái Lan là 3,58%, Malaysia là 3,01% Theo công bố tại Hội nghị tiểu đường 12/1997 tại Singapore số người mắc bệnh tiểu đường ở một số quốc gia tiêu biểu như: Ấn Độ có 19,4 triệu, Nga có 8,9 triệu, Trung Quốc có 16 triệu, Mĩ có 13,9 triệu, Nhật có 6,3 triệu [13], [14] Giữa những chủng tộc người khác nhau cũng có sự khác biệt, tỉ lệ người mắc bệnh ở thành thị cao hơn nông thôn [16]

- Tại Việt Nam: Hiện chưa thống kê được tỷ lệ tiểu đường toàn quốc mà mới chỉ tiến hành điều tra ở một số thành phố lớn Các tác giả Lê Huy Liệu, Mai Thế Trạch cho thấy tỷ lệ tiểu đường ở Hà Nội là 1,1% (1990-1991) ở Thành phố Hồ Chí Minh là 2,8% (1992-1993), Huế là 0,98% (1980) ở Hải Phòng là 0,3% dân số [13], [14]

3.2 Bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường là một loại bệnh mãn tính do rối loạn sự trao đổi đường glucose, protein và mỡ trong cơ thể Đây là một trong những loại bệnh thường gặp nhất trong các chứng bệnh nội tiết Đặc trưng của nó là lượng đường trong máu quá cao và trong nước tiểu có đường Khi đường trong máu quá cao thì có triệu chứng bệnh 3 nhiều 1 ít, tức là uống nhiều, tiểu nhiều, ăn nhiều và giảm thể trọng Ngoài ra còn có tình trạng mệt mỏi, không có sức lực và tinh thần không phấn chấn Khi nghiêm trọng có thể sinh ra trúng độc acid thể ceton

Bệnh tiểu đường tính thẩm thấu cao, chứng không ceton gây hôn mê và có thể kèm theo các loại bệnh nhiễm trùng Người bệnh lâu năm có thể sinh ra biến chứng bệnh lý như xơ vữa động mạch, bệnh thần kinh, thận và võng mạc mắt [16]

Người ta chia bệnh tiểu đường thành 2 loại:

- Loại 1: Phụ thuộc hoàn toàn vào insulin Nguyên nhân là do tuyến tụy không sản xuất được insulin vì thế người bệnh phải được điều trị bằng cách tiêm bổ sung insulin thường xuyên

- Loại 2: Không phụ thuộc vào insulin Đây là nhóm bệnh phổ biến, chiếm hơn 90% bệnh nhân tiểu đường Nguyên nhân là do tuyến tụy không sản xuất đủ insulin hoặc insulin bị giảm chức năng vận chuyển glucose vào trong tế bào, làm

cho glucose bị ứ lại và tăng lên ở trong máu

Có 3 rối loạn chính tạo ra sự bất dung nạp glucose trong bệnh tiểu đường không phụ thuộc vào insulin Đó là sự rối loạn bài tiết insulin của tụy tạng, sự sản xuất glucose ở gan không bị ức chế, sự đề kháng với tác dụng của insulin của các mô ví dụ như mô cơ [12]

Lờn insulin và không dung nạp glucose là giai đoạn khởi đầu của bệnh tiểu đường loại 2 Tụy tạng vẫn tiết đủ insulin nhưng chất này không phát huy được tác dụng [21]

3.3 Nguyên nhân phát sinh bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường có thể phân làm 2 loại: tính nguyên phát và thứ phát Bệnh tiểu đường tính nguyên phát còn chưa rõ nguyên nhân Người ta cho rằng bệnh tiểu đường tính nguyên phát là một loại bệnh di truyền, rất có thể trong tương lai tìm ra nguyên nhân gây bệnh đối với một số bệnh nhân, và sẽ xếp họ vào loại bệnh thứ phát Nguyên nhân bệnh tiểu đường thứ phát thường gặp nhất là do bị cắt bỏ toàn bộ tụy (lá lách), viêm tuyến tụy mãn tính và bệnh tiểu đường do một số bệnh nội tiết gây ra [16]

Sau bữa ăn, glucose vào máu nhiều, gan tồn trữ glucose dưới dạng glycogen Hàm lượng glycogen trong gan phụ thuộc vào lượng thức ăn chứa glucid và ở người có thể lên đến 150g Một lượng glycogen có thể hình thành từ sản phẩm phân giải protein Sự hình thành glycogen trong gan có ý nghĩa rất lớn đối với cơ thể Khi đói, glucose huyết thấp, gan thủy phân glycogen để phóng thích glucose nhằm ổn định glucose huyết Nói cách khác, gan là kho an toàn, gan thực hiện dưới sự chỉ đạo của insulin (và một vài nội tiết tố khác)

Bình thường Sau bữa ăn

Glucose ở ruột Glucose huyết

Khi đói

Glycogen ở gan

Khi bị bệnh tiểu đường, gan chẳng những không tích trữ glucose dưới dạng glycogen mà còn thủy phân glycogen để phóng thích glucose, hậu quả là glucose huyết cao lúc no cũng như lúc đói [20]

Tiểu đường Sau bữa ăn

Glucose ở ruột Glucose huyết

Dù no hay đói Glycogen ở gan

3.4 Hóa dược trị tiểu đường [20]

3.4.1 Ức chế α - glucosidase: Acarbose và Miglitol

Dùng cho bệnh nhân tiểu đường loại 2

Cơ chế: Acarbose và Miglitol ức chế men α - glucosidase trong ruột khiến các polysaccharid (tinh bột, đường mía saccharose ) chậm thủy phân thành glucose, kết quả là glucose vào máu từ từ nên glucose huyết không tăng nhiều sau bữa ăn

Không dùng thuốc Dùng thuốc

Cơ chế: Nhóm Sulfonylurea này có tác dụng kích thích tế bào β tuyến tụy tiết ra insulin Sulfonylurea chỉ tăng tiết insulin chứ không liên quan đến tổng hợp chất này Đối với bệnh tiểu đường loại 1, tế bào β bị thoái hóa nên Sulfonylurea không công hiệu

3.4.3 Nhóm Repaglinid:

Repaglinid là một nhóm riêng khác với Sulfonylurea

Repaglinid cũng có tác dụng kích thích tế bào β tuyến tụy tiết ra insulin giống như Sulfonylurea

So với Sulfonylurea, nó có tác dụng nhanh hơn nhưng ngắn hơn Do Repaglinid có nhiều tính năng giống Sulfonylurea nên ít dùng

3.4.4 Meformin (nhóm Biguanid)

Giúp giảm đường huyết theo 3 cách: Một là giúp cơ thể sử dụng insulin

hiệu quả hơn, hai là làm cơ thể giảm tiết đường và ba là làm giảm hấp thu đường từ thức ăn

Dùng cho bệnh nhân tiểu đường loại 2 mà ăn kiêng và thay đổi nếp sống vẫn không khống chế được glucose huyết

Cơ chế: Meformin ức chế sự thủy phân glycogen thành glucose ở gan, giảm hấp thụ glucose ở ruột và cải thiện độ cảm nhận insulin ở cơ quan ngoại vi (tăng hấp thụ và sử dụng glucose ở ngoại vi)

Meformin không làm tăng tiết insulin mà chỉ tăng khả năng dùng insulin

glucose không tăng khi no glucose không tăng khi đói

Kết hợp Meformin và Sulfonylurea làm tăng tác dụng Sulfonylurea + Meformin tăng tiết insulin tăng hiệu lực insulin

Glucose ở ruột

Glycogen Sulfonylurea ở gan

Tế bào β của tụy tạng Meformin tiết insulin

(ứùc chế sinh glucose) (giảm glucose huyết) Glucose huyết

Kết hợp Meformin và Acarbose : cả hai cùng ức chế hấp thụ glucose ở ruột nghĩa là làm giảm dao động glucose sau bữa ăn, Meformin lại làm giảm glucose huyết khi đói do ức chế gan thủy phân glycogen Như vậy glucose không dao động khi no cũng như khi đói: đó chính là nguyên tắc mới điều trị tiểu đường

3.4.5 Nhóm thiazolidinedion

Gồm 2 thuốc là Troglitazon và Rosiglitazon: Tác dụng của thuốc là làm tăng việc sử dụng glucose ở mô ngoại biên (mô mỡ, cơ) dưới tác dụng của insulin (tức là làm tăng độ nhạy của mô với insulin)

Có độc tính gan cao

3.4.6 Insulin (chỉ tiêm, không uống)

Bệnh nhân tiểu đường loại 1 do tế bào β của tụy tạng suy thoái

Bệnh nhân tiểu đường loại 2 mãn tính, thuốc uống không hiệu nghiệm Trị các biến chứng acidoz, thẩm áp cao…

4 MEN ∝ -GLUCOSIDASE VÀ PHƯƠNG PHÁP ỨC CHẾ MEN ∝-GLUCOSIDASE TRONG ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƯỜNG

4.1 Sơ lược về enzyme

4.1.1 Vai trò và tác dụng của enzym [18]

Enzym là những protein đóng vai trò là chất xúc tác, tăng cường tốc độ các phản ứng hóa học bằng cách tương tác trực tiếp với chất tham gia phản ứng, trong đó chúng không hề bị biến đổi thành phần, vì vậy enzym được sử dụng nhiều lần

Enzym xúc tác các phản ứng bằng cách đầu tiên liên kết với cơ chất (chất tham gia phản ứng) ở vùng trung tâm hoạt tính, tiếp theo các liên kết giữa các

chất tham gia phản ứng bị bẻ gãy và được thành lập, và cuối cùng các sản phẩm được giải phóng khỏi enzym

Enzym + cơ chất

Phức hệ enzym - cơ chất

Enzym + sản phẩm

Sau khi sản phẩm được giải phóng, enzym lại được tái sử dụng, enzym là chất xúc tác có tính đặc thù đối với các phân tử và phản ứng nhất định Vì vậy ở cơ thể người có đến hàng nghìn phản ứng sẽ có đến hàng nghìn enzym đặc thù khác nhau

4.1.2 Enzym α - glucosidase

Mã số: EC 3.2.1.20 Tên khác: maltase

glucoinvertase glucosidosucrase maltase-glucoamylase α -glucopyranosidase glucosidoinvertase α -D-glucosidase α -glucoside hydrolase α -1,4-glucosidase

Nhóm: Hydrolaza Nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân

4.2 Vai trò của α - glucosidase trong quá trình hình thành glucose

Maltose (Glucose + Glucose)

Mạch máu

Dưới tác dụng của men amylase, tinh bột (kết hợp với nhiều phân tử đường glucose) sẽ bị thủy phân thành maltose (gồm 2 phân tử đường glucose) Sau đó, với sự xúc tác của men α - glucosidase, đường maltose sẽ tiếp tục bị thủy phân thành đường glucose Đường glucose này sẽ được hấp thụ vào mạch máu trong cơ thể con người và trở thành glucose huyết cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động sống

Tinh bột (Glucose + Fructose) Sucrose

Nhưng với sự xuất hiện của một chất ức chế nào đó, men α - glucosidase sẽ hạn chế hoạt động, quá trình thủy phân maltose diễn ra chậm vì vậy hàm lượng glucose không tăng mạnh sau khi ăn

4.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế men α- glucosidase [23], [28]

Phương pháp ức chế men α-glucosidase trong điều trị tiểu đường loại 2 là phương pháp được ưu tiên sử dụng vì có cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hoá đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào β tuỵ tạng… như các phương pháp khác

Phương pháp in vitro để khảo hoạt tính ức chế men α-glucosidase dựa

trên nguyên tắc: men α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt nối này để giải phóng đường D-glucose Hoạt động này sản sinh ra nhiều glucose sau khi ăn và làm gia tăng hàm lượng glucose trong máu, do đó cần ức chế hoạt động của men α-glucosidase để làm chậm sự chuyển hoá một số loại thức ăn thành glucose Vì vậy, người ta sử dụng các chất nền có liên kết α với đường D-

glucose như: p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, maltose… để xây dựng phương

pháp thử hoạt tính ức chế men α-glucosidase trong phòng thí nghiệm

PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ:

Men α - glucosidase (Sigma, USA) p – nitrophenol chuẩn (Merck, Germany)

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (Merck, Germany)

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn:

⮚ Dung dịch đệm xúc tác pH=6,8 (Prolabo, France)

Dung dịch NaOH 0,2M: Cân 4g NaOH cho vào trong 500 ml nước cất Dung dịch KH2PO4 0,2M: Cân 13,6g KH2PO4 cho vào trong 500 ml nước cất

Lấy 236,5 ml NaOH 0,2M cho vào 500 ml KH2PO4 0,2M ta được dung dịch đệm pH= 6,8

⮚ Dung dịch đệm ngừng phản ứng pH =9,6 (Prolabo, France)

Dung dịch NaHCO3 0,2M: Cân 8,4g NaHCO3 cho vào 500 ml nước cất

Lấy 170 ml NaHCO3 0,2M và 80 ml Na2CO3 0,2M cho vào 250 ml nước cất ta được dung dịch đệm pH=9,6

⮚ Dung dịch p - nitrophenol (PNP) chuẩn 100µM (Merck, Germany)

Cân 0,0695g p-nitrophenol (PNP) cho vào 100 ml dung dịch đệm pH=9,6 được dung dịch PNP 5 mM

Lấy 1 ml dung dịch PNP 5 mM cho vào 49 ml dung dịch đệm pH=9,6 thu được 50 ml dung dịch PNP 0,1 mM

Pha loãng dung dịch PNP 0,1 mM thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là 0,02 mM; 0,04 mM; 0,06 mM và 0,08 mM

⮚ Dung dịch p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-Glc) 1mM (pha trong nước khử ion) (Merck)

⮚ α - glucosodase (α-glc) 0,9 U/ml (pha trong nước khử ion lạnh) (Sigma) ⮚ Cao chiết 2950µg/ml (pha trong nước khử ion hoặc dung môi hữu cơ)

1.2 Thiết bị

Tủ sấy

Tủ ủ (Incubator)

Cân phân tích Precisa XB 220A Máy đo pH WTW 720

Bộ chiết Soxhlet Máy khuấy từ

Máy cô quay chân không Máy đo quang phổ DR 2000

Sắc ký cột pha thường sử dụng với silica gel 60, Merck

2 XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU VÀ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

2.1 Nguyên liệu:

Trái mướp đắng được thu mua tại các chợ ở TP Hồ Chí Minh là những trái lớn, màu xanh đậm, tách lấy hạt và chọn những hạt già

2.2 Xử lý nguyên liệu

Hạt được xử lý enzym bằng cồn 70o rồi đem sấy khô ở 60oC đến khi trọng lượng không đổi sau đó đem xay các mẫu nguyên liệu đã sấy khô thành những hạt nhỏ có kích thước khoảng 1 mm

❖ Xác định độ ẩm nguyên liệu

Sấy m(g) mẫu ở 60oC đến khối lượng không đổi x(g) Độ ẩm mẫu được tính:

Độ ẩm (%)= 100%

2.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của hạt mướp đắng

2.3.1 Phương pháp xác định flavonoid [4], [6], [18]

Trong dung dịch, flavonoid tạo kết tủa màu vàng cam hoặc màu đỏ với acetat chì, tạo kết tủa màu xanh lục, đôi khi màu nâu đỏ với FeCl3

Flavonoid được xác định bởi phản ứng Shibata, còn gọi là phản ứng Cyanidin của Willstater Thêm vào trong ethanol dung dịch HCl đậm đặc, bột Mg kim loại Nếu có flavonoid, dung dịch sẽ có màu đỏ nâu

2.3.2 Phương pháp xác định sterol [4], [6], [18], [22]

Không có thuốc thử riêng đặc trưng cho sterol mà chỉ có phản ứng chung cho steroid

2.3.2.1 Phản ứng Liebermann-Burchard:

Anhydrid acetic 20 ml H2SO4 đậm đặc 1 ml

Cho 1 giọt thuốc thử vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ có màu xanh nhạt, lục, hồng hoặc đỏ bền vững trong một thời gian

2.3.2.2 Phản ứng Rosenheim:

Cho vài giọt dung dịch acid tricloacetic 90% vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ xuất hiện màu tím, sau 20 phút chuyển sang màu xanh lơ

2.3.2.3 Salkowski:

Dung dịch tách làm 2 lớp: lớp H2SO4 có màu xanh, lớp CHCl3 có màu nâu đỏ

2.3.3 Phương pháp xác định tanin [6]

2.3.4 Phương pháp xác định alkaloid [4], [6], [18]

Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc kết tủa với alkaloid

Công thức: I2 2,5g KI 5g Nước cất 10 ml

Nhận biết: Cho kết tủa màu nâu hoặc vàng đậm

2.3.5 Phương pháp xác định saponin [4], [18]

2.3.5.1 Căn cứ vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin:

Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500 ml chứa sẵn 100 ml nước sôi Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đến 100 ml (thu được nước sắc) Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,4,5,… 10 ml nước sắc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 ml Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây Mỗi giây lắc 2 lần Để yên trong 15 phút Sau đó đo chiều cao các cột bọt Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1 cm thì chỉ số bọt là dưới 100, nghĩa là không có saponin

Chỉ số bọt được tính theo công thức: CSB = 100x

10 CSB: Chỉ số bọt

i : ống nghiệm thứ i có cột bọt cao 1 cm

Thí dụ: bọt ở ống thứ 2 có chiều cao 1 cm Khối lượng này coi như đã pha

loãng 100x2

10= 500 lần Như vậy bột nguyên liệu có chỉ số tạo bọt bằng 500