Đánh giá hoạt tính kháng tiểu đường của cao chiết hạt mướp đắng thông qua ức chế men α-glucosidase

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Phương pháp thử hoạt tính kháng tiểu đường theo cơ chế ức chế men α - glucosidase.

TOÅNG QUAN

• SƠ LƯỢC VỀ CÂY MƯỚP ĐẮNG
• CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÂY MƯỚP ĐẮNG 1. Các nghiên cứu trong nước

Về thành phần hóa học: Các tác giả Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Phùng Văn Trung ở Viện Công nghệ Hóa học đã chiết tách được từ hạt già mướp đắng hai hợp chất Momordicosid A và Momordicosid B và từ trái mướp đắng bốn hợp chất Momordicosid K, L, 3-O-[β-D-glucopyranosyl]- stigmasta-5,25(27)-diene và 23-O-β-D-allopyranosyl 5,19-epoxycucurbita-6,24- dien-3β,22,23-triol 3-O-β-D-allopyranoside được đặt tên là charantinoside [20]. Các tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng và Lê Minh Phương của Viện Dược liệu Hà Nội đã thống kê và khảo sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây mướp đắng và khảo sát tác dụng hạ đường huyết của của dịch chiết glycosid trong trái mướp đắng trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng aloxan [15]. Điều này cho phép các tác giả trên giả thiết rằng trong trái còn có những thành phần mà bản thân nó tuy không có hoạt tính gây hạ đường huyết nhưng có tác dụng bổ trợ làm tăng hoạt tính gây hạ đường huyết của glycosid [15].

Những nghiên cứu gần đây cho thấy α – protein và β – protein mướp đắng cũng có ảnh hưởng đến sự sinh sản của phôi chuột nhắt trắng và ảnh hưởng đến việc tổng hợp phân tử lớn tế bào nội mô tử cung; chúng cũng có khả năng ức chế tổng hợp ADN, ARN và protein, làm cho sự phát triển của nội mạc tử cung bị ức cheá. Phân tích cơ chế tác dụng chống thụ thai của α – protein và β – protein hạt mướp đắng ta thấy ngay là ở thai kỳ đầu của động vật mang thai protein này tác động trực tiếp lên tế bào phôi và tế bào nội mạc tử cung ở các giai đoạn phát triển khác nhau, làm chúng không thể phát triển và làm tổ bình thường, nên bị saồy thai [17]. Cơ chế: Acarbose và Miglitol ức chế men α - glucosidase trong ruột khiến các polysaccharid (tinh bột, đường mía saccharose..) chậm thủy phân thành glucose, kết quả là glucose vào máu từ từ nên glucose huyết không tăng nhiều sau bữa ăn.

GLUCOSIDASE TRONG ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƯỜNG

Kết hợp Meformin và Acarbose : cả hai cùng ức chế hấp thụ glucose ở ruột nghĩa là làm giảm dao động glucose sau bữa ăn, Meformin lại làm giảm glucose huyết khi đói do ức chế gan thủy phân glycogen. Bệnh nhân tiểu đường loại 2 mãn tính, thuốc uống không hiệu nghiệm Trị các biến chứng acidoz, thẩm áp cao…. Sau khi sản phẩm được giải phóng, enzym lại được tái sử dụng, enzym là chất xúc tác có tính đặc thù đối với các phân tử và phản ứng nhất định.

Dưới tác dụng của men amylase, tinh bột (kết hợp với nhiều phân tử đường glucose) sẽ bị thủy phân thành maltose (gồm 2 phân tử đường glucose). Sau đó, với sự xúc tác của men α - glucosidase, đường maltose sẽ tiếp tục bị thủy phân thành đường glucose. Đường glucose này sẽ được hấp thụ vào mạch máu trong cơ thể con người và trở thành glucose huyết cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động sống.

Nhưng với sự xuất hiện của một chất ức chế nào đó, men α - glucosidase sẽ hạn chế hoạt động, quá trình thủy phân maltose diễn ra chậm vì vậy hàm lượng glucose không tăng mạnh sau khi ăn. Phương pháp ức chế men α-glucosidase trong điều trị tiểu đường loại 2 là phương pháp được ưu tiên sử dụng vì có cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hoá đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào β tuỵ tạng… như các phương pháp khác. Phương pháp in vitro để khảo hoạt tính ức chế men α-glucosidase dựa trên nguyên tắc: men α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt nối này để giải phóng đường D-glucose.

Hoạt động này sản sinh ra nhiều glucose sau khi ăn và làm gia tăng hàm lượng glucose trong máu, do đó cần ức chế hoạt động của men α-glucosidase để làm chậm sự chuyển hoá một số loại thức ăn thành glucose. Vì vậy, người ta sử dụng các chất nền có liên kết α với đường D- glucose như: p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, maltose… để xây dựng phương pháp thử hoạt tính ức chế men α-glucosidase trong phòng thí nghiệm.

NGHIÊN CỨU

• HểA CHẤT VÀ DỤNG CỤ
• XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU VÀ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HểA HỌC
• NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG TIỂU ĐƯỜNG THEO CƠ CHẾ ỨC CHẾ MEN α -GLUCOSIDASE
• NGHIấN CỨU THÀNH PHẦN HểA HỌC

Trong dung dịch, flavonoid tạo kết tủa màu vàng cam hoặc màu đỏ với acetat chì, tạo kết tủa màu xanh lục, đôi khi màu nâu đỏ với FeCl3. Flavonoid được xác định bởi phản ứng Shibata, còn gọi là phản ứng Cyanidin của Willstater. Cho vài giọt dung dịch acid tricloacetic 90% vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ xuất hiện màu tím, sau 20 phút chuyển sang màu xanh lơ.

- Dung dịch gelatin mặn: Gelatin: 2g Dung dịch NaCl bão hoà: 10 ml - Dung dịch acetat chì bão hoà cho kết tủa màu vàng nhạt. Cách thực hiện: hoà tan mẫu bằng 0,5 ml dung dịch SbCl3 bão hoà trong cloroform, khuấy đều, đem soi UV. Nhận biết: nhỏ 3-4 giọt thuốc thử vào 1mg chất thử, nếu có màu vàng cam hoặc hồng xỉn là phản ứng dương tính.

Phản ứng: hòa tan 1mg chất thử trong 2-3 giọt pyridin, thêm 1 giọt dung dịch Natri nitroprussiat 0,5% mới pha, sau đó cho từ từ từng giọt dung dịch KOH 2N vào. Vẽ đường biểu diễn giữa độ hấp thu (A) và nồng độ dung dịch chuẩn, từ đó xác định phương trình đường chuẩn. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có chất ức chế và mẫu không có chất ức chế để xác định % ức chế.

- Chuẩn bị các dung dịch thử chuẩn (enzym, chất nền, các dung dịch đệm, chất ức chế…). Tiếp tục cho phần bã còn lại sau khi lọc đun tiếp 2 lần nữa với dung môi EP, lọc và cô ở áp suất thấp phần dịch chiết ta được cao H1. Phần bã còn lại tiếp tục đun hoàn lưu 3 lần, mỗi lần 2 giờ với cloroform, lọc lấy dịch chiết và cô quay loại dung môi thu được cao H2.

- Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2-4 giọt dung dịch acetat chì bão hòa thấy xuất hiện tủa màu vàng nhạt.

PNP] mM/lA

❖ Nhận xét: Độ hấp thu A thay đổi tuyến tính bậc 1 với nồng độ chất nền. Tuy nhiên, nếu sử dụng ở nồng độ cao hơn 0,1mM thì tỉ lệ không còn là tuyến tính bậc 1. Pha dung dịch enzyme ở các nồng độ khác nhau rồi đem đo độ hấp thu A ở 400nm.

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, sau mỗi 5 phút lấy ra đo độ hấp thu A ở 400 nm đến khi A không đổi hoặc thay đổi không đáng kể ở 3 lần đo kế tiếp nhau. ❖ Nhận xét: Độ hấp thu A tăng tuyến tính bậc 1 trong khoảng 20 phút đầu tiên của phản ứng. Chuẩn bị 7 mẫu dung dịch tương tự nhau, đem ủ với các khoảng thời gian khác nhau, sau đó đem đo độ hấp thu A ở 400 nm.

PhuùtA

Sau khi cho ủ các hỗn hợp dung dịch ở 37oC trong 30 phút và thêm p- nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-Glc) vào, trong thời gian tiếp tục ủ 20 phút nữa thì lượng PNP sinh ra. ❖ Nhận xét: Độ hấp thu A của các mẫu có chứa cao H1 lớn hơn so với mẫu trắng nên cao H1 không có hoạt tính ức chế. ❖ Nhận xét: Độ hấp thu A của các mẫu có chứa cao H2 nhỏ hơn so với mẫu trắng nên cao H2 có hoạt tính ức chế.

Gạn lấy các tinh thể của phân đọan H1-2 và rửa nhiều lần bằng EP cho đến khi thử trờn sắc ký bản mỏng cho 1 vết rừ, ký hiệu là chất 1. - Đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của các hợp chất với kết quả là trong hạt mướp đắng có chứa các hợp chất flavonoid, sterol, tanin, alcaloid, saponin và glycosid. - Hoạt tính kháng tiểu đường được thử nghiệm theo phương pháp ức chế men α-glucosidase đối với 3 loại cao trên, kết quả là cao cloroform và cao cồn cho hoạt tớnh ức chế 50% so với mẫu đối chứng (IC50) lần lượt là 62,66àg/ml và 31,25àg/ml.

Tuy nhiên, do thời gian hạn chế và lượng mẫu hơi ít nên chưa khảo sát được hoạt tính ức chế men α-glucosidase của hai chất này đặc biệt là đối với chất 3-O-[β-glucosyl]- stigmasta-5,25(27)-diene. - Tiến hành cô lập hai chất sạch trên và chất thứ 3 cho đủ lượng mẫu để thử hoạt tính ức chế men α-glucosidase. - Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học của cao cloroform và cao cồn của hạt mướp đắng nhằm tìm ra chất có hoạt tính kháng tiểu đường.

[20] Phùng Văn Trung, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thanh Hồng (2003), Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của trái và hạt cây mướp đắng Momordica charantia L, Hội nghị hóa học toàn quốc. [25] Hideyuki Matsuura, Chikako Asakawa, Masanori Kurimoto, Junia Miyutani (2002), α-glucosidase inhibitor from the seeds of Balsam pear (Momordica chrantia L.) and the friut bodies of Grifola frondosa, Biosci. [26] Hikaru Okabe, Yumi Miyahara, Tasuo Yamauchi, Kazumoto Miyahara and Toshio Kawasaki (1980), “Studies on the Constituents of Momordica charantia L.

A novel method for the assay of α-glucosidase inhibitory activity using a multi-chanel oxigen sensor, Analytical Sciences, Vol.18.