Quy trình sản xuất enzyme pectinase và ứng dụng trong làm nước quả

Cơ chế tác dụng của enzyme pectinase Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm hai mụcđích cơ bản.. Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và l

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Đề tài: QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PECTINASE

VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÀM NƯỚC QUẢ

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang

Nguyễn Thị Ngọc Thi 3005110299 Phạm Thị Kim Tươi 3005110263 Phùng Thị Hằng 3005110064

Vũ Thị Tuyết Trang 3005110357

Tp.HCM 06/2014

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PECTINASE 3

1.1 Định nghĩa Enzyme pectinase 3

1.2 Cấu tạo 4

1.3 Phân loại 4

1.4 Đặc điểm của Enzyme pectinase: 7

1.4.1 Enzym pectinase từ nguồn thực vật: 7

1.4.2 Enzym pectinase từ vi sinh vật 9

1.5 Trung tâm hoạt động của pectinase 12

1.6 Cơ chế tác dụng của enzyme pectinase 12

1.7. Lợi ích khi sử dụng enzyme pectinase 13

CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PECTINEASE 16

2.1 Nguồn gốc thu nhận 16

2.2 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 17

2.3 Tách và làm sạch 20

2.3.1 Phương pháp thu nhận 20

2.3.2 Từ môi trường nuôi cấy bề mặt 21

2.3.3 Từ môi trường nuôi cấy bề sâu 23

2.4 Phương pháp tinh sạch 24

2.4.1 Giới thiệu chung 24

2.4.2 Phương pháp kết tủa 26

2.4.3 Kỹ thuật siêu lọc 30

2.4.4 Phương pháp sắc ký 31

2.4.5 Phương pháp thẩm tích 33

2.4.6 Kết tủa ái lực 34

2.5 Thu chế phẩm từ ASP.NIGER 72-32 34

2.5.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi 34

2.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi 34

2.5.3 Ảnh hưởng độ ầm ban đầu của môi trường nuôi cấy 35

2.6 Xác định hoạt tính enzyme 37

2.6.1 Phương pháp nhớt kế 37

2.6.2 Phương pháp đông chung(Cu-pectat) 37

2.6.3 Phương pháp so màu: 38

CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG ENZYME PECTINEASA TRONG LÀM NƯỚC QUẢ 39

3.1 Giới thiệu về ứng dụng enzyme pectinase 39

3.2 Ứng dụng enzyme pectinase sản xuất nước quả 40

3.2.1 Các chế phẩm enzyme 40

3.2.2 Ứng dụng chế phẩm pectinase trong sản xuất nước quả 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống đã trở thành phổ biến trong ngành sảnxuất thực phaamt và mang lại lợi ích khá lớn.

Trước đây, nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật Ngày nay,người ta nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú và đa dạng và rẻtiền Và được ứng dụng rộng rãi trong các ngành sản xuất khác nhau

Để hiểu sâu hơn về nguồn enzyme này nhóm em thực hiện đề tài tiểu luận quy

trình sản xuất enzyme pectinase và ứng dụng trong sản xuất nước quả.

Vì thời gian hoàn thành báo cáo không nhiều, cũng như kiến thức còn hạn chế nênkhông tránh khỏi những sai sót, em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của cô,các bạn để bài báo cáo của em được hoàn thiện hơn và giúp em tiến bộ hơn trongnhững bài làm sắp tới

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PECTINASE1.1 Enzyme là gì?

Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân pectin , sản phẩm củaquá trình này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol… đây là mộtnhóm ezyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase

và protease Enzyme này ban đầu được phát hiện trong các dịch chiết trái câynhư cà rốt, cà chua hay đại mạch Đầu tiên phải kể đến là phát hiện của E.fremi(1840) trên đối tượng cà rốt

1.2 Cấu tạo

Pectin là polysaccharide dị thể,chủ yếu là một mạch chính gồm các

gốc acid –α–D–1,4 galacturonic, liên

kết với nhau bằng liên kết 1,4–O

glucozic còn gọi là acid

polygalacturonic hay acid pectic

Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester

metylic của acid pectic

Trong thực tế không phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galactosecũng bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bịdecacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH thay thế -H bằng kim loại,cũng có lúc giữ nguyên dạng –COO Người ta cho rằng protopectine là hợpchất giữa pectine và araban, galactose hay tinh bột

Trọng lượng phân tử từ 20.000 – 200.000 đvC

1.3 Phân loại

Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng:

Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase

Stt Enzym (tên gọi theo

hệ thống)

Enzym(tên thường gọi) Phản ứng xúc tác

pectic acid

2 Poly--1,4

galacturonid-glycano hydrolase-PG

Endopolygalacturonase(endo-PG)

Thủy phân liên kết

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat,trong galacturonic với sự đứtmạch của acid galacturonic

Endopolymetil-Thủy phân liên kết galacturonid trong pectinkhông theo một trật tự nhấtđịnh

digalacturonoliase

Exo-pectatliase(exo-PKTE)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat với

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat,trong galacturonic với sự tạothành nối đôi không theo mộttrật tự nhất định

-1,4-D-7 Poly-galacturonid Endopectinliase Thủy phân liên kết

-1,4-D-metylester glicanoliase (Endo-PTE)

galacturonid trong pectin với

sự tạo thành nối đôi khôngtheo một trật tự nhất định

Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester.

Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonatenằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3)đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic vàmethanol Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưukhác nhau Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồnthực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5 Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối

ưu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62oC Pectinesterase thường được hoạt hoábởi các ion Ca2+ và Mg2+

Polygalacturonase: còn có tên gọi là poly

-1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết glycosid Các exo-PG (exo-poly 1,4 D-galacturonide) galacturonohydrolase,phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly1,4 D-galacturonide)glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất.Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và

–1,4-vi khuẩn Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử vàthường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chếtác dụng với cơ chất, enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại:

Polymethylgalacturonase hay còn gọi là

-1,4-galacturonite-methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã đượcmethoxyl hoá (tức là pectin) Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏphụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin,

đó là endo-glucosidase-polymethyl galacturonase kiểu I và polymethylgalaturonase kiểu II

exo-glucosidase-Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic,

cũng được chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase

kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV Enzyme glucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzymepolymethylgalacturonase dịch hoá pectin có mức độ methyl hoá càng cao thì bịthủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả Trong dung dịch,khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này thường bị

endo-giảm Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A niger,

A, awamori.

Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate

không bị ester hoá Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4 D-galac turonide)lyase) và endo-PEL (endo-poly(1,4 D-galacturonic lyase) đều tồn tại Pectate

và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho cácenzyme này Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trongkhoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động Pectate lyase không được tìmthấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm Các enzyme VSV ngoại bàonày đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra

sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật

Ngoài ra còn có:

Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly –1,4-galaturonite

methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid

Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly

-1,4D-galaturonite –glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid

Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester

hoá Tất cả các PNL đều là endo-enzyme

1.4 Đặc điểm của Enzyme pectinase:

1.4.1 Enzym pectinase từ nguồn thực vật:

 Pectinesterase:

Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enymePE.Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trongphần vỏ tế bào PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơikiềm Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh

hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme.

- Cà chua chứa ít nhất hai loại PE Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giaiđoạn đầu của quá trình chín Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzymePE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưngcủa trái chín PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6 Enzyme này bịbất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67oC Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ củaenzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M, theo thứ tự

- PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối

ưu tại pH gần 8 Polygalacturonic acid, là sản phẩm được hình thành do quátrình để methyl hoá các phân tử galacturonic acid

- Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE Cả hai có cùng khối lượngphân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3 Các enzymenày hoạt động ở pH tối đa là 7,5 Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dungdịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6,0 Các enzyme này

bị ức chế bởi nhiều loại

maltose và galactose

PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượngphân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là

- 10,05 và 11,0, theo thứ tự pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0

một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảmhơn khi bị tác động của protease Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đếnmức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme Enzyme bền nhiệt hơn vàenzyme còn lại có khối lượng là 51kD và 36kD, theo thứ tự

Hình 2.1: Cấu trúc của pectinesterase từ carrot

- Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme Các isoenzyme của kiwi

có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3 Tuy nhiên,chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt

 Polygalacturonase:

Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV PGthường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi

khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger,

Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các

loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum Tuy nhiên, trong

thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín

Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều

là endo-enzyme.PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bấthoạt ở nhiệt độ 78oC.PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bấthoạt ở 57oC PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở

pH 5,6

Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ragalacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế.Sự thủy phân polymernày bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất Mức độ thuỷphân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đốivới các exo-PG ở cà rốt và đào Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh

sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất.

Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũygalacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan

1.4.2 Enzym pectinase từ vi sinh vật

Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn

Nấm mốc: penicillium glaucum, p.ehrlichii, p.chrysogenum, p.expanam,

p.cilrimim, aspergillus awamori, a.foetidus, a.niger, a.terrus, a.saitoi, a.aureus, a.oryzae, a.wentii, fusarium moniliforme,…

Nấm men: saccharomyces fragilis

Vi khuẩn: bacillus polymyxa, flavobacterium pectinovorum, klebsiella

aerogenes…

Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các

bộ phận khác của thực vật khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽcùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật.Người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt hoặc từ canh trường bềsâu của nấm mốc

Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzime này a.niger chủ yếu tổng hợp ra pectinnesterase con.diplodiella, pen.citrimin tạo ra chủ yếu là

polygalacturonase

Nấm men sacch.fragilis dường như chỉ tạo ra endopectintraseliminase.

Vi khuẩn bac.polymyxa, bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase.

 Pectinesterase:

Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị PH tối ưu

khác nhau: PH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còncủa chế phẩm đã loại bỏ enzime polygalacturonase sẽ có PH tối ưu từ 2,0 đến6,5 Trái lại ph tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6đến 7,5 – 8

Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 450C.từ 55 đến 620Cthì enzime bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzime pectinesterase từthực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 600C

Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có

nhiệt độ tối ưu là 30 – 45oC, PHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62oC và từ thựcvật (phopt=7,5-8, to

opt= 55-60oC) khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vàonguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin Ion natri và đặc biệt là ion canxi,cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm mốc

conithyrium diplodiella và từ a.niger.trái lại các cation hóa trị 3 và 4 (thủy

ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng củapectinesterase

Ngoài ra, người ta đã thu được enzime pectinesterase ở trạng thái đôngthể và người ta cũng đã xác lập được rằng n-axit cuối trong phân tử enzime làphenylalanin

Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhómmethylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do và enzime sẽ thủy phân lầnlượt cắt liên kết ester dọc theo phân tử pectin hoạt động của pectinesterase phụthuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester

hóa Chẳng hạn, đối với tác động của pectinesterase từ nấm mốc a.niger, cần

thiết phải có pectin ester hóa ở mức độ cao không ít hơn 70%

 Polygalacturonase:

Hầu hết các nghiên cứu về Polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồn

Vi sinh vật Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại

bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: saccharomyces

fragilis, asperigillus niger, lactobacillus plantarum, cochlibolus carbonum, neurosrora crassa, các loài ascomycete, rhizopus arrchizus và fusarium oxysrorum.

PH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vàonguồn thu và cơ chất Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa

(endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối ưu nằm trongkhoảng từ 4,0 – 5,5 cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì lại có

ph tối ưu trong khoảng 5,5 – 6 còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụngtrên pectin thì ph tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối

ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6

Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6

Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa

bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5

Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40

-450C.trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô hoạthóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650C

1.5 Trung tâm hoạt động của pectinase

Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vòng xoắn kép về phía phải với

2 vòng tạo thành khe liên kết với cơ chất

Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa axit amin Aspartate vàLysine Có 1 Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khảnăng xúc tác của enzyme

Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase khoảng từ 45 – 550C

1.6 Cơ chế tác dụng của enzyme pectinase

Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm hai mụcđích cơ bản

- Phá vỡ thành tế bào thực vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả

- Làm trong và ổn định chất lượng nước

(thành tế bào) Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho

tế bào Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem nhưchất ciment gắn các tế bào với nhau Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho

các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế bào Các chế phẩm enzym có chứakhông chỉ pectinase mà còn chứa các enzym trong nhóm cellulase Các loạienzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và giúp quá trình thu nhận dịch tế bàotốt hơn.

thường chứa nhiều chất khác nhau Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể

và pectin thường gây hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả

Các chất protein có trong bào tương, màng tế bào và gian bào Pectin chứapolygalacturonic acid, araban và galactan.Trong đó lượng polygalacturonicacid chiếm tới 40-60% Khi bị thủy phân, pectin tách thành hai phần:

- Phần trung tính – phức chất galactanoraban

- Phần acid – acid pectic

Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan Trong màng tế bào và gianbào, chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin Protopectin ở mànggian bào có chứa lượng kim loại khá lớn và một lượng nhóm metocyl đủ đểlàm protopectin bền vững Còn protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kimloại không nhiều, có độ metocyl hóa cao Vì thế, tế bào thực vật có khả năngtrương nở tốt

Nếu enzym tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tế bào khó liên kếtvới nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra.Pectin thường có mối liên kết hydro vàliên kết nguyên tử yếu hơn so với cellulose Tham gia phân hủy pectin gồmnhiều loại enzym : cellulose, pectinase,…

1.7 Lợi ích khi sử dụng enzyme pectinase

Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym loài người

đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong công nghiệp Sốlượng enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzym được ứng dụng vàocông nghiệp cũng ngày càng nhiều

Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩmpectinase dưới dạng tinh khiết Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh

trường nấm mốc sấy khô Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc trên lượngnguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0.03 – 0.05 đến 0.10%.

Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiếp thực phẩmsau:

- Sản xuất rượu vang

- Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn;

- Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông,

- Sản xuất nước giải khát

- Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan

Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả.

Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất

dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm Chẳng hạn đưa pectinase vào khâunghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép lên tới 15 – 25% Bởi lẽkhi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quảkhông thoát ra được Nhờ pectinase phân giải các cơ chất pectin, làm các chấtchiết trong dịch bào dễ thoát ra ngoài hơn, làm tăng hiệu suất chất chiết, hơnnữa dịch quả trong suốt không bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng Không những vậy,enzym pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và nhữngchất hòa tan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng của thành phẩm

Các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất phải có những yêu cầusau:

ảnh hưởng xấu đến hương vị và màu sắc của sản phẩm; nghĩa là chế phẩm phảiđược làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh hưởng xấu đến chấtlượng vang

- Chế phẩm được đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường quá trình sơchế quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu suấtchung và đặc biệt là hiệu suất của phần tự chảy có chất lượng cao Để tăngnhanh và tốt quá trình làm trong dịch thì tương quan hoạt độ của các enzym

chính như endo – PMG là 55,0.102 đơn vị/mg protein chứa trong chế phẩm,còn enzym Cx là 57,5 đơn vị/mg protein trong 1 lít dung dịch Trong trườnghợp này không cần có mặt PE Nhưng nếu hoạt độ của endo – PMG ở trong chếphẩm là 31,0.102 đơn vị/mg protein thì cần có mặt PE với hoạt độ là 4,1 đơnvị/mg protein Trong sản xuất vang nho giữa hàm lượng enzym endo – PMG va

Cx phải có sự tương quan nhất định Khi chế phẩm có hoạt độ endo – PMG là28,2.102 đơn vị/mg protein và Cx là 28,7 đơn vị/mgP quá trình làm trong sẽxảy ra nhanh hơn khi có hoạt độ endo – PMG là 25,4.102 đơn vi/mg P và Cx là55,0 đơn vị/mgP

- Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang nghĩa là phảichứa enzym proteinase với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g theo globulin

và 140 đơn vị/g theo anbumin

- Để tránh gây tổn thất các chất màu cùa vang đỏ và tránh xuất hiện màutối trong vang trắng thì hoạt độ của các enzym oxy hoá trong chế phẩm khôngđược vượt quá 0,1 đơn vị/mg axit ascorbic trong một phút trên một gam chếphẩm

trong điều kiện có chứa rượu (10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả trong điềukiện có độ pH nhất định

- Để xử lý dịch hoặc bã nghiền ở trạng thái dòng có thể dùng chế phẩmpectinase có hoạt độ cao (12000đv/g) hoặc dùng chế phẩm pectinase không tan

Chẳng hạn trong sản xuất vang nho, khi sử dụng chế phẩmpectawamorin PM10x, người ta thấy có thể tăng hiệu suất dịch tự chảy lên 32%.Trung bình thể tích của phần dịch tự chảy có thể tăng được 10%, còn hiệu suấtchung của dịch tăng lên 1 – 2% Hoặc khi ép bã nghiền nho trắng đã được xử lýbằng pectinol thì thấy quá trình ép tiến hành nhanh hơn Hiệu suất dịch khi đótăng lên 9,6% Vậy dùng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng tốc độ làm trong vàtốc độ lọc của dịch

Khi sử dụng chế phẩm pectinase, các polime của dịch như protein,

pectin … sẽ thủy phân làm giảm độ nhớt do đó làm tăng tốc độ lọc Trong 1giờ dịch thu được từ bã nghiền của nho có xử lý bằng chế phẩm pectinase sẽqua lọc 7 lần nhanh hơn từ bã không được xử lý.

Khi dịch không được xử lý bằng enzym thì trong quá trình lắng, các hạtvẩn đục lớn và nhỏ sẽ bị kết tủa xuống Khi sử dụng enzym thì các chất caophân tử của dịch sẽ bị thủy phân từng phần, độ nhớt bị giảm, kết quả là tốc độlàm trong đều tăng

Sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng chất lượng của dịch quả và củavang

Trong quá trình xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase, thành phầnhóa học của bã thay đổi rất đáng kể mà trước tiên là hàm lượng chất phenol.Người ta thấy rằng khi xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tănghàm lượng catesin ở trong dịch Khi đó quá trình trích ly sẽ vượt lên trước quátrình oxy hoá catesin ngay cả khi nhiệt độ tăng Điều này rất quan trọng, vì cáchợp chất phenol đặc biệt là catesin có các nhóm hydroxil ở vị trí octo thường cóhọat tính của vitamin P Như vậy xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽlàm tăng giá trị sinh học của dịch quả và vang

Không những vậy vang được pha chế từ dịch và bã nghiền có xử lý bãbằng chế phẩm pectinase sẽ chín nhanh hơn do đó cần chiết sớm hơn Người tacho thấy rằng chế phẩm thu được từ nấm mốc, Botrylis cinerea gây ảnh hưởngrất tốt đến chất lượng của vang, vang có hương thơm mạnh và dịu do hàmlượng glyxerin và ester ở trong vang cao

Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường sử dụng chế phẩmenzym bao gồm pectintrancelinutase, hemicellulase, cellulase Trong đó,enzym pectintrancelinutase đóng vai trò quan trọng nhất Trong hỗn hợp chếphẩm enzym trên, tuyệt đối không được có mặt enzym polygalacturonase, đặcbiệt không được chứa enzym endopolygalacturonase Những enzym nàythường làm giảm độ nhớt của nước quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước quả

Môi trường Dụng cụ nuôi cấy

 Từ vi sinh vật : Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì

ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú.Vi sinh vật phân giải pectine

hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:

 Nấm mốc: Asp.niger, Asp.oryase, Asp.terreus, Asp.saito,

Asp.japonicus…

 Nấm men: sac.ellipsoideus, sac.fragilis, sac.ludwigii …

 Vi khuẩn: Bac.polymixa, Bac.felseneus, Clostridium roseum…

2.2 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

 Thuyết minh quy trình:

 Môi trường nuôi cấy

Là môi trường rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngômảnh, bột đậu tương… pha thêm muối khoáng Môi trường rắn thường dùngnhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng vàkhi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra nhiềuenzyme Có thể bổ sung những thành phần giàu pectin như bã củ cải đường,bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm lượng pectinase cao Bên cạnh

đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo môi trường thoáng khí tốt, giúp cho

sự phát triển của nấm Vậy môi trường hoàn chỉnh để nuôi cấy gồm có: 70%cám mì + 23% trấu + 5% chất cảm ứng + chất dd khác ( mầm mạ, nước khoaitây, … để cung cấp thêm nguồn Nitơ, Photphat, Kali, … ) Môi trường rắn cầnđược làm ẩm đến khoảng 60%, nếu độ ẩm quá cao thì nhiều loại vi khuẩn pháttriển gây tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi trường nhanh khô, sinh bào

 Để nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các khay đã

được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 300C thì tiếnhành cấy giống

 Giống

Sử dụng nấm mốc.Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng

để tránh nhiễm tạp.giống được nhân theo phương pháp bề mặt và cũng trên môitrường trên để giống quen với điều kiện sản xuất Khi nhân giống thường đểcho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu theophương pháp tách bào tử khỏi môi trường và chứa trong các bình có nút kín Tỉ

lệ nhân giống vào khoảng 0,2 – 2% Mỗi gam bào tử mốc có thể cấy vào 10kgmôi trường

Qúa trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3 giaiđoạn:

 Giai đoạn 1: Khoảng 10 – 14h đầu: giai đoạn này có những thay đổi sau:

 Bào tử nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa

 Bắt đầu hình thành enzym, không đòi hỏi phải thông khí nhiều chỉ cầnlàm thoáng khoảng 2 – 3 thể tích không khí / thể tích phòng / giờ

 Khối môi trường còn rời rạc, các thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sựthay đổi

 Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 14 – 18h: giai đoạn này có những thay đổisau:

Mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt thường,lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng – xám và ngày càng rõ, làm môi trường kếtbánh lại, độ ẩm môi trường giảm dần.Các chất dinh dưỡng trong môi trườngtiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá trình trao đổi chất trong tế bào và giống

hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 – 90kcal/giờ Làm nhiệt độ môitrường tăng lên 400 - 450C Thời kì này cần phải thông khí mạnh tới 60 thể tíchkhí/1thể tích phòng/giờ để cung cấp O2 cho mốc thở và đuổi CO2 ra khởi môitrường, đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi Nhiệt độ buồng nuôi ở giaiđoạn này cần giữ ở 28 - 300 C và độ ầm trong phòng khoảng 90%

Các loại Enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase được hìnhthành nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng

biến đổi

Quá trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậmlại Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ.Thông khí không quá

20 – 25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồng nuôi duy trì ở

300 C

Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian nuôi cấy có thểkết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa, Enzyme vẫn được hìnhthành ở giai đoạn này

Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền nhỏ,đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm.Sản phẩm này là chế phẩmenzyme thô

2.3 Tách và làm sạch

2.3.1 Phương pháp thu nhận

Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có phươngpháp tách và thu nhận riêng:

trường nuôi cấy ngoài tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ trích ly vàtinh sạch

 Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật

và không được tiết ra môi trường bên ngoài Những tế bào vi sinh vật sau khiđược nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào Mục đích của việc này là giảiphóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào Hỗn hợp thuđược sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng lớn; cònenzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối Enzyme sau đó sẽ được đem tinhsạch

2.3.2 Từ môi trường nuôi cấy bề mặt

Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dungdịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, axeton).Nhiều kết quả thínghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này có kết quả tốt và dể được dùngrộng rãi trong sản xuất.Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiếtđược lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chấtkhông tan Nước thường dung khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C Để tránh tạpnhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoăc chất sát trùng khác Dịch chiếtthu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và đượclàm lạnh kịp thời xuống 10 – 120C

Phương pháp tách chiết và làm sach enzyme được sử dụng rộng rãi nhấthiện nay là phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (etanol,izopropanol và axeton) Các dung môi hữu cơ này làm giãm hằng có điện môicủa môi trường như ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điệnmới Vì vậy các enzyme, các chất protein cũng như các chất có phân tử thấp

Thường lẫn chung zới các chất

khác của tế bào sau khi bị phá vỡ

(acid nucleic, chất nguyên sinh,

lipid…)

KHông lẫn chung với các thànhphần nội bào, nếu có chỉ là mộtvài enzyme ngoại bào khac

Chỉ bần vững trong môi trường

trong hệ dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống.

Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn,nhiệt độ, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme Để tránhmất họat tính của enzyme tất cả phải được làm lạnh xuống 3 – 5*C Khi trộnphải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa và lắng xuống dưới cần tách ly ngay. 

Sơ đồ tinh sạch Enzyme từ canh trường nấm mốc.

2.3.3 Từ môi trường nuôi cấy bề sâu

Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi sinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7.2 là thích hợp Đối với nấm mốc, pH kìm hãm sự tổng hợp sinh khối

và sự tích luỹ enzyme pectinase.Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm

Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm lượng từ 10%.Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử, thời gian ủ

2-sơ bộ thường là 38-42h.Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2% Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môi trường giảm từ 6% xuốngcòn 1.5-1.8%

Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180 độ C và đi ra đạt 60-70 độ C Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấyphải không quá 40 độ C Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín để tránh hút ẩm

sự sinh trưởng qua 55-60h, pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6.5-7.0 Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canh trường chứa bào tử