Nguyên tắc:
Kỹ thuật siêu lọc (Ultrafiltration) là quá trình phân riêng chọn lọc các hợp chất bằng màng lọc có kích thước siêu nhỏ với áp suất làm việc vào khoảng 0,5 – 5bar. Đường kính mao quản trung bình từ 2 đến 50 nm.
Vật liệu lọc
Trong phương pháp này, vật ngăn để phân riêng các cấu tử là membrane. Áp lực là động lực duy nhất của quá trình. Membrane có thể được sản xuất từ nhiều loại vật liệu khác nhau như: cellulose acetate, polyamide, polysulfone hay ceramic.
Ứng dụng trong nghiên cứu tinh sạch pectinase
• Trong lĩnh vực tinh sạch enzyme nói chung, đặc biệt là pectinase, quá trình siêu lọc thường được áp dụng trong giai đoạn đầu của quy trình tinh sạch. Mục đích của quá trình là tách nước và các tạp chất có phân tử lượng nhỏ trong canh trường lỏng như các ion kim loại, đường sót, acid amin, peptide… (dòng permeate). Trong hầu hết các trường hợp, enzyme tinh sạch phải được giữ lại trên bề mặt vật liệu lọc (dòng retentate). Vì thế, vật liệu lọc cần phải có kích thước mao quản nhỏ hơn kích thước enzyme.
• Phần lớn các enzyme polygalacturonase có khối lượng phân tử trong khoảng 30-80kDa (Jayani R. S. và cộng sự, 2005). Vì vậy, để tinh sạch canh trường nuôi cấy thu nhận loại enzyme này thì cần vật liệu có kích thước nhỏ hơn 30kDa. Kích thước này không tách được các protein tạp (có khối lượng phân tử lớn hơn 30kD) bị lẫn trong canh trường.
• Kết quả nghiên cứu của Manachini P.L. và cộng sự (1987) khi tinh sạch endo-PGase bằng kỹ thuật siêu lọc sử dụng sợi Diaflo (kích thước 10kDa) từ canh trường nuôi cấy nấm sợi Rhizopus Stolonifer cho thấy, độ tinh sạch của chế phẩm sau tinh sạch tăng lên 2,1 lần với hiệu suất thu hồi là 89%. Một nghiên cứu khác của Gainvors A. và cộng sự (2000) có thể nâng cao độ tinh sạch pectinase lên đến 10,4 lần với hiệu suất thu hồi khoảng 83% bằng kỹ thuật siêu lọc với kích thước lỗ 30kDa. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, việc áp
dụng kỹ thuật siêu lọc không đạt hiệu quả cao do lựa chọn kích thước lỗ màng không thích hợp (Dinu D. và cộng sự, 2007).
2.4.4. Phương pháp sắc ký
Thuật ngữ sắc ký dùng để chỉ các kỹ thuật phân tích và điều chế cho phép tách biệt các hợp chất khác nhau của một hỗn hợp. Phép phân tích sắc ký này dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hoà tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người ta thường chọn các chất có khả năng kết gắn được với các chất định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hoà tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác trao đổi ion, tương tác kị nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học. Dựa vào các kiểu liên kết người ta chia ra thành các kiểu sắc ký sau:
• Sắc ký lọc gel: (sắc ký loại trừ phân tử) phân đoạn protein theo klg. Sắc ký lọc (sắc ký loại trừ không gian, loại trừ khuếch tán hay phương pháp loại trừ phân tử) cho phép phân đoạn một số hỗn hợp protein theo khối lượng phân tử của chúng. Thực tế ngoài kích thước ra, hình dạng của phân tử cũng có ảnh hưởng.Tuy nhiên thông số này có thể bỏ qua nếu protein trong hỗn hợp là hình cầu. Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong cột dùng để tách enzyme, các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dạng của chúng.
Pha tĩnh: các hạt gel xốp chứa đầy trong cột.
Khi cho dung dịch các protein chảy qua cột thì các phân tử lớn nhất của hỗn hợp có đường kính lớn hơn lỗ của pha tĩnh, không thể khuếch tán vào bên trong hạt nên bị loại trừ và chúng sẽ đi ra khỏi cột cùng với thể tích dịch rửa bằng thể tích giữa các hạt gel (Vo).
Các phân tử bé, ngược lại, sẽ khuếch tán tối đa vào torng hạt gel và thể tích dịch rửa của chúng sẽ bằng tổng thể tích pha lỏng của cột (V1).
Còn các phân tử có kích thước trung gian sẽ khuếch tán hạn chế vào hạt, thể tích dịch rửa của chúng càng lớn khi quãng đường đi (của chúng) vào bên trong hạt càng dài thì kích thước của chúng càng nhỏ.
vô cơ và các phân tử nước thông qua cấu trúc mạng lưới của sephadex. Thường phương pháp này chỉ làm tăng độ cô đặc nhưng giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm do các phân tử protein bị kẹt lại giữa các hạt gel.
• Sắc ký trao đổi ion: liên kết ion.
Nguyên tắc:
Dựa trên sự tích điện của các phân tử protein. Phương pháp trao đổi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất ezyme trong quy mô công nghiệp. Tính chất tích điện của phân tử protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH, từ đó người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation. Trong sắc ký trao đổi ion, việc gắn một protein enzyme vào nhựa trao đổi ion sẽ phụ thuộc vào trạng thái ion hoá của potein, cũng như trạng thái ion hoá của nhựa trao đổi, pH, lực ion và nhiệt độ.
Quá trình phân tách trên bao gồm hai giai đoạn:
Hấp thụ thuận nghịch protein-enzyme cần tinh sạch (và các protein có điện tích gần giống nhau) vào nhựa trao đổi ion.
Khử hấp phụ các ion đã được hấp thụ.
Bằng cách thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn tới sự thay đổi ion hoá và do đó thay đổi điện tích tổng của protein. Hoặc bằng cách tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh. Các protein –enzyme nào có ái lực với nhựa trao đổi ion yếu nhất sẽ bị đẩy ra trước tiên và ngược lại.
• Sắc ký ái lực: liên kết kỵ nước.
• Sắc ký hấp phụ: liên kết yếu như liên kết kỵ, nước, liên kết Van der Waals.
2.4.5. Phương pháp thẩm tích
Nguyên lý: trong quá trình tinh sạch các enzyme, để loại bỏ các phân tử hoà tan nhỏ không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như là amoni sulfat sau kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh trong sắc ký ái lực,... người ta thường dùng phương pháp thẩm tích.
Thời gian nuôi Hoạt động pectinase (dvhd/1g canh trường)
30 36132 740 32 740 34 1150 36 1300 38 887 40 288
Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm (thường bằng solephan). Túi thẩm tích có chứa dịch chiết enzyme, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất hoà tan cần loại bỏ.
Chất hoà tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều Gradient nồng độ, ở trạng thái cân bằng thì nồng độ chất hoà tan bên trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ cân bằng nhau do đó phải dùng một thể tích lớn dung dịch đệm và thỉnh thoảng phải thay dung dịch mới.
(NH4)2SO4 được cho vào túi thẩm tích, rồi đặt túi đó vào dung dịch có chứa polymer
cacboxyl methyl cellulose, polyetylenglycol (PEG) là những polymer có tính háo nước.