QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nô

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU 4

NỘI DUNG 5

I Tổng quan về enzyme protease 5

1 Giới thiệu 5

2 Đặc điểm chung 5

3 Phân loại 5

4 Cơ chế tác động 6

5 Nguồn cung cấp 6

6 Ứng dụng của enzyme protease 9

II Quy trình sản xuất enzyme protease 9

1 Quy trình sản xuất 9

2 Thuyết minh quy trình 11

III Ứng dụng 15

1 Quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày 16

2 Giải thích quy trình 17

3 Sản phẩm 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

DANH SÁCH HÌNH Hình 1 Cấu trúc không gian enzyme Protease 5

Hình 2 Clostridium và Baccillus subtilis 7

Hình 3 Aspergillus 8

Hình 4 Aspergillus oryzae 8

Hình 5 Máy rửa băng chuyền 18

Hình 6 Thiết bị lên men 20

Hình 7 Máy lọc tinh vi kiểu ống 22

Hình 8 Thiết bị cô đặc chân khôn 23

Hình 9 Thiết bị chiết rót tự động 26

Hình 10 Thiết bị đóng nắp tự động 27

LỜI NÓI ĐẦU

Ngay từ cuối thể kỷ 17 và đầu thế kỷ 18, người ta đã phát hiện ra sự tiêu hóa thịt bằng các chất tiết ra từ dạ dày và sự chuyển hóa tinh bộ thành đường bởi các chất tiết ra ở thực vật và nước bọt đã được biết đến Tuy nhiên, cơ chế của các quá trình vẫn chưa được xác định, mãi theo một thời gian sau người ta mới biết đến sự biến đổi đó là nhờ một phần lớn hệ enzyme có trong động vật, vi sinh vật và thực vật tạo ra

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…

Như vậy protease là enzyme như thế nào mà được sử dụng nhiều như vậy thì bài tiểu luận của nhóm sẽ giúp người đọc hiểu rõ hơn và đồng thời giới thiệu đến người đọc sản phẩm ứng dụng của enzyme protease là nước mắm ngắn ngày

2 Đặc điểm chung

Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid ( -CO – NH)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả nằng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin

Hình1 Cấu trúc không gian enzyme Protease

3 Phân loại.

Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ:

- Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạchpolypeptit

- Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạchpolypeptit Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase

- Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit

- Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch

Dựa vào thành phần amimo acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chiaenzme protease làm các nhóm:

- Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid 2-4.

- Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt động ở vùng pH kiềm 9-11.

- Protease trung tính: như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, …

hoạt động ở vùng pH trung tính 7-8

Ngoài ra, enzyme protease còn chia thành:

- Enzyme protease nội bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoạibiên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kĩ thuật trích ly

- Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men hoàn tất hoặc ngayquá trình lên men đang diễn ra

4 Cơ chế tác động.

Mặc dù enzyme Protease có nhiều loại khác nhau nhưng các enzyme này đều xúctác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau

E + S Enzyme- S Enzyme – S + P1 Enzyme – S + P2

Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất, P1: Làsản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng

5 Nguồn cung cấp.

Enzyme protease là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúctác cho mọi phản ứng sinh học Chính vì thế, mọi sinh vật đều được coi là nguồn thunhận để sản xuất enzyme

Hiện nay, enzyme protease được thu nhận từ ba nguồn chính là: các mô và cơ độngvật,các mô và cơ quan thực vật và tế bào vi sinh vật

Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hóa ở người và động vật, có nhiều ứngdụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa Hai enzymnày được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bê, bò…)

b Nguồn thực vật

Từ các thực vật bậc cao người ta cũng thu được một số chế phẩm enzyme quan trọng

- Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Caria papaya)

- Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant)

- Ficin tách từ dịch ép thân cây sung

Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh dokết tủa protein

Nguồn vi sinh vật

Hai nguồn nguyên liệu trên không để dùng làm nguyên liệu sản xuất công nghiệp quy

mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ Ezyme Protease phân bố chủ yếu

vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium,Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại andopeptidase hoặcexopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vikhuẩn có tính cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptidetrong phân tử protein Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease làBacillus subtilis, B Mesentericus, B Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chiClostridium

Hình 2 Clostridium và Baccillus subtilis

Nhiều loại nấm mốc có khả năngtổng hợp một lượng lớn protease được ứngdụng trong công nghiệp thực phẩm là cácchủng Aspergillus oryzae, A Terricola, A.Fumigatus, Penicillium chysogenum, Một

số nấm mốc khác như: A Candidatus, P.Cameberti, P Roqueforti cũng có khảnăng tổng hợp protease có khả năng đông tụsữa sử dụng trong sản xuất phomat

Hình 3 Aspergillus Hình 4 Aspergillus oryzae

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn nấm mốc.Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease caonhư: Streptomyces grieus, S Fradiae,

Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật dohàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê nhưsau:

 Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơthể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm

 Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao

 Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượngsinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzymenhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao

 Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểmsoát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều

 Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp:

Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của visinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài Trong khi đó, sản xuấtenzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được

Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẽ tiền và dễkiếm,

 Không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trườngsống vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường,

nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne Chính vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinhvật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác.

 Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau

6 Ứng dụng của enzyme protease.

 Trong công nghệ chế biến thịt: protease làm mềm và tăng hương vị cho thịt

 Trong chế biến thủy sản: trong chế biến nước mắm sử dụng enzyme protease thựcvật ( bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vịcủa nước mắm

 Trong công nghiệp sữa: sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa

 Trong công nghiệp sản xuất bánh quy: enzyme protease làm giảm thời gian đảotrộn, tang độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và độ nở tốt hơn

 Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng để làm mềm da loại bỏ khỏi da cácchất nhớt nhờ thủy phân một phần protein chủ yếu là collagen ( thành phần làm da bịcứng ) Protease được dùng tách từ vi khuẩn (B mesentericus, B subtilis), nấm mốc (A.oryzae, A flavus) và xạ khuẩn (S fradiae, S griseus, S rimosus )

 Trong sản xuất bia : Chế phẩm protease làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thờigian lọc , Protease của A.oryzae dùng thủy phân protein trong hạt ngũ cốc tạo điều kiện

xử lý bia tốt hơn

 Một số ứng dụng khác :

 Điều chế dịch đạm thủy phân : làm chất dinh dưỡng , chất tăng vị , thức ăn kiêng

 Protease của nấm mốc + amylase: thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao

 Điều chế môi trường dinh dưỡng sản xuất vacxin

II Quy trình sản xuất enzyme protease.

1 Quy trình sản xuất.

Thu nhận kết quả

Dùng trong chănnuôibã

Đỗ lên khayLàm nguội đến 300C

Chế phẩm enzyme kỹ

thuậtThu nhận phế phẩm enzyme tinh khiết

2 THUYẾT MINH QUY TRÌNH:

Để thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp Oryzae có thể dùng hai phươngpháp nuôi cấy: phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu Phương pháp bề mặt thườngdùng nuôi cấy nấm mốc, phương pháp bề sâu thường dùng đối với vi khuẩn Lượngenzyme từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với phương pháp pháp bề sâu vànuôi cấy bề mặt có ưu điểm vượt trội hơn bề sâu: dễ thực hiện, yêu cầu về máy móc trangthiết đơn giản… Nên trong bài này sẽ dùng phương pháp bề mặt để sản xuất enzmeprotease từ nấm mốc Asp Oryzae

Giai đoạn chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

- Mục đích: Chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy cho phép vi sinh vật phát triển tốtCách tiến hành: Nguồn tinh bột như cám gạo, chứa khoảng 20% tinh bột, 10- 20% chấtbéo, 10–14% protein, 8 – 16% cellulose, các chất hòa tan không chứa nitơ 37– 59%.Cámkhông được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20%, không có vị chua hay đắng, không hôimùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%, có thể bổ sung thêmnguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thíchsinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu Các phụ phẩm thêm vào đểthoáng khí cho môi trường nuôi cấy bề mặt như trấu , mùn cưa……Các nguyên liệu nàyđược xử lý và phối trộn với tỉ lệ thích hợp để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển tốtnhất là được

- Sau đó đem tất cả đi hấp thanh trùng để nhằm tiêu diệt các vi sinh vật có trong môitrường để đảm bảo môi trường vô trùng hoàn toàn trước khi cấy nấm mốc vào

- Làm nguội môi trường xuống nhiệt độ khoảng 300C và trong quá trình làm nguộikhông được để vi sinh vật từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào để quá trình nuôi cấydiễn ra tốt hơn

- Do thực hiện phương pháp nuôi cấy bề mặt nên môi trường sau khi xử lí xong sẽ

đỗ ra khay để tiến hành cấy giống vào

Loài: Aspergillus oryzae

- Đặc điểm hình thái: Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợinấm phát triển rất mạnh ( chiều ngang 5-7um), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tếbào ( nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty

- Asp Oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylae, protease,pectinasa,…), nó thường có trong các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa gạo, thùngđựng bột… đã sử dụng hết nhưng không rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, bãsắn…Chúng mọc và phát triển thành các lớp mốc, có màu sắc đen, vàng…Màu này là docác bào tử già có màu sắc tạo nên, các bào tử rất này dễ bị gió cuốn đi xa và rơi vàonhững nơi có điều kiện thuận lợi cho nó phát triển và sẽ tạo thành mốc mới.

- Điều kiện phát triển:

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme: 55-58%

Độ ẩm không khí: 85-95%

pH môi trường: 5,5-6,5

Nhiệt độ nuôi cấy: 27-300C

- Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải điều ra các khay với chiều dày 2-3cm,rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ Các giá đỡ này được thiết kế saocho lượng không khí được cung cấp đầy đủ và thường xuyên Phòng nuôi cấy phải có hệthống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm thích hợp Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển

là khoảng 28- 32oC Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao điều ảnh hưởng không tốt đến nấmnày

- Trong quá trình nuôi cấy, không cần điều chỉnh pH vì môi trường bán rắn là môitrường tĩnh nên sự thay đổi pH thì không ảnh hưởng nhiều đến loài nấm này và môitrường nuôi cấy chúng

- Thời gian nuôi cấy nấm sợi này vào khoảng 36- 60 giờ Điều này phụ thuộc vàochủng nấm mốc Asp Oryzae và điều kiện môi trường cũng phụ thuộc vào điều kiện nuôicấy

Các giai đoạn phát triển của Asp Oryzae trong quá trình nuôi cấy:

- Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôicấy Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:

+ Nhiệt độ tăng rất chậm

+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

+ Khối môi trường còn rời rạc

+Enzyme mới bắt đầu được hình thành

+ Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến nhiệt độ Tuyệt đối không đưa nhiệt độcao quá 300C vì thời gian đầu này giống vẫn chỉ mới thích nghi với môi và phát triển rấtchậm nên chưa có khả năng chống chịu với nhiệt độ tăng cao

- Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ Trong giai đoạn này có nhữngthay đổi:

+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh, các sợi nấm nàytạo ra những sợi chằng chịt khắp các hạt môi trường, trong lòng môi trường

+ Môi trường được kết lại khá chặt

+ Độ ẩm môi trường giảm

+ Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C

+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi

+Các loại enzyme được hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ đượctạo ra nhiều hơn.

+ Lượng oxi trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần do quá trình trao đổi chất của nấmmốc để tạo thành E protease, do đó trong giai đoạn này cần phải được cung cấp oxi vàquá trình thông khí phải diễn ra mạnh và nhiệt độ luôn phải duy trì trong khoảng 29-300C

là tốt nhất và là điều kiện tốt nhất để nấm mốc tạo ra E.protease nhiều nhất

- Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ Quá trình trao đổi chất củanấm mốc yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại Nhiệt độ của khốimôi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí xuống 20-25 thể tích không khí/ thểtích phòng nuôi cấy/ giờ Nhiệt độ duy trì ở 300C trong giai đoạn này thì bào tử sẽ đươchình thành và lượng E.protease sẽ giảm xuống Chính vì thế việc xác định thời điểm thunhận E.protease là rất quan trọng

Nghiền mịn

Toàn bộ khối lượng Enzyme thô thu được từ quá trình trên được đem đi nghiền nhỏ.Mục đích của quá trình này là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần củachế phẩm thô Khi tế bào được phá vỡ, các enyme nội bào trong tế bào sẽ dễ dàng thoát

ra khỏi tế bào Phần lớn enzyme protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát ra khỏi tếbào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường Khi ta nghiền nhỏ thì enzyme cũng sẽthoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn Để cho quá trình nghiền dễ dàng và cóhiệu quả thì người ta thường bổ sung chất trợ nghiền như thạch anh hoặc bột thủy tinh.Các chất này là những chất vô cơ nó có khả năng tạo nên sự ma sát và không tham giavào phản ứng hóa học nên sẽ không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, để sử dụng nóhiệu quả thì trước khi sử dụng nên rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 1000C để loạinước và cũng như tiêu diệt lượng vi sinh vật bám trên nó

Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này sẽ cho kết quả tốt

và dễ dùng rộng rãi trong sản xuất Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiếtđược lượng enzyme trên 90-95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không tan.Nước thường dùng khuếch tán ở nhiệt độ 25- 280c

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly:

- Tỷ lệ nước trích:tùy chế phẩm enzyme mà có chế độ nước trích ly phù hợp.Lượng nước trích ly thường gấp 2-3,5 lần so với lượng chế phẩm nấm mốc.

- Thời gian trích: thời gian trích càng lâu thì khả năng trích càng nhiều enzymehơn nhưng sẽ làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính riêng củaenzyme Thường thì thời gian trích khoảng 30-40 phút

- Nhiệt độ trích: Nhiệt độ trích ly càng cao thì vận tốc trích ly càng tăng những làmgiảm hoạt tính enzyme Nhiệt độ trích ly tối thích là 20 – 300C

Để tăng khả năng thu enzyme, chế phẩm được đánh tơi trước khi trích ly để đạt đượckích thướt hạt 1-5mm

Kết tủa enzyme protease

Dịch thu được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme chưa tinh khiết hoàn toàn vì trong đócòn chứa nước, các chất hòa tan khác từ khói môi trường nuôi cấy Nên việc tiếp theo taphải tách riêng enzyme ra khổi hỗn hợp này

Để thực hiện được này ta phải dùng tác nhân gây tủa Tủa là phương pháp cô đặcenzyme hữu hiệu nhất và là bước tinh sạch enzyme đầu tiên Bằng cách này người ta loạiđược một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme

- Nguyên tắc: Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một sốdung môi

Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon Haitác nhân này cũng dễ tìm và giá tương đói rẻ hơn các tác nhân khác

Trong khi tiến hành kết tủa, thì phải làm lạnh cả dung dịch enzyme và cả những tácnhân gây tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme Khi đổ chất làm kết tủa enzyme vàodung dich enzyme phải tiến hành từ từ để tránh hiện tượng biến tính enzyme

Các enzyme sẽ được kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc thu nhận kếttủa ở dạng paste ( độ ẩm lớn hơn 70%)

Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây tủa, protein lại có thể ở dạngtan ( dung dịch keo) bền như trước thì được gọi là kết tủa thuận nghịch, hoặc mất khảnăng này gọi là kết tủa không thuận nghịch

Vì mục đích của mình là thu nhận enzyme có hoạt tính sinh học cao nên ta tiến hànhkết tủa thuận nghịch

Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein:

- Kết tủa bằng muối:

Khi cho thêm muối ( amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử muối sẽ phân

ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein, do vậy cácphân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại

Khi cho lượng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa Nếu quá trình này thực hiệntrong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không biến tính Sau đó thu proteinbằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối thấp

Phương pháp này thường được sử dụng để tách chiết protein hoad tan Nó cũng được sửdụng để thu phân đoạn các protein khác trong hỗn hợp, vì các phân tử protein lớn cókhuynh hướng kết tuả trước các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong dung dịch Vì thếchúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta nghiên cứu nhiều nhất trong hỗnhợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối khác nhau

- Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Độ hòa tan của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó có hằng số điệnmôi của dung dịch Những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn có thể ổn định cáctươg tác giữa chúng với các phân tử phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòatan của protein trong dung dịch Ngược lại các dung môi có hằng số điện môi nhỏ ngăncản sự phân tán các phân tử protein trong môi trường Do đó sự hòa tan của các phân tửprotein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi hòa tan trong nước vàdung dịch chứa protein

Thường thì kết tảu bằng acetone hoặc ethanol 960 có nhiều thuận lợi hơn vì giá rẻ, cósẵn ở dạng tinh khiết ít tạp chất

Mức độ nhạy cảm nhiệt của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức

độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ

Sấy

Ở trạng thái này enzyme rất dễ biến tính và dễ bị vi sinh vật tấn công do độ ẩm cònkhá cao, để bảo quản lâu hơn, chế phẩm enzyme không mất hoạt tính nhanh thì người tathường sấy kết tủa enzyme protease ở 400C cho đến khi độ ẩm đạt 5-8% là được vàthường thì người ta sấy ở thiết bị sấy phun sương

Tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật sắc ký lọc gel

Nguyên tắc: Lọc gel là phương pháp dùng để tách những phân tử có kích thước,trọng lượng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel Những phân tử có kích thước

đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi đónhững phân tử những phân tử lơn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyểnnhanh và được đưa ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ

Trong trường hợp ta thu nhận enzyme protease thì các lỗ gel phải có kích thước phùhợp với loại enzyme này để khi chúng đi qua cột thì những phân tử khác không phảienzyme protease như những chất tạp hay các enzyme khác có kích thước lớn hơn lỗ gel

sẽ không bị giữ lại và nhành chóng đi xuốn cuối cột và ra ngoài thì ta sẽ thu được enzymeproteasse

III. Ứng dụng.