Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Balanophora J.R.G.Forst. ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÙNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI Balanophora J.R.&G.FORST Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÙNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI Balanophora J.R.&G.FORST Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62.72.04.06 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Viết Thân TS Nguyễn Quốc Bình HÀ NỘI, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Viết Thân TS Nguyễn Quốc Bình Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu tác giả khác Tác giả Nguyễn Thanh Tùng Mục lục Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật phân bố chi Balanophora J.R.&G.Forst 1.1.1 Vị trí phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Balanophora J.R.&G.Forst 1.1.3 Các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G Forst phân bố 1.1.4 Một số khóa phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst 11 1.2 Tổng quan nghiên cứu thành phần hóa học chi Balanophora J.R.&G.Forst 15 1.2.1 Các tanin thủy phân 15 1.2.2 Các acid hydroxybenzoic dẫn chất 19 1.2.3 Các Phenylpropanoid đơn giản 20 1.2.4 Các hợp chất lignan 24 1.2.5 Các coumarin 27 1.2.6 Các flavonoid 28 1.2.7 Các terpenoid 30 1.2.8 Các steroid 32 1.2.9 Các nhóm hợp chất khác 33 1.3 Tổng quan công dụng, tác dụng sinh học chi Balanophora J.R.&G.Forst 33 1.3.1 Công dụng loài thuộc chi Balanophora 33 1.3.2 Nghiên cứu giới tác dụng sinh học chi Balanophora 34 1.3.3 Nghiên cứu Việt Nam tác dụng sinh học chi Balanophora 40 1.4 Tổng quan số mơ hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm thường dùng số mô hình liên quan 42 1.4.1 Một số mơ hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm in vitro 42 1.4.2 Một số mơ hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm in vivo 43 1.4.2.1 Các mô hình gây viêm cấp bán cấp 44 1.4.2.2 Một số mơ hình gây viêm mạn tính 45 1.4.3 Một số mơ hình nghiên cứu tác dụng hạ acid uric ức chế xanthin oxidase 46 1.4.3.1 Một số mơ hình in vitro 47 1.4.3.2 Một số mơ hình in vivo 47 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48 2.1 Nguyên vật liệu 48 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 48 2.1.1.1 Nguyên liệu cho nội dung nghiên cứu hóa học 48 2.1.1.2 Nguyên liệu cho nội dung nghiên cứu tác dụng sinh học độc tính 49 2.1.2 Hóa chất, dung mơi 50 2.1.3 Động vật thí nghiệm 51 2.2 Thiết bị nghiên cứu 51 2.3 Phương pháp nghiên cứu 53 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật 53 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 54 2.3.2.1 Định tính nhóm chất lồi nghiên cứu 54 2.3.2.2 Phân lập hợp chất từ loài nghiên cứu 54 2.3.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập 55 2.3.2.4 Triển khai sắc ký lớp mỏng số loài nghiên cứu 55 2.3.2.5 Phân tích thành phần hóa học sử dụng sắc ký lỏng kết nối khối phổ 56 2.3.2.6 Phân tích thành phần triterpenoid phân đoạn n-hexan loài nghiên cứu sử dụng sắc ký khí kết nối khối phổ 56 2.3.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần 56 2.3.3 Phương pháp đánh giá số tác dụng in vitro 58 2.3.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO 59 2.3.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym xanthin oxidase in vitro 60 2.3.4 Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học in vivo 61 2.3.4.1 Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết mô hình gây tăng cấp acid uric bằng kali oxonat 61 2.3.4.2 Đánh giá tác dụng kháng viêm cấp mơ hình gây phù bằng carrageenan 63 2.3.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm mơ hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat 65 2.3.4.4 Đánh giá độc tính cấp 67 2.4 Xử lý số liệu 68 2.5 Địa điểm thực 69 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 70 3.1 Kết nghiên cứu thực vật 70 3.1.1 Kết nghiên cứu hình thái thực vật xác định tên khoa học mẫu nghiên cứu 70 3.1.1.1 Đặc điểm hình thái xác định tên khoa học mẫu BFI 70 3.1.1.2 Đặc điểm hình thái xác định tên khoa học mẫu BFG 72 3.1.1.3 Đặc điểm hình thái xác định tên khoa học mẫu BS 74 3.1.1.4 Đặc điểm hình thái xác định tên khoa học mẫu BT 76 3.1.2 Kết nghiên cứu hình thái hạt phấn lồi nghiên cứu 78 3.2 Kết nghiên cứu hóa học 85 3.2.1 Định tính nhóm chất 85 3.2.2 Kết phân lập hợp chất từ số loài nghiên cứu 87 3.2.2.1 Kết chiết xuất phân lập hợp chất từ Dó đất (Balanophora fungosa subsp indica) 87 3.2.2.2 Kết chiết xuất phân lập hợp chất từ Dó đất sần (Balanophora fungosa var globosa) 93 3.2.2.3 Kết chiết xuất phân lập hợp chất từ loài Balanophora tobiracola 87 3.2.2.4 Kết chiết xuất phân lập hợp chất từ loài Balanophora subcupularis 103 3.2.3 Kết phân tích sử dụng sắc ký lỏng kết nối khối phổ 105 3.2.5 Kết phân tích sử dụng sắc ký khí ghép nối khối phổ 121 3.3 Kết nghiên cứu tác dụng sinh học 125 3.3.1 Kết sàng lọc số tác dụng in vitro cắn methanol loài nghiên cứu 125 3.3.1.1 Kết đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid cắn methanol loài nghiên cứu 125 3.3.1.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro cắn methanol loài nghiên cứu 127 3.3.2 Kết đánh giá số tác dụng in vivo cao chiết Dó đất 129 3.3.2.1 Tác dụng hạ acid uric huyết 129 3.3.2.2 Tác dụng kháng viêm mơ hình gây phù chân chuột bằng carrageenan 130 3.3.2.3 Tác dụng kháng viêm mơ hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat 131 3.3.3 Kết đánh giá độc tính cấp cao chiết Dó đất 132 3.3.3.1 Thử nghiệm thăm dò 132 3.3.3.2 Thử nghiệm thức 133 Chương BÀN LUẬN 135 4.1 Về kết nghiên cứu đặc điểm thực vật 135 4.1.1 Đặc điểm hình thái xác định tên khoa học 135 4.1.2 Đặc điểm hiển vi 138 4.2 Về kết nghiên cứu thành phần hóa học 139 4.2.1 Kết định tính sơ 139 4.2.2 Phân lập xác định cấu trúc hợp chất 139 4.2.3 Sử dụng phương pháp sắc ký nghiên cứu 140 4.2.3.1 Sắc ký lớp mỏng 141 4.2.3.2 Sắc ký khí 142 4.2.3.3 Sắc ký lỏng kết nối khối phổ 145 4.3 Về kết đánh giá tác dụng sinh học độc tính cấp 147 4.3.1 Về tác dụng sinh học cao chiết dược liệu 147 4.3.2 Về độc tính cấp 148 4.3.3 Về tác dụng sinh học số hợp chất xác định loài nghiên cứu 148 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 151 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ/ký Chữ đầy đủ, giải nghĩa hiệu viết tắt AA APG AS Acid arachidonic Angiosperm Phenology Group (Nhóm phát sinh chủng lồi thực vật hạt kín) Anisaldehyd – acid sulphuric (thuốc thử màu dùng cho sắc ký lớp mỏng) B Balanophora (viết tắt tên chi) CC Column chromatography (Sắc ký cột) COX DPPH Cyclooxygenase 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium DMSO Dimethylsulfosid FBS GC-MS HHDP HPTLC HPLC Fetal Bovine Serum (Huyết thai bò) Gas chromatography – Mass spectrometry (Sắc ký khí kết nối khối phổ) HexahydroxydiphenoylHigh performance Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng hiệu cao) High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IC50 Inhibitation concentration at 50% (Nồng độ ức chế tối đa 50%) KO Kali oxonat LD50 LOD Lethal dose 50% (Liều gây chết trung bình) Limit of detection (giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantification (giới hạn định lượng) LOX LPS 5-lipooxygenase Lipopolysaccharid MS Mass spectrometry (phổi khối lượng phân tử) NIST NMR NO NP/PEG OECD PTLC National Institute of Standard and Technology (Viện tiêu chuẩn công nghệ quốc gia - Hoa Kỳ) Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) Nitric oxid Natural products-polyethylene glycol reagent (thuốc thử sử dụng cho sắc ký lớp mỏng, tạo huỳnh quang sáng UV 365 nm) Organization for Economic Cooperation and Development (Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế) Preparative Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng điều chế) Rf Retention factor (hệ số lưu giữ sắc ký lớp mỏng) RI rentention indices SC50 Scavenging concentration at 50% (Nồng độ trung hoà 50% gốc tự do) SKĐ Sắc ký đồ subsp./ssp subgen subspecies (phân loài/loài phụ) subgenus (phân chi) TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TVC var Thực vật chí varietas (thứ) (tiếng latin) VQG Vườn quốc gia XOD xanthin oxidase Phụ lục 4.9 Phổ hợp chất BT3.1 Phổ 1H NMR Phổ MS Phụ lục 4.10 Phổ hợp chất BT6.1 Phổ 1H NMR Phổ MS Phụ lục 4.11 Phổ hợp chất S1 Phổ 1H NMR Phổ MS Phụ lục 4.12 Phổ hợp chất S2 Phổ 1H NMR Phổ MS Phụ lục Dữ liệu liên quan đến kết phân tích GC/MS phân đoạn n-hexan mẫu nghiên cứu Phụ lục 5.1 Một số phân mảnh đặc trưng triterpenoid Loại triterpenoid Cấu trúc khối lượng ion phân mảnh Ghi Khối lượng mảnh khơng phụ thuộc vào nhóm Lupan Oleanan Khối lượng mảnh phụ thuộc vào nhóm C-3 Lupan Khối lượng mảnh khơng phụ thuộc vào nhóm Olean Phụ lục 5.2 Dữ liệu phổ khối hợp chất xác định phân đoạn n-hexan mẫu nghiên cứu Phổ GC/MS β-amyrin Phổ GC/MS β-amyron Phổ GC/MS β-amyrin acetat Phổ GC/MS lupeol Phổ GC/MS lupenon Phổ GC/MS lupeol acetat