Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của hai loài Giảo cổ lam Gynostemma sp. tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BỘ Y TẾ THÂN THỊ KIỀU MY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HAI LOÀI GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA SP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI THÂN THỊ KIỀU MY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HAI LOÀI GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA SP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62.72.04.06 Người hướng dẫn khoa học: GS TS Phạm Thanh Kỳ HÀ NỘI, NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn GS TS Phạm Thanh Kỳ Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả Thân Thị Kiều My LỜI CẢM ƠN Trong q trình nghiên cứu hồn thành luận án này, nhận nhiều hỗ trợ từ trường Đại học Dược Hà Nội, giúp đỡ thầy cô giáo, nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực, ủng hộ bạn bè gia đình Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS TS Phạm Thanh Kỳ - người Thầy trực tiếp hướng dẫn, hết lịng bảo tận tình khích lệ tơi suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Tơi xin chân thành cảm ơn: Thầy giáo, nhóm nghiên cứu cán đồng nghiệp môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội ; Các thầy cô giáo, cán môn Thực vật, môn Dược học cổ truyền, môn Công nghiệp dược, môn Dược lý – trường Đại học Dược Hà Nội ; Các cán Phòng Đào tạo sau đại học, trường Đại học Dược Hà Nội ; Các cán Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ; Các cán Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội ; giúp đỡ chuyên môn tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận án Nhân dịp này, xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu, cán phòng ban, môn chuyên ngành trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận án Tơi vơ cảm kích với ủng hộ bạn bè động viên gia đình tơi q trình thực luận án Xin trân trọng cảm ơn Thân Thị Kiều My MỤC LỤC   ĐẶT VẤN ĐỀ 1  TỔNG QUAN 3  1.1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume 3  1.1.2 Phân bố loài chi Gynostemma Blume 4  1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Gynostemma Blume 5  1.1.4 Đặc điểm thực vật số loài thuộc chi Gynostemma Blume 6  1.1.5 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh loài thuộc chi Gynostemma Blume 7  1.2.1 Thành phần hóa học lồi Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino 10  1.2.2 Thành phần hóa học hai lồi đối tượng nghiên cứu 27  1.3.1 Tác dụng sinh học 28  1.3.2 Độc tính 39  NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42  2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 42  2.1.2 Hóa chất, dung mơi 43  2.1.3 Trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 44  2.2.1 Nghiên cứu thực vật 45  2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 47  2.2.3 Đánh giá độc tính cấp tác dụng sinh học 49  2.2.4 Xử lý số liệu 55  KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56  3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 56  3.1.2 Kết nghiên cứu sinh học phân tử 58  3.1.3 Kết giám định tên khoa học hai mẫu nghiên cứu 61  3.1.4 Kết nghiên cứu đặc điểm vi học 61  3.2.1 Định tính nhóm chất hữu hai loài nghiên cứu 66  3.2.2 Phân lập hợp chất từ hai loài nghiên cứu 68  3.2.3 Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập 71  3.3.1 Đánh giá độc tính cấp 114  3.3.2 Đánh giá tác dụng hạ glucose máu 117  3.3.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa 118  3.3.4 Đánh giá tác dụng gây độc với số dòng tế bào ung thư 122  BÀN LUẬN 124  4.4.1 Về tác dụng hạ glucose máu 133  4.4.2 Về tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa 135  4.4.3 Về tác dụng gây độc tế bào saponin phân lập 137  KẾT LUẬN 140  DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Viết đầy đủ Ara α-L-arabinopyranosyl ALT Enzym Alanine Aminotransferase AST Enzym Aspartate Aminotransferase CC Column Chromatography- Sắc ký cột COSY Correclation spectrometry- Phổ COSY CS% DEPT Dl Cell survival %- % tế bào sống sót Distorionless Enhancement Dược liệu Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Electrospray ionization mass spectroscopy -Khối phổ ion hóa điện tử EtOH Ethanol EtOAc Ethylacetat G Gynostemma GCL Giảo cổ lam GC-MS Glc HL-60 HMBC Polarisation Transfer- Phổ DEPT DMSO ESI- MS by Gas Chromatoghraphy Mass Spectroscopy- Sắc kí khí kết hợp khối phổ β-D-glucopyranosyl Human hepatocellular carcinoma- Tế bào ung thư bạch cầu người Heteronuclear multiple bond correlation- Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Proton H-NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectrography- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HPLC HR- ESI- MS HSCs HSQC IC50 High performance liquid chromatography – Sắc ký lỏng hiệu cao High resolution Electrospray ionization mass spectrometry- Phổ khối phân giải cao Hepatic Stellate Cells Heteronuclear Single Quantum Correlation- Phổ tương tác dị hạt nhân liên kết Inhibitory concentration 50%- Nồng độ ức chế 50% IFN Interferon IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M IR Infra red – phổ hồng ngoại ITS Internal transcribed spacer- nhóm gen nhân LD50 Lethal dose 50%- Liều gây chết 50% LDL Low density lipoprotein- Lipoprotein tỷ trọng thấp MDA Malonyl dialdehyd MeOH Methanol MS MTT NMR Mass spectrometry – Phổ khối 3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromid Nulear magnetic resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NOESY OD OVCAR-8 Nuclear Overhauser Effect Spectrometry -Phổ hiệu ứng hạt nhân Overhauser Optical density- Mật độ quang học Human ovarian cancer cell line- Dòng tế bào ung thư buồng trứng PAR Paracetamol Rha L-Rhamnopyranosyl SKLM Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo TOF- MS Time of flight mass spectrometry- Phổ khối đầu dò thời gian bay tt Thể trọng ttc Thể trọng chuột WHO Xyl World Health Organization – Tổ chức y tế giới D- Xylopyranosyl PL 185   Phụ lục 19 Phổ hợp chất 12.3 Phổ 1H-NMR Phổ 13C- NMR Phổ HMBC Phổ HSQC PL 186   PL 187   PL 188   PL 189   PL 190   PL 191   PL 192   PL 193   PHỤ LỤC GIẢI PHẪU MƠ BỆNH HỌC Ảnh 1: Hình ảnh gan chuột lơ chứng sinh học (chuột số 01) Gan bình thường (HE x 400) (HE x 400: Nhuộm Hematoxylin - Eosin, độ phóng đại 400 lần) Ảnh 2: Hình ảnh gan chuột lô chứng sinh học (chuột số 03) Bào tương tế bào gan có hốc sáng nhỏ, gan thối hóa nhẹ (HE x 400) Ảnh 3: Hình ảnh gan chuột lơ mơ hình (chuột số 14) Có xâm nhập viêm nhiều hốc sáng nhỏ (HE x 400) PL 194   Ảnh 4: Hình ảnh gan chuột lơ mơ hình (chuột số 23) (HE x 400) Bào tương tế bào gan có nhiều hốc sáng nhỏ Gan thối hóa vừa Ảnh 5: Hình ảnh gan chuột lơ silymarin (chuột số 29) Gan bình thường (HE x 400) Ảnh 6: Hình ảnh gan chuột lơ silymarin (chuột số 34) Có xâm nhập tế bào viêm, tế bào gan bình thường (HE x 400) PL 195   Ảnh 7: Hình ảnh gan chuột lơ G1 liều thấp (chuột số 155) Thối hóa vừa tế bào gan xâm nhập viêm (HE x 400) Ảnh 8: Hình ảnh gan chuột lơ G1 liều thấp (chuột số 156) Gan thối hóa mức độ vừa (HE x 400) Ảnh 9: Hình ảnh gan chuột lô G1 liều cao (chuột số 165) Gan thối hóa mức độ nhẹ (HE x 400) PL 196   Ảnh 10: Hình ảnh gan chuột lơ G1 liều cao (chuột số 166) Gan bình thường (HE x 400) Ảnh 11: Hình ảnh gan chuột lơ G1 liều cao (chuột số 167) Thối hóa mức độ vừa tế bào gan xâm nhập viêm (HE x 400) Ảnh 12: Hình ảnh gan chuột lơ G3 liều thấp (chuột số 183) Có hoại tử tế bào gan, thối hóa vừa tế bào gan xâm nhập viêm (HE x 400) PL 197   Ảnh 13: Hình ảnh gan chuột lơ G3 liều thấp (chuột số 184) Thối hóa mức độ vừa tế bào gan xâm nhập viêm (HE x 400) Ảnh 14: Hình ảnh gan chuột lơ G3 liều thấp (chuột số 185) Gan thối hóa mức độ nhẹ (HE x 400) Ảnh 15: Hình ảnh gan chuột lơ G3 liều cao (chuột số 188) Gan bình thường (HE x 400) PL 198   Ảnh 16: Hình ảnh gan chuột lô G3 liều cao (chuột số 189) Gan bình thường, có xâm nhập viêm nhẹ (HE x 400) Ảnh 17: Hình ảnh gan chuột lơ G3 liều cao (chuột số 190) Gan thối hóa mức độ nhẹ (HE x 400) PL 199