TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ CHI Gouania Jacq
1.1.1 Tổng quan về thực vật chi Gouania Jacq
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan, chi Gouania Jacq thuộc: [7], [8]
Phân lớp Hoa hồng (Rosidase)
Liên bộ Táo ta (Rhamnanae)
1.1.1.2 Đặc điể m th ự c v ậ t chi Gouania Jacq
Chi Gouania nổi bật trong họ Táo ta nhờ vào những đặc điểm riêng biệt, bao gồm thân leo có tua cuốn và quả có ba cánh mở theo ba đường của ba lá noãn.
[9] Đặc điểm thực vật cụ thể của chi như sau:
Cây bụi leo có tua cuốn và lá mọc so le, với lá kèm dễ rụng Cuống lá có khía rãnh và mép lá khía răng cưa Hoa lưỡng tính mọc thành chuỳ ở đầu cành hoặc kẽ lá, có đài hình ống ngắn với 5 lá đài hình trứng hoặc hình tam giác Cánh hoa có 5, hình thìa, và nhị 5 với bao phấn đính lưng Đĩa mật dày, hình ngũ giác, có thể nhẵn hoặc có lông, trong khi bầu hạ nằm sâu trong đĩa mật, có 3 ô, mỗi ô chứa 1 noãn Quả có 3 cánh, khuyết ở hai đầu, với 3 hạt màu nâu đỏ, bóng, hình trứng ngược và có nội nhũ mỏng.
1.1.1.3 Các khóa phân lo ạ i chi Gouania Jacq
Chi Gouania được phát hiện và phân loại lần đầu bởi Jacquin vào năm 1763, với hai loài tại Haiti là G tomentosa và G glabra Đến nay, đã có tổng cộng 6 khóa phân loại chi Gouania được báo cáo trên toàn thế giới.
Khóa phân loại chi Gouania ở Philippin
Năm 2020, dựa vào các đặc điểm hình thái học, Daniel Cahen đã phân loại chi
Gouania tại Philippines có tổng cộng 5 loài khác nhau Các đặc điểm chính được sử dụng để phân loại bao gồm lá, lá kèm, đĩa mật và quả Qua quan sát, tác giả nhận thấy rằng lá của loài Gouania có những đặc điểm riêng biệt.
Leptostachya chỉ có 4-5 cặp gân phụ, ít hơn so với các loài khác thường có 5-7 cặp gân Ngoài ra, các tuyến dọc theo mép lá của loài này có hình dạng lõm, khác biệt với các loài khác có tuyến lồi.
G leptostachya cũng là loài duy nhất hai mặt lá nhẵn, chỉ có lông thưa ở trên gân lá Lá kèm ở hầu hết các loài đều rụng sớm, duy chỉ có loài G leptostachya là lá kèm tồn tại Đĩa mật loài G leptostachya cũng khác với các loài còn lại ở điểm có hình đa giác với các cạnh song song Quả loài G leptostachya cũng to hơn các loài còn lại và thân quả nhẵn, lúc khô cùng màu với ba cánh [15]
Khóa phân loại chi Gouania ở Trung Quốc
Thực vật chí Trung Quốc đã xác nhận sự tồn tại của hai loài thuộc chi Gouania, bao gồm G javanica và G leptostachya Việc phân loại hai loài này dựa vào đặc điểm hình thái của lá.
G javanica có lông màu vàng nâu dày đặc hoặc nhiều lông trên gân lá Lá G leptostachya nhẵn không có lông hoặc có lông thưa trên gân lá [14]
Loài G leptostachya được chia thành ba phân loại dựa trên đặc điểm quả và lá kèm G leptostachya var macrocarpa có quả lớn hơn với kích thước 12-13 x 13-18 mm Trong khi đó, G leptostachya var leptostachya và G leptostachya var tonkinensis có kích thước quả tương tự, 9-10 x 10-12 mm Tuy nhiên, G leptostachya var leptostachya có lá kèm sớm rụng, trong khi G leptostachya var tonkinensis giữ lá kèm, bao quanh thân và có mép khía răng cưa.
Khóa phân loại chi Gouania ở Bắc Mỹ
Amy Pool là người đưa ra khóa phân loại chi Gouania ở Bắc Mỹ vào năm 2011
Tác giả đã báo cáo 15 loài thuộc chi này, phân loại chúng dựa trên các đặc điểm hình thái như cành, lá, lá kèm, hoa và quả, cũng như các đặc điểm sinh sản của cây.
Khóa phân loại chi Gouania ở Hawaii và Tây Ấn Độ Dương
Chi Gouania đã được công nhận là một phần của hệ thực vật Hawaii từ năm 1835 bởi tác giả F J F Meyen Năm 1969, Harold St John đã mô tả chi tiết 14 loài thuộc chi Gouania, xây dựng khóa phân loại dựa trên các đặc điểm chính như cành, lá, hoa, đĩa mật và quả.
Khóa phân loại chi Gouania ở Madagascar và Tây Ấn Độ Dương
Sven Buerki (2011) đã công bố khóa phân loại chi Gouania tại Madagascar và Tây Ấn Độ Dương, xác định 17 loài dựa trên các đặc điểm hình thái khác nhau, bao gồm hình dạng.
5 màu sắc, đặc điểm mép lá, lông trên bề mặt lá, gân lá, lá kèm, đặc điểm của hoa và của quả [11]
Khóa phân loại chi Gouania ở Cuba
Dasmiliá Cruz Arozarena báo cáo 3 loài thuộc chi Gouania ở Cuba và xây dựng khóa phân loại dựa trên các đặc điểm của lá và quả [16]
Nghiên cứuphân loại chi Gouania ở Việt Nam
Nhà thực vật học và dược sĩ người Pháp Charcles – Joseph Marie Pitard (viết tắt là “J Pit.”) là người đầu tiên nghiên cứu và phân loại họ Táo ta (Rhamnaceae) và chi Gouania tại Việt Nam Trong tác phẩm “Flore Générale de L’indochine”, Tom 1 (Faseicule 8) xuất bản năm 1912, ông đã cung cấp khóa phân loại và mô tả chi tiết hai loài Gouania: G javanica Miq và G leptostachya DC Qua nghiên cứu hình thái G leptostachya ở Việt Nam và Lào, J Pitard đã phân chia loài này thành hai thứ dựa trên kích thước quả: G leptostachya DC var macrocarpa Pit với quả kích thước lớn (10-12 × 13-15 mm) và G leptostachya DC var tonkinensis Pit với quả nhỏ hơn (9-10 × 10-12 mm).
Theo nghiên cứu phân loại của J Pitard, các nhà thực vật học Việt Nam, Phạm Hoàng Hộ và Nguyễn Tiến Bân, xác nhận rằng chi Gouania trong hệ thực vật Việt Nam bao gồm hai loài và hai thứ.
Chi Gouania trên thế giới có khoảng 50 đến 66 loài, phân bố chủ yếu ở khu vực cận nhiệt đới và nhiệt đới Theo nghiên cứu của Medan & Schirarend (2004) và Weberbauer, số lượng loài của chi này dao động từ 50 đến 70, với tổng cộng 67 loài đã được xác định Tại Việt Nam, chi Gouania bao gồm hai loài chính là G leptostachya DC và G javanica Miq.
Loài G leptostachya DC được tìm thấy tại các tỉnh Lạng Sơn, Hòa Bình, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đồng Nai và Bà Rịa-Vũng Tàu, trong khi loài G javanica Miq phân bố ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Trị, Kon Tum và An Giang.
Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Gouania trên thế giới
STT Tên khoa học Phân bố TLT
Phía bắc Madagascar và quần đảo Comoro
Tây và Tây Nam Madagascar
Costa Rica đến Nam Mỹ
Thái Bình Dương đến miền trung Mexico, phía nam
Rải rác trong rừng từ trung bình đến cao (800 đến
Madagascar, quần đảo Comoro và đảo Re’union
Loài đặc hữu ở những ngọn đồi thuộc tỉnh Pinar del Río, Cuba, độ cao 290-500 m [13]
Yucatan Peninsula, Mexico (trong rừng có độ cao
Guatemala, Honduras (trong rừng thông có độ cao
Trong rừng thứ sinh gần Manongarivo, Tây Bắc Madagascar
Khu vực Thái Bình Dương của eo Tehugeepec,
Chỉ có ở Analamerana và Daraina (Tây Bắc
Standl Đông Nam Nicaragua, Costa Rica và Panama (trong các khu rừng ẩm có độ cao 0-1000m) [9]
Phổ biến ở Tây và Tây Nam Madagascar, Mayotte,
DC Ấn Độ, Philippin, Trung Quốc [24],
29 G lineata Tul Phổ biến ở Tây Madagascar [11]
(L.) Urb Đông Nam Hoa Kỳ (Florida), Bắc Mexico đến Bắc
Chỉ phát hiện ở đảo Re´union
A Pool Đại Tây Dương Mexico, miền đông Puebla [13]
Trung tâm Madagascar, châu Phi [11],
Tây Bắc Madagascar (vùng Sambirano và Ankarana)
Phổ biến trong rừng ẩm ở độ cao trung bình, phía đông Madagascar [11]
Mexico, Guatemala, Honduras, Nicaragua, Costa Rica, Panama, Cuba, Tobago, Trinidad, Colombia, Venezuela, Guyana, Brazil, Ecuador, Peru, Bolivia, Paraguay, Đông Bắc Argentina, Bắc Mỹ
A Pool Đại Tây Dương (Mexico, Nicaragua)
Wiggins Đại Tây Dương (Mexico)
Phổ biến ở rừng độ cao từ thấp đến trung bình (0-
1100 m) ở phía đông Madagascar và ở Mauritius [11]
DC Đại Tây Dương (Mexico)
Callm Đông Nam Madagascar (gần Taolagnaro)
Mexico, Tây Bắc Costa Rica, Bắc Panama, Bắc
Chỉ được ghi nhận ở Daraina và Sahafary (Tây Bắc Madagascar)
1.1.2 Thành phần hoá học của các loài thuộc chi Gouania
TỔNG QUAN VỀ DÂY ĐÒN GÁNH ( Gouania leptostachya DC.)
1.2.1 Đặc điểm thực vật và sinh thái cây Dây đòn gánh
Dây đòn gánh, còn được biết đến với nhiều tên gọi khác như dây gân, dây đòn kẻ trộm, dây đoi kiến, dây xà phòng, dây râu rồng, dơn tai mèo, seng thanh (Mường), poát pào, khau căn (Tày) và chừa than hồ (Thái), là một loại dây có nhiều công dụng và ý nghĩa trong văn hóa dân gian.
Cây bụi leo có chiều dài lên tới hàng mét với thân cành nhẵn, màu nâu đỏ xám nhạt Lá cây mọc so le, có hình bầu dục, dài từ 4-10cm và rộng 2-6cm, với gốc tròn hoặc hình tim và đầu thuôn nhọn, mép lá có khía răng cưa Ở phần ngọn cành, lá non sẽ biến thành tua cuốn, có bề mặt nhẵn và mặt dưới nhạt màu với gân nổi rõ Lá kèm lớn và bền, bao quanh thân cây, cũng có khía răng, trong khi cuống lá dài từ 1-2cm.
Cụm hoa của cây mọc thành chuỳ ở kẽ lá hoặc đầu cành, có chiều dài từ 10-20cm Hoa nhỏ, đơn tính với màu trắng lục, và lá bắc hình tam giác nhọn Hoa đực có 5 lá đài lông ở mặt ngoài, 5 cánh hoa với móng hẹp, cùng 5 nhị dài bằng tràng và bao phấn nhỏ Hoa cái có bầu hạ với 3 ô.
Quả khô có 3 cánh dày, khuyết ở hai đầu, màu nâu vàng sáng Mùa hoa: tháng 7-8; mùa quả tháng 9-12 [40]
Loài Gouania leptostachya DC có ba thứ [10], [40]:
- Thứ leptostachya DC.: có quả to, dài 10-12mm, rộng 13-15mm, đen nhạt có cánh dày Mùa quả tháng 12
Thứ tonkinensis Pitard có đặc điểm lá răng cưa nhỏ và lá kèm rộng, ôm lấy thân ở phía dưới Hoa của loài này mọc dưới, đính trên các trục dài và kèm theo lá bắc Quả của nó có màu nâu vàng nhạt.
- Thứ macrocarpa Pitard: quả kích thước 12–13 × 13–18 mm, có cánh dày
Hình 1.3 Hình ảnh cây Dây đòn gánh lúc ra hoa
Nguồn: PGS.TS Trần Văn Ơn
Dây đòn gánh là loại dây leo ưa sáng, thường xuất hiện trong các quần thể rừng thứ sinh và đồi cây bụi, cũng như ở vùng núi đá vôi tại các tỉnh vùng núi thấp và trung du Cây phát triển tốt ở nơi có nhiều ánh sáng và ra hoa quả hàng năm Đặc biệt, sau khi bị chặt, phần gốc và thân còn lại có khả năng tái sinh, tuy nhiên chưa quan sát thấy cây con tái sinh từ hạt.
1.2.2 Thành phần hoá học của cây Dây đòn gánh ( Gouania leptostachya DC.)
Khảo sát ban đầu cho thấy phần trên mặt đất của Dây đòn gánh chứa saponin, flavonoid, đường khử, caroten và sterol Nghiên cứu đã phân lập được 6 flavonoid và 3 hợp chất triterpenoid từ các công trình công bố trong và ngoài nước.
1 hợp chất saponin và 2 hợp chất benzopyran từ loài G leptostachya DC
Năm 2019, nhóm nghiên cứu Nguyễn Thị Kim Thúy đã công bố 2 hợp chất flavonoid trong Dây đòn gánh là quercetin 3-O-β-ᴅ-xylopyranosyl-(1→2)-α-L- rhamnopyranosid (19), quercetin 3-O-6-E-p-coumaroyl-β-ᴅ-glucopyranosyl-(1→2)-α-
L-rhamnopyranosid (20) [4] Trước đó, 4 flavonoid prodelphinidin B3 (21), prodelphinidin C (22), (-)-epigalocatechin (23) và (+)-galocatechin (24) cũng được phân lập từ thân của G leptostycha DC var tonkinensis Pitard bởi nhóm tác giả Yao
Nguyễn Văn An đã phân lập được ba hợp chất triterpenoid khung ceanothan từ cao phân đoạn n-BuOH của Dây đòn gánh: acid gouanic C (1), acid ceanothenic (2) và acid gouanic A (3) [5]
Nguyễn Thị Kim Thúy (2019) công bố phân lập được 1 hợp chất saponin triterpenoid là joazeirosid A (35) [4]
Hai dẫn xuất của benzopyran, 1-[(rel2S,3R)-3,5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-2H- chromen-2-yl] ethanon (38) và 1-[(rel2S,3S)-3,5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-2H- chromen-2-y1] ethanon (39) được phân lập từ thân của G leptostycha DC var tonkinensis Pitard [3]
1.2.3 Tác dụng sinh học của Dây đòn gánh
Dây đòn gánh G leptostycha DC đã được nghiên cứu và chứng minh có nhiều tác dụng sinh học quan trọng, bao gồm khả năng chống viêm, điều chỉnh đường huyết, tác dụng chống oxy hóa và kháng khuẩn hiệu quả.
Cao chiết methanol từ G leptostachya có khả năng chống viêm bằng cách ức chế hoạt động của Src và NF-κB, những chất trung gian quan trọng trong phản ứng viêm, theo nghiên cứu của Tô Thị Mai Dung và cộng sự (2015).
Tác dụng trên đường huyết
Các hợp chất benzopyran: 1-[(rel2S,3R)-3,5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-2H- chromen-2-yl] ethanon (38) và 1-[(rel2S,3S)-3,5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-2H- chromen-2-y1] ethanon (39) và 4 flavonoid là prodelphinidin B3 (21), prodelphinidin
C (22), (-) - epigalocatechin (23) và (+) - galocatechin (24) có tác dụng ức chế α- glucosidase Trong đó, hợp chất (22) thể hiện tác dụng tốt nhất [3]
Tác dụng chống oxy hóa
Cao chiết ethanol G leptostachya thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh do tác nhõn oxy húa NO với IC 50 = 2,34 àg/mL [37]
Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn An năm 2010, n-BuOH cho thấy tác dụng kháng vi sinh vật không đáng kể đối với vi khuẩn và hoàn toàn không có hiệu quả đối với nấm.
1.2.4 Công dụng theo y học cổ truyền của cây Dây đòn gánh
Thân và lá Dây đòn gánh có vị chua chát, se, hơi đắng và tính mát, mang lại nhiều tác dụng như lương huyết, giải độc, thư cân, hoạt lạc, thanh nhiệt và tiêu viêm.
Giã nhỏ cây và lá, sau đó trộn với rượu hoặc giấm để xoa bóp vào các vùng sưng tấy, mụn nhọt, đinh độc, hoặc dùng để đắp lên vết bỏng, vết thương và lở ngứa.
Lá giã nát đắp vào trán, gan bàn tay để giảm sốt, sài giật, cảm gió
Các thầy lang người Dao Tiền tại xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, Thái Nguyên đã sử dụng cây Dây đòn gánh (G leptostachya DC.) để chữa bệnh ngoài da Phương pháp sử dụng bao gồm đun nước tắm gội, giã nát để đắp, ngâm rượu bôi, và sắc nước để bôi hoặc ngâm Tại Ấn Độ, lá cây này cũng được dùng để giã đắp lên vết thương, trong khi ở Trung Quốc, dây lá được áp dụng để trị đau mỏi cơ thể, bỏng lửa và lở ngứa.
Dây đòn gánh thông mạch có tác dụng làm tan máu ứ, tiêu sưng, giảm đau và chữa trị các triệu chứng sưng tấy, đau nhức do chấn thương, ngã, hoặc do gánh vác nặng Sản phẩm này hiệu quả trong việc giảm đau ở vùng lưng, sụn xương sống và cơ lưng Liều dùng khuyến nghị là 8-16g, có thể sắc uống hoặc ngâm rượu để sử dụng.
1.2.5 Một số bài thuốc có Dây đòn gánh
Để chữa sưng tấy, tụ máu và đau nhức do chấn thương, bạn có thể sử dụng hỗn hợp từ lá Dây đòn gánh 10g, lá Náng hoa trắng 10g, và lá Bạc thau 8g Tất cả các loại lá này nên được dùng tươi, giã nát và trộn với một ít rượu, sau đó đắp và bó vào vùng bị thương Thực hiện một lần mỗi ngày để đạt hiệu quả tốt nhất.
Để chữa bỏng vôi hiệu quả, bạn có thể sử dụng lá Dây đòn gánh tươi giã nát kết hợp với quả Bồ kết phơi khô tán bột Trộn hai thành phần này lại và bôi lên vết bỏng vài lần trong ngày Ngoài ra, bạn cũng có thể giã nát thân và lá Dây đòn gánh, sau đó ngâm với một ít nước sôi để nguội, rồi lấy dịch để bôi vào vết bỏng.
- Chữa sốt cao gây co giật ở trẻ em: lá Dây đòn gánh 10g, vỏ Núc nác hay quả khế
10g, lá Ngải cứu 8g, lá Nhọ nồi 8g, rễ Táo rừng 8g Tất cả phơi khô sao vàng, sắc với 400ml nước, còn 100ml chia 2 lần, uống trong ngày [7]
- Chữa rắn cắn: Lá Dây đòn gánh tươi giã nát, thêm ít nước gạn uống, bã đắp
- Diệt chấy: RễDây đòn gánh nấu với nước, gội đầu.
TỔNG QUAN VỀ VIÊM
Viêm là phản ứng tại chỗ của cơ thể trước sự kích thích hoặc tổn thương mô, thể hiện qua các triệu chứng như sưng, nóng, đỏ, đau và rối loạn chức năng của cơ quan bị ảnh hưởng Phản ứng này liên quan đến sự tương tác phức tạp giữa các mô liên kết và tuần hoàn mao mạch tại vùng tổn thương.
Phản ứng viêm xuất phát từ nhiều nguyên nhân khác nhau, được chia thành hai nhóm chính: nguyên nhân bên ngoài và nguyên nhân bên trong Tuy nhiên, việc phân biệt rõ ràng giữa hai loại nguyên nhân này là một thách thức, vì nguyên nhân bên ngoài thường có thể dẫn đến những biến đổi bên trong.
Nhiễm khuẩn là nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều vấn đề sức khỏe, với sự tác động của vi khuẩn, virus, nấm mốc và ký sinh trùng thông qua các độc tố và sản phẩm chuyển hóa.
Tác nhân vật lý gây ra chấn thương có thể bao gồm cơ học như va đập và vết thương, nhiệt học với các loại bỏng nóng hoặc lạnh, tia xạ, và sự xuất hiện của dị vật.
Tác nhân hóa học, bao gồm các chất hòa tan như acid, kiềm và muối, có khả năng gây hoại tử tế bào và tổn thương chất gian bào Ngoài ra, các chất này cũng có thể kích thích quá trình thực bào của bạch cầu đa nhân.
Nguyên nhân bên trong gây ra các vấn đề sức khỏe có thể bao gồm hoại tử tổ chức, nghẽn mạch, xuất huyết, và rối loạn thần kinh dinh dưỡng như viêm tắc động mạch Ngoài ra, sự thay đổi nội sinh của các chất gian bào, bao gồm hình thành phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể và các phản ứng miễn dịch như quá mẫn và tự miễn, cũng đóng vai trò quan trọng.
Viêm được phân thành hai loại chính: viêm cấp tính và viêm mạn tính Viêm cấp tính là phản ứng ngay lập tức của hệ miễn dịch đối với mầm bệnh và tổn thương mô.
Quá trình tự giới hạn nhanh trong viêm cấp tính, được trung gian bởi eicosanoid và amin hoạt mạch, gia tăng lưu lượng huyết tương và bạch cầu đến vùng bị nhiễm trùng Các triệu chứng điển hình của viêm cấp tính bao gồm sưng, nóng, đỏ, đau và mất chức năng.
Viêm cấp tính là phản ứng ngắn hạn của cơ thể, thường được xem như một biện pháp tự điều trị Trong giai đoạn đầu của quá trình viêm, các chất trung gian tiền viêm như prostaglandin và leukotrien đóng vai trò quan trọng Tuy nhiên, sự chuyển biến từ viêm cấp tính sang viêm mạn tính trong nhiều bệnh lý phổ biến thường liên quan đến sự gia tăng các chất trung gian gây viêm Viêm mạn tính dẫn đến việc giải phóng nhiều loại cytokine và yếu tố kích thích tăng trưởng, làm tăng sinh các tế bào miễn dịch như bạch cầu lympho và nguyên bào sợi, từ đó gây tổn thương mô liên tục.
1.3.4 Các phản ứng của quá trình viêm
Khi có yếu tố gây viêm xâm nhập, cơ thể phản ứng bằng cách kích hoạt một chuỗi các phản ứng tại chỗ của mạch máu và mô, cùng với phản ứng hệ thống toàn thân Diễn biến của quá trình viêm được minh họa trong hình 1.4.
Tại ổ viêm, ba biến đổi chính bao gồm rối loạn tuần hoàn, rối loạn chuyển hóa và tổn thương mô, tất cả đều liên quan chặt chẽ với nhau Trong viêm cấp tính, khi có yếu tố viêm, hiện tượng co mạch xảy ra sớm và ngắn, sau đó là sự giãn nở của tiểu động mạch, dẫn đến sung huyết động mạch, sung huyết tĩnh mạch và ứ máu Những thay đổi này làm biến đổi cấu trúc vi tuần hoàn, cho phép protein huyết tương thoát ra và bạch cầu xuyên mạch xuất hiện tại vùng viêm, tạo ra dịch rỉ viêm, gây ra các triệu chứng sưng, nóng, đỏ Đau chỉ xuất hiện muộn hơn do tác động của các chất trung gian và bạch cầu thực bào.
Giai đoạn phản ứng mô bao gồm sự huy động của các tế bào như hệ thống thực bào đơn nhân - lympho bào, cùng với các tế bào mô liên kết và biểu mô Trong trường hợp viêm cấp, có thể có sự tham gia của đại thực bào và lympho bào; tuy nhiên, phản ứng mô chủ yếu diễn ra trong viêm mạn tính.
Sốt là biểu hiện nổi bật nhất của viêm, đặc biệt là viêm do nhiễm trùng Trong giai đoạn cấp, các triệu chứng khác của viêm như mất ngủ, đau đớn, chán ăn, rối loạn chuyển hóa đường và mỡ, hạ huyết áp, cũng như các rối loạn huyết động khác thường diễn ra rõ rệt.
Hình 1.4 Diễn biến phản ứng viêm [53]
Phospholipase A2 (PLA2) and Phospholipase C (PLC) play crucial roles in cellular signaling, while Protein Kinase C (PKC) is essential for various cellular functions Platelet-activating factor (PAF) and diacylglycerol (DAG) are key mediators in inflammation, alongside inositol triphosphate (IP3) Cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX) are important enzymes in the synthesis of prostaglandins (PGs) and leukotrienes (LTs), which are critical for inflammatory responses Matrix metalloproteinases (MMPs) and human leukocyte elastase (HLE) contribute to tissue remodeling during inflammation Interleukins (ILs) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) are significant cytokines that activate nuclear factor kappa beta (NF-κB) and activator protein-1 (AP-1), key transcription factors in inflammation Mitogen-activated protein kinases (MAPKs), including P38 kinase, c-Jun N-terminal kinase (c-JUN), and extracellular signal-regulated kinase (ERK), are vital signaling molecules that mediate cellular responses to stress and inflammation.
1.3.5 Các chất trung gian trong phản ứng viêm
Các chất trung gian trong phản ứng viêm được gọi là chất khơi mào phản ứng
Hệ thống chất trung gian trong phản ứng viêm rất đa dạng và phức tạp, được phân chia thành hai nhóm chính: chất có nguồn gốc từ tế bào và chất có nguồn gốc từ huyết tương.
Các chất có nguồn gốc tế bào
Các chất chuyển hoá của acid arachidonic
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NỘI DUNG VÀ THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
- Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
- Mô tảđặc điểm thực vật và xác định đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu
- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong mẫu Dây đòn gánh nghiên cứu
- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ mẫu Dây đòn gánh.
2.1.3 Về tác dụng sinh học
Sàng lọc hoạt tính chống viêm in vitro của các cao chiết Dây đòn gánh được thực hiện trên mô hình tế bào RAW264.7 bị kích thích viêm bởi LPS Các chỉ tiêu đánh giá hiệu quả chống viêm bao gồm nồng độ PGE2 trong tế bào.
Nghiên cứu này đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của các hợp chất tinh khiết được phân lập từ Dây đòn gánh trên mô hình tế bào RAW264.7 bị kích thích viêm bởi LPS Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm PGE2, NO, IL-1β, IL-6 và COX-2, nhằm xác định hiệu quả chống viêm của các chất này.
Luận án này nhằm mục tiêu phân lập các chất tinh khiết với định hướng chống viêm in vitro, do đó, các nội dung nghiên cứu được thiết kế theo một sơ đồ cụ thể.
Hình 2.1 Sơ đồ thiết kếnghiên cứu
NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Th ẩm đị nh tên khoa h ọ c
Mẫu nghiên cứu cây Dây đòn gánh bao gồm phần trên mặt đất có hoa và quả, được thu hái tại xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 11/2016 và tháng 11/2017 Ba tiêu bản mẫu năm 2016 (NIMM TB-10663A, 10663B và 10663C) cùng một tiêu bản mẫu năm 2017 (DL-181117) hiện được lưu giữ tại Phòng Tiêu bản - Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu.
Nghiên cứu hóa học định tính và chiết xuất phân lập được thực hiện với phần trên mặt đất của cây Dây đòn gánh, thu hái tại xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 11/2016 Sau khi thu hoạch, mẫu cây được thái nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ khoảng 50°C, sau đó được bảo quản trong túi nilon kín để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Cao ethanol 96% và các cao phân đoạn (n-hexan, ethyl acetat, n-butanol và nước) từ phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh đã được điều chế theo phương pháp mô tả trong mục 2.3.2.2, cho thấy tác dụng chống viêm in vitro hiệu quả Các hợp chất tinh khiết được phân lập từ phần trên mặt đất của cây cũng góp phần vào khả năng chống viêm này.
2.2.2 Thuốc thử, hóa chất, dung môi
Nghiên c ứ u v ề th ự c v ậ t : Ethanol, xanh methylen, đỏ carmin, nước cất đạt tiêu chuẩn phân tích
The qualitative analysis involves various reagents and chemicals, including ethanol, distilled water, and 30% lead acetate, as well as 10% lead acetate Additional reagents include 3% ninhydrin, Fehling's solutions A and B, Lugol's reagent, and a 0.5% sodium nitroprusside solution Other essential materials are anhydrous sodium sulfate, sodium carbonate crystals, metallic magnesium powder, acetic anhydride, a 1% gelatin solution, chloroform, concentrated hydrochloric acid, concentrated ammonia, a 5% ferric chloride solution, and a 5% sodium hydroxide solution that meet analytical standards.
Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc:
- Dung môi hóa chất dùng trong chiết xuất phân lập: Ethanol (EtOH), n-hexan (n-Hx), ethyl acetat (EtOAc), n-butanol (BuOH), methanol (MeOH), dichloromethan
(DCM), aceton (Ace) đạt tiêu chuẩn công nghiệp
- Dung môi đo phổ: DMSO-d 6 ,CD3OD, CDCl3
- Silica gel (cỡ hạt 0,04 - 0,063 mm) (Merck, Đức), silica gel pha đảo, sephadex LH-
- Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel GF254 (Merck, Đức), RP 18 F254 (Merck, Đức)
- Dung dịch H 2 SO4 10 % trong EtOH 96 %
- Đường chuẩn ᴅ-glucose, ʟ-rhamnose, ᴅ-xylose được cung cấp bởi công ty Sigma- Aldrich (St Louis, MO, Mỹ)
- Chất gây viêm lipopolysaccharid (LPS, cat: L4391), và MTT (cat: M2128) của hãng Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Mỹ)
- Tế bào RAW264.7 từ trung tâm lưu trữ tế bào ở Mỹ (ATCC, Rockville, MD)
- Kháng thể β-actin của hãng Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, cat: A5316, Mỹ)
- Huyết thanh bò, RPMI, trypsin từ Gibco BRL (Grand Island, NY, Mỹ)
- COX-2 (1:1000, cat: 610204) từ BD Biosciences (Mỹ)
- Khỏng sinh penicillin, streptomycin (100 àg/ml), NaCl, Tris-Hl, NP40 của hóng Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Mỹ)
- Kháng thể chuột thứ cấp thứ cấp liên hợp HRP của hãng Cell Signaling (Mỹ).
- ELISA kit: PGE2 (cat: MBS266212, MyBioSource, Mỹ), IL-1 kit (cat: MBS175967, MyBioSource, Mỹ), IL-6 Elisa kit (RAB0309, Merck, Đức)
- MicroRNeasy kit mini (Qiagen, 217.004) và Quantifast SYBR green RT-PCR (Qiagen, 204.156, Đức).
- BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, Mỹ)
- Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) kit (cat 34095, Pierce West Femto, Thermo Fisher Scientific, Mỹ)
- Thuốc thử chuyển gen Oligofectamine (Life Technologies, Mỹ)
- NO detection kit (21023, LiliF Diagnostic, Seoul, Hàn Quốc)
- Các nguyên vật liệu và hoá chất khác được cung cấp bởi công ty Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Mỹ)
- Kính hiển vi Leica Wetzlar GmbH (Leica, Đức) của Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội
- Kính soi nổi Kruss Optroni (Kruss, Đức)của Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu
- Máy ảnh kỹ thuật số Canon PowerShot S400 (Canon, Nhật Bản) của Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu.
- Máy ảnh Canon 70D 50 mm f1.8 (Canon, Nhật Bản) của Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội
- Kính lúp Triplet 30X-21mm (Trung Quốc) của Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu
- Một số vật dụng khác như kim chỉ, báo, nẹp…
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, được sản xuất bởi Bruker tại Thụy Sỹ, sử dụng tetramethyl silan làm chất nội chuẩn Thiết bị này thuộc Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Máy đo phổ khối lượng (ESI-MS) AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Agilent Technologies, Mỹ, được sử dụng tại Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam Đồng thời, hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp với detector khối phổ hai lần LC-MS/MS và detector DAD từ Shimadzu, Nhật Bản, cũng được áp dụng tại Viện Dược liệu.
Máy đo phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS bao gồm Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL và HPLC Agilent Technologies 1290 Infinity Series/6530 Q-TOF, được sử dụng tại Đại học Khoa học & Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Hóa sinh biển của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Máy đo góc quay cực [α]D: JASCO P-2000 Polarimeter (Tokyo, Nhật Bản) của Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc, thể tích cuvet là 1 ml
- Máy đo điểm chảy: GALLENKAMP (Sanyo, Nhật Bản) của Viện Dược liệu
- Đèn tử ngoại VL-6.LC hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Vilber, Pháp)
- Cân phân tích Precisa (Precisa, Thụy Sỹ) có độ chính xác 0,1 mg của Viện Dược liệu
- Máy cất quay Buchi các loại (Buchi, Đức) của Viện Dược liệu
- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115 (Đức) của Viện Dược liệu
- Cột thủy tinh các loại
- Các dụng cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm
- Máy đo quang microplate reader (Varioskan, Thermo Electron Co., Mỹ) của Khoa
Y, Đại học Lund, Thụy Điển và của Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc
- Máy chụp Western Blot và PCR (LAS 4000, Nhật Bản) của Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển
- StepOnePlus RT-PCR cycler, Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) của Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển.
ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.3.1 Nghiên cứu thực vật học
- Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu
- Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội
- Khoa Hóa Phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu
- Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học
- Phòng Miễn dịch học, Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc
- Khoa học Y khoa Thực nghiệm, Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật học
- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại địa phương và Phòng Tiêu bản
- Quan sát đặc điểm cấu tạo hoa và lá dưới kính lúp và chụp ảnh
- Thu hái mẫu có hoa, quả làm tiêu bản mẫu cây khô
Để xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu, chúng ta cần phân tích đặc điểm hình thái của thực vật và thực hiện so sánh đối chiếu với các khóa phân loại thuộc chi Gouania.
- Áp dụng phương pháp hiển vi để nghiên cứu cấu tạo giải phẫu và đặc điểm bột dược liệu các bộ phận lá, thân [76]
2.4.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học
Khảo sát sơ bộ các nhóm chất chính trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu [77], [78]
2.4 2.2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất
Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn
- Dược liệu được chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi EtOH
- Phân đoạn cao chiết toàn phần bằng dung môi có độ phân cực tăng dần: n-Hx, EtOAc và n-BuOH
Phân lập và tinh chế
Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột (silica gel, C-18, sephadex LH-20, diaion
Theo dõi phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) kết hợp với ánh sáng UV ở bước sóng 254 và 366 nm, hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96% Để kiểm tra độ tinh khiết, có thể áp dụng phương pháp TLC hoặc HPLC.
Cấu trúc của các hợp chất được xác định dựa trên đặc tính lý hóa như màu sắc và nhiệt độ nóng chảy, cùng với dữ liệu phổ từ NMR và MS Ngoài ra, việc so sánh với dữ liệu phổ trong tài liệu tham khảo và kiểm tra trên hệ thống SciFinder cũng là các bước quan trọng trong quá trình xác định cấu trúc của các chất mới.
Để xác định cấu hình của đường, các hợp chất saponin được thủy phân, sau đó sự hiện diện của các đường trong sản phẩm thủy phân được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng Giá trị góc quay cực của các đường sẽ được so sánh với góc quay cực của đường chuẩn Cụ thể, 6 mg hợp chất saponin được hòa tan trong 1 mL dung dịch HCl 1,0 N (H2O/dioxan, 1:1, v/v) và được đun hồi lưu cách thủy ở 80 °C trong 8 giờ Sau khi làm nguội ở nhiệt độ phòng, hỗn hợp được trung hòa bằng Ag2CO3 và lọc để loại bỏ kết tủa.
Sau khi lọc, dung môi được bay hơi dưới khí N2 Hỗn hợp được chiết bằng dichloromethan và nước (0,5 ml CH2Cl2 + 0,5 ml H2O, chiết lặp lại 2 lần) Lớp dichloromethan được loại bỏ, thu được lớp nước Monosaccharid trong sản phẩm thủy phân được xác định bằng phân tích TLC với các đường chuẩn (hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/H2O, 2/1/0,2, v/v/v) Tiếp theo, các monosaccharid được phân tách bằng TLC điều chế Sau khi triển khai sắc ký với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/H2O (2:1:0,2, v/v/v), một phần bản mỏng được tách rời, phun dung dịch thuốc thử 95% EtOH–H2SO4–anisaldehyd (9/0,5/0,5, v/v) và đốt bản mỏng ở 105°C trong 3 phút để phát hiện các vết đường Cuối cùng, các vết đường trên bản mỏng được cạo riêng, lọc và rửa sản phẩm thu được bằng hỗn hợp dung môi MeOH.
Sau khi cất quay để thu hồi dung môi, hòa tan sản phẩm trong H2O (1:1, v/v) và đo góc quay cực So sánh giá trị và chiều hướng của góc quay cực thu được với mẫu đường chuẩn tương ứng được đo trong cùng điều kiện.
Góc quay cực riêng được tính theo công thức:
Để tính giá trị đo được trong phân cực kế, công thức được sử dụng là 𝑙 𝑐 1000, trong đó 𝑙 là chiều dài ống đo (tính bằng dm), 𝑐 là nồng độ của chất thử trong dung dịch (tính bằng g/L), và là góc quay cực đo được.
2.4.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro a) Nuôi cấy tế bào
Tế bào RAW264.7, một loại tế bào đại thực bào chuột, được mua từ ATCC (Rockville, MD, Mỹ) và nuôi cấy trong phiến 96 giếng với mật độ 2x10^4 tế bào/giếng ở 37°C trong điều kiện 5% CO2/95% không khí, sử dụng môi trường RPMI có bổ sung 10% huyết thanh bò FBS, 100 đơn vị/ml penicillin và 100 μg/ml streptomycin Trong quá trình thí nghiệm, các tế bào được nuôi đến mật độ phát triển 80 - 90% Để đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử đến khả năng sống sót của tế bào RAW264.7, phương pháp MTT được áp dụng.
Nguyên tắc đánh giá độ ảnh hưởng của các mẫu nghiên cứu đến khả năng sống sót của tế bào dựa trên mức độ hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể Việc phân tích enzym này trong tế bào sống cung cấp thông tin quan trọng về sức khỏe và sự sống còn của tế bào, từ đó giúp hiểu rõ hơn về các yếu tố tác động đến sự sống sót của chúng.
Enzym này chuyển đổi tetrazolium màu vàng nhạt thành formazan màu tím, được phát hiện qua đo quang ở bước sóng 570 nm.
Các mẫu thử, bao gồm cao chiết và chất tinh khiết, được pha trộn bằng DMSO và lắc vortex với tốc độ từ 300 đến 500 vòng/phút trong khoảng thời gian 1 đến 2 phút cho đến khi đạt được sự đồng nhất Sau đó, các mẫu này sẽ được pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng DMSO.
Sử dụng 1 μL dung dịch mẫu thử cho mỗi giếng 100 μL để đạt nồng độ cuối cùng của chất thử là 1, 5 và 25 μg/mL cho cao chiết, và 30 μM cho chất tinh khiết.
Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng với mật độ 10^4 tế bào/giếng và 10% FBS trong 12 tiếng ở nhiệt độ 37°C và 5% CO2 Sau đó, môi trường nuôi cấy được thay bằng RPMI không chứa FBS để tiếp tục ủ các mẫu thử với tế bào.
Sau 24 giờ, môi trường tế bào được thay bằng dung dịch MTT (0,5 mg/mL pha trong nước muối đệm phosphat) và ủ trong 2-4 giờ ở 37 độ C với 5% CO2 Sau khi hút bỏ môi trường, kết tủa formazan được hòa tan trong DMSO và mật độ quang được đo.
570 nm bằng máy ELISA Mỗi mẫu thử được lặp 5 lần
Khả năng sống sót của tế bào được tính toán theo công thức:
CS% = [OD (mẫu thử) – OD (ngày 0)
OD (DMSO) – OD (ngày 0) × 100] (%) Trong đó: OD: mật độ quang
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần c) Đo nồng độ sản phẩm PGE 2, IL-6 và IL-1β bằng phương pháp ELISA [83], [84]
Phương pháp miễn dịch gắn kết enzym (ELISA) được sử dụng để định lượng các chất trung gian gây viêm như PGE2, IL-6 và IL-1β Nguyên tắc của ELISA cạnh tranh dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên trong mẫu thử và kháng nguyên được đánh dấu, nơi chúng cạnh tranh để liên kết với một lượng kháng thể giới hạn đã được chuẩn bị trước.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC
3.1.1 Kết quảgiám định tên khoa học của mẫu Dây đòn gánh nghiên cứu
Căn cứ vào các khóa phân loại chi Gouania (họ Rhamnaceae) của J Pitard trong
Trong bài viết “Flore Générale de L’indochine”, T.1 của Yi Chen & Carsten Schirarend (2007), thuộc “Flora of China”, vol.12, chúng tôi đã xác định đối tượng nghiên cứu là mẫu tiêu bản số NIMM TB-10663A, 10663B, 10663C và DL-181117, có tên khoa học chính xác là Gouania leptostachya DC var tonkinensis, thuộc họ Táo ta (Rhamnaceae) Nghiên cứu dựa trên các đặc điểm hình thái của thân, lá, cụm hoa, cấu tạo của cụm hoa, và kích thước của quả trong các mẫu thu thập, cùng với sự tư vấn của các chuyên gia thực vật từ Khoa Tài nguyên Dược liệu và Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội.
3.1.2 Đặc điểm thực vật của mẫu Dây đòn gánh nghiên cứu
Dây leo quấn có thân mảnh với lông tơ, lá kèm hình thận bao quanh thân và mép lá có khía răng cưa nhọn Lá mọc so le, cuống dài từ 1,2-2 cm và có lông Tua cuốn xuất hiện ở nách lá đầu cành Phiến lá hình trứng hoặc trứng thuôn, màu xanh với mặt dưới nhạt hơn, kích thước 6-12 x 2,5-6 cm, chất lá mỏng mềm Mặt dưới lá có thể nhẵn hoặc có lông ở gân, với 5-6 cặp gân phụ lồi rõ Gốc lá hình tim, mép lá hơi khía và mũi lá nhọn.
Cụm hoa dạng xim xuất hiện ở đỉnh cành hoặc nách lá, dài từ 15 đến 30 cm và có nhiều lông Hoa nhỏ, tạp tính với màu trắng lục, lá bắc hình giùi, kích thước 1,2 x 1,5-2 mm, mỗi lá bắc bao quanh 5-10 hoa Cuống hoa ngắn khoảng 1 mm, đài hoa hợp sinh với bầu, có 5 lá đài hình trứng-tam giác với mặt ngoài nhiều lông và mũi nhọn Cánh hoa có 5 chiếc, hình thìa, màu trắng hơi xanh, ôm trọn nhị, nhị gắn vào gốc cánh hoa và vươn ra ngoài khi chín Đĩa hoa có 5 cạnh, bầu dưới với 3 ô và 1 noãn mỗi ô, vòi nhụy ngắn và chia 3 thùy.
Quả nang, có ba cánh, dài 9-10 mm, đường kính 10-12 mm, trên đỉnh còn vết tích của đài tồn tại Cuống quả 1-3 mm Hạt màu nâu bóng
Hình ảnh các bộ phận của Dây đòn gánh được thể hiện tại hình 3.1 và 3.2
Hình 3.1 Các bộ phận của Dây đòn gánh
5 – Lá kèm bao quanh thân
6 – Cụm hoa trên lá bắc
Hình 3.2 Cành mang hoa (A) và cành mang quả (B) Dây đòn gánh 3.1.3 Đặc điểm vi phẫu dược liệu Dây đòn gánh
3.1.3 1 Đặc điể m vi ph ẫ u thân
Hình 3.3 Vi phẫu thân Dây đòn gánh
1 Biểu bì; 2 Mô dày góc; 3 Mô dày phiến; 4 Mô mềm vỏ;
5 Libe cấp 1; 6, Sợi libe; 7 Libe cấp 2; 8 Tầng phát sinh libe gỗ; 9 Sợi gỗ;
10 Tia ruột; 11 Gỗ cấp 2; 12 Gỗ cấp 1; 13 Mô mềm ruột; 14 Lông che chở;
15 Tinh thể calci oxalat ngoài vỏ; 16 Tinh thể calci oxalat trong ruột
Vi phẫu thân có tiết diện đa giác 6 cạnh, bao gồm nhiều lớp cấu trúc Bên ngoài là biểu bì mỏng, phủ lớp cutin và có lông che chở Dưới biểu bì là mô dày, gồm mô dày góc với các tế bào tròn, dày, màu đỏ đậm, và mô dày phiến có hình chữ nhật, xếp so le Trong mô dày góc có tinh thể calci oxalat đa dạng kích thước Mô mềm vỏ rất mỏng, với vỏ tế bào bắt màu đỏ, nằm trên libe cấp 1, gồm các tế bào bị ép dẹp Libe cấp 2 có các dãy tế bào nhỏ, liên tục bao quanh gỗ cấp 2, cũng chứa tinh thể calci oxalat Bề dày lớp vỏ chỉ khoảng 1/6-1/8 so với bề dày vi phẫu, và tầng phát sinh libe gỗ là hàng tế bào liên tục không bắt màu thuốc nhuộm.
Gỗ cấp 2 (11) được sắp xếp thành vòng không liên tục, thường bị chia cắt bởi các tia ruột (10) từ 1-2 hàng tế bào Bề dày lớp gỗ cấp 2 gấp 6-8 lần libe cấp 2 và chiếm gần 4/5 bề dày vi phẫu Sợi gỗ (9) nằm bên ngoài gỗ cấp 2, gần với tầng phát sinh libe gỗ, xuất hiện thành từng đám từ 5-8 hàng tế bào và cũng bị chia cắt bởi các tia ruột Màu sắc của sợi gỗ nhạt hơn và sáng hơn khi giảm tụ quang so với các tế bào gỗ xung quanh Tia ruột (10) là các tế bào hình chữ nhật xếp thành các dãy xuyên tâm xen giữa mô gỗ cấp 2.
Gỗ cấp 1 có cấu trúc rõ ràng với các tế bào nhỏ nối tiếp các bó gỗ cấp 2, có xu hướng li tâm, hình thành hình tam giác với đỉnh hướng về tâm vi phẫu và đáy mở rộng ra ngoài Mô mềm ruột bao gồm các tế bào đa giác kích thước không đồng đều, chiếm khoảng 1/5-1/6 độ dày vi phẫu.
Hướng hóa gỗ với màu xanh thuốc nhuộm cho thấy sự hiện diện của các tinh thể calci oxalat dạng khối, hình đa giác, nằm rải rác bên trong tế bào mô mềm ruột.
3.1.3 2 Đặc điể m vi ph ẫ u lá
Phần gân lá ( Hình 3.4A) : Gân lá có tiết diện gần tròn, đa số là phần gân dưới
Biểu bì dưới có lớp tế bào thành mỏng, kích thước nhỏ, xếp sát nhau và được phủ bởi lớp cutin mỏng, trong khi biểu bì trên tương đối giống biểu bì dưới Cả hai loại biểu bì đều có nhiều lông che chở đa bào, không phân nhánh, với gốc đơn bào có khả năng hóa cứng Mô dày góc dưới gồm 3-5 hàng tế bào dày sát biểu bì dưới, trong khi mô dày góc trên có 3-4 hàng tế bào sát biểu bì trên gân lá, với màu sắc đỏ đậm hơn Mô mềm dưới chiếm 1/3 bề dày gân lá với các tế bào lớn, trong khi mô mềm trên chỉ gồm 2-3 hàng tế bào nhỏ hơn Trong mô mềm có tinh thể calci oxalat hình cầu gai Bó libe-gỗ hình cung, chiếm khoảng 1/3 bề dày gân lá, nằm ở phần nửa trên, với mô gỗ màu xanh đậm chiếm >80% bó libe-gỗ, trong khi libe dưới và trên chỉ là các đám nhỏ sát mô gỗ, có màu đỏ rõ ràng Nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai và đa giác xuất hiện trong phần libe.
Phiến lá có bề dày khoảng 1/5-1/6 so với bề dày của phần gân lá, với biểu bì dưới là lớp tế bào mỏng, không đều và xếp sát nhau, có thể thấy lỗ khí xuất hiện Phần mô khuyết nằm sát biểu bì dưới, gồm các tế bào mỏng xếp lỏng lẻo, tạo ra nhiều khoảng không chứa khí và chiếm khoảng 1/2 bề dày của phiến lá.
Mô dậu nằm ngay dưới biểu bì trên, là một hàng tế bào dài hình chữ nhật chứa nhiều lục lạp, có bề dày tương đương với lớp biểu bì trên và thành tế bào rất mỏng, khó bắt màu thuốc nhuộm Biểu bì trên là một hàng tế bào xếp sát nhau, có kích thước lớn hơn hẳn biểu bì dưới của phiến lá và các tế bào biểu bì của phần gân lá Bề mặt ngoài của biểu bì trên được phủ một lớp sáp mỏng, trong khi hạ bì và lông che chở trên bề mặt phiến lá rất hiếm khi được quan sát thấy.
56 quan sát thấy các tinh thể calci oxalat hình kim (c), thường nằm chéo hoặc vuông góc với mặt phẳng phiến lá
Hình 3.4 Vi phẫu lá Dây đòn gánh
Ghi chú về vi phẫu lá Dây đòn gánh bao gồm các đặc điểm của phần gân lá và phiến lá Các yếu tố chính như biểu bì dưới, mô dày dưới, và sự hiện diện của tinh thể calci oxalat hình cầu gai là những điểm quan trọng cần lưu ý.
Mô mềm (dưới); 5 Libe (dưới); 6 Gỗ; 7 Libe (trên); 8 Mô mềm (trên); 9 Mô dày trên; 10 Biểu bì trên; 11 Lông che chở B Phiến lá: a Biểu bì dưới; b Mô khuyết; c
Tinh thể calci oxalat hình kim; d Mô giậu; e Biểu bì trên; f Lỗ khí.
3.1.4 Đặc điểm bột Dây đòn gánh Đặc điểm bột thân Dây đòn gánh : Bột dược liệu có màu vàng nâu, khi quan sát dưới kính hiển vi thấy: Mảnh mạch mạng (1); Tinh thể caci oxalat hình khối (2) đường cứng (4) và sợi mô cứng (6) có vách dày Lông che chở (7) đơn bào, dài tầm 400-500 àm (Hỡnh 3.5) Đặc điểm bột lá Dây đòn gánh : Bột dược liệu có màu vàng nâu, khi quan sát dưới kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì gồm những tế bào vách ngoằn nghèo có lỗ khí kớch thước 15 – 20 àm Mảnh mạch xoắn (2) cú đường kớnh khoảng 25 àm Mảnh mụ dày (3) gồm cỏc tế bào cỏch vỏch dày Lụng che chở đa bào (4a, 4b) đường kớnh 10àm
57 gồm nhiều tế bào dài nối tiếp nhau Tinh thể calci oxalat hình cầu gai (5) đường kính
15 àm và tinh thể calci oxalat hớnh khối (7) dài đường kớnh 10-12 àm Quan sỏt thấy hạt tinh bột (6) cú rốn rừ, đường kớnh 25-30 àm (Hỡnh 3.6).
Hình 3.5 Đặc điểm bột thân Dây đòn gánh
Chú thích: 1 Mảnh mạch mạng; 2 Tinh thể calci oxalat hình khối; 3 Tinh thể Calci oxalat hình cầu gai; 4, 6 Sợi mô cứng; 5 Mảnh mô mềm; 7 Lông che chở
Hình 3.6 Đặc điểm bột lá Dây đòn gánh
Chú thích: 1 Mảnh biểu bì mang lỗ khí; 2 Mảnh mạch xoắn; 3 Mảnh mô dày; 4a,4b Lông che chởđa bào; 5, 7 Tinh thể Calci oxalat; 6 Hạt tinh bột
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT THEO ĐỊNH HƯỚNG CHỐNG VIÊM IN VITRO
HỢP CHẤT THEO ĐỊNH HƯỚNG CHỐNG VIÊM IN VITRO
3.2.1 Kết quảđịnh tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học Định tính các nhóm chất hữu cơ trong phần trên mặt đất Dây đòn gánh bằng các phản ứng hóa học với các thuốc thử đặc hiệu Kết quả cho thấy Dây đòn gánh có chứa các nhóm chất flavonoid, saponin, caroten, sterol và đường khử (bảng 3.1).
Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất có trong cây Dây đòn gánh
TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luậnsơ bộ
P/ư thuốc thử Bourchardart - P/ư thuốc thử Dragendorff -
5 Coumarin P/ư mở vòng lacton - Không có
Không có P/ư thuốc thử Baljet -
8 Đường khử P/ư thuốc thử Felling ++ Có
9 Acid hữu cơ P/ư với Na 2 CO3 - Không có
10 Acid béo Bay hơi trên giấy lọc - Không có
11 Caroten P/ư với H 2 SO4 đặc ++ Có
13 Polysacharid P/ư với thuốc thử Lugol 1% - Không có
(-): Phản ứng âm tính (++): Phản ứng dương tính rõ
(+): Phản ứng dương tính (+++): Phản ứng dương tính rất rõ
3.2.2 Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn của cao toàn phần
Phần trên mặt đất của cây Dây đòn gánh (1,5 kg, độ ẩm 10,0 %) được cắt nhỏ và chiết xuất bằng ethanol 96% thông qua phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng, thực hiện ba lần trong bốn ngày mỗi lần Sau khi gộp dịch chiết, dung môi được cất dưới áp suất giảm ở 70 o C, thu được 148 g cao đặc (GLT) Tiếp theo, 140 g cao đặc được phân tán trong 1 lít nước cất để tạo thành hỗn dịch, sau đó chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, EtOAc và n-.
Sử dụng BuOH, các dịch chiết được gộp lại và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, từ đó thu được các cao chiết tương ứng: cao n-hexan (GLH) với khối lượng 17 g, cao EtOAc (GLE) với khối lượng 38 g, và cao BuOH (GLB).
3.2.3 Kết quả sàng lọc tác dụng chống viêm in vitro của cao chiết toàn phần và cao phân đoạn Dây đòn gánh
Sàng lọc tác dụng chống viêm in vitro của cao chiết là bước nghiên cứu tiền đề quan trọng, tạo nền tảng cho việc phân lập các hợp chất tiềm năng chống viêm từ cây Dây đòn gánh Nghiên cứu đã sử dụng cao chiết ethanol 96% (GLT) cùng với bốn cao chiết phân đoạn (n-hexan - GLH, ethyl acetat - GLE, n-butanol - GLB và nước - GLW) để đánh giá khả năng ảnh hưởng đến sự sản sinh các chất trung gian gây viêm như PGE 2.
NO và các cytokin (IL-1β, IL-6) trên mô hình đại thực bào RAW264.7 bị gây kích thích viêm bằng LPS, sử dụng phương pháp xét nghiệm ELISA.
3.2.3.1 Ảnh hưở ng c ủ a cao chi ết Dây đòn gánh đế n kh ả năng số ng sót c ủ a t ế bào RAW264.7 Để lựa chọn được mức nồng độ thử nghiệm phù hợp trong nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro, trước tiên cao GLT và các cao phân đoạn của cao tổng phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh (GLH, GLE, GLB, GLW) được đánh giá mức độ gây độc tế bào in vitro trên dòng RAW264.7 theo phương pháp MTT với các nồng độ thử nghiệm là 1, 5, 25 àg/mL Kết quả thể hiện ở hỡnh 3.7
Kết quả từ hình 3.7 chỉ ra rằng, khi nồng độ nhỏ hơn hoặc bằng 25 àg/mL, cả cao chiết toàn phần và các cao chiết phân đoạn từ phần trên mặt đất của Dây đòn gánh hầu như không tác động đến tỷ lệ sống sót của các tế bào, với tỷ lệ sống sót đạt trên 90%.
Nồng độ chiết xuất an toàn để thực hiện các thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm in vitro trên tế bào RAW264.7 là nhỏ hơn hoặc bằng 25 àg/mL.
Hình 3.7 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn của Dây đòn gánh đến khảnăng sống sót của tế bào RAW264.7
GLT: cao toàn phần, GLE: Cao phân đoạn EtOAc, GLB: Cao phân đoạn butanol, GLH: Cao phân đoạn n-hexan, GLW: Cao phân đoạn nước, Dexa: Dexamethason,
*p