Nghiên cứu tính đa dạng sinh học, thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây hàm ếch ( saururus chinensis lour bail, họ lá giấp saururaceae)

Lời cảm ơn Trong trình học tập thực khóa luận, em nhận hướng dẫn, bảo giúp đỡ tận tình thầy cô giáo, kỹ thuật viên, bạn đồng môn gia đình em Hồn thành khóa luận này, trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Văn Ơn bảo tận tình trực tiếp hướng dẫn em suốt thời gian qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới thầy cô giáo kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt DS Phạm Hà Thanh Tùng DS Nghiêm Đức Trọng giúp đỡ, hướng dẫn, chia sẻ kinh nghiệm tạo điều kiện cho em suốt trình em thực khóa luận Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn tới BS Lê Thị Hồng Hạnh - Trung tâm Sinh y dược học – Học viện quân y, DS Nguyễn Thị Thu Huế Phòng Dược lý – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, TS Thu – Bộ môn Vi sinh – Trường ĐH Dược Hà Nội hướng dẫn bảo tận tình cho em cho em suốt trình em làm thực nghiệm sở Em xin cảm ơn bạn đồng môn giúp đỡ trao đổi với em để em thực hồn thành khóa luận dễ dàng Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám đốc cơng ty Dược Hoa Linh, gia đình em, đặc biệt chồng trai bên cạnh động viên, tạo điều kiện để em hồn thành tốt khóa học Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2010 Học viên Lưu Thị Gấm MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ LO I H M ẾCH 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Công dụng 1.1.3 Thành phần hoá học 1.1.4 Tác dụng sinh học TỔNG QUAN VỀ B NH VI M DA D NG 1.2.1.Khái niệm bệnh viêm da dị ứng 1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh 1.2.3 Biểu 1.2.4 Phƣơng pháp điều trị 1.3 ĐẠI CƢƠNG VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA V O CHỈ TH PHÂN TỬ Trang 3 12 12 12 12 13 15 1.3.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR 1.3.2 Kỹ thuật RAPD (Random amplified Polimorphism ADN) nghiên cứu đa dạng sinh học 1.4 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ 1.4.1 Sắc ký khí 1.4.2 Một số đặc trƣng detector sắc kí khí 1.4.3 Detector chọn lọc khối phổ 1.4.4 Phƣơng pháp phân tích định tính Chƣơng ĐỐI TƢỢNG V PHƢƠNG PHÁP NGHI N C U NGU N V T LI U THIẾT B 2.1.1 Nguyên vật liệu 2.1.2 Thiết bị h a ch t 2.1.3 Động vật thí nghiệm PHƢƠNG PHÁP NGHI N C U 2.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu tính đa dạng sinh học 2.2.1.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 2.2.1.2 Nghiên cứu dựa thị phân tử kỹ thuật RAPD – PCR 2.2.2 Phƣơng pháp định tính thành phần hố học định lƣợng cắn tồn phần định lƣợng phân tích tinh dầu Hàm ếch 2.2.2.1 Định tính sơ nh m ch t h u c mặt dƣợc liệu phản ứng hoá học đặc trƣng 2.2.2.2 Định lƣợng cắn tồn phần 2.2.2.3 Định lƣợng tinh dầu 2.2.2.4 Phân tích thành phần tinh dầu 2.2.3 Phƣơng pháp thử tác dụng sinh học 2.4.3.1 Thử tác dụng kháng khuẩn kháng n m 2.4.3.2 Thử độ kích ứng da 2.4.3.3 Thử tác dụng chống viêm đƣ ng ngồi da mơ h nh gây phù bàn chân chuột carrageenin CHƢƠNG KẾT QUẢ THỰC NGHI M 3.1 KẾT QUẢ THỰC NGHI M 3.1.1 Kết nghiên cứu đa dạng sinh học 3.1.1.1 Đặc điểm h nh thái thực vật loài Hàm ếch thu hái địa điểm khác 3.1.1.2 Đặc điểm giải phẫu quan sinh dƣỡng HEHS 3.1.1.3 Kết phân tích AND 3.1.2 Kết nghiên cứu thành phần h a học hàm lƣợng cắn toàn phần phần mặt đ t mẫu HEHS 3.1.2.1 Kết định tính sơ thành phần hoá học phần mặt đ t mẫu HEHS 15 17 19 19 20 20 21 23 23 23 24 25 25 25 25 26 28 28 29 29 30 30 30 34 35 38 38 38 38 41 48 50 51 3.1.2.2 Kết qủa định lƣợng cắn toàn phần phần mặt đ t mẫu HEHS 3.1.2.3 Kết qủa định lƣợng tinh dầu phân tích tinh dầu phần mặt đ t mẫu HEHS 3.1.3 Kết thử tác dụng sinh học phần mặt đ t 52 53 56 mẫu HEHS 3.1.3.1 Kết thử tác dụng kháng khuẩn, kháng n m 56 3.1.3.2 Kết thử độ kích ứng da 59 3.1.3.3 Kết thử tác dụng chống viêm đƣ ng da 60 64 CHƢƠNG B N LU N 4.1 VỀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 64 4.1.1 Phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng sinh học 64 4.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu h a học 64 4.1.4 Phƣơng pháp thử tác dụng sinh học 65 4.2 VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 66 4.2.1 Về nghiên cứu đa dạng sinh học 66 4.2.2 Về nghiên cứu thành phần h a học 67 4.2.3 Về nghiên cứu tác dụng sinh học 69 71 KẾT LU N V ĐỀ XUẤT 71 KẾT LU N 72 ĐỀ XUẤT T I LI U THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 3.1: Bảng phân tích tinh dầu Hàm ếch hình ảnh phổ chất đƣợc phân tích từ tinh dần Hàm ếch DANH MỤC CÁC KÝ HI U CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Ý nghĩa AND Acid deoxyribonucleic ALT Alanin amino transferase AST Aspartat amino transferase BT-20 Dòng tế bào ung thƣ vú Cao HE2 Cao l ng 3:1 phần mặt đ t Hàm ếch thu hái Hƣơng Sơn chiết cồn 70% COX Cyclooxygenase dATP 2’-deoxyadenosin triphosphat dCTP 2’-deoxycytidin-5’-triphosphat dGTP 2’-deoxyguanosin triphosphat (dP/dt)max Tỷ lệ tối đa thay đổi áp su t tâm th t trái dTTP 2’-deoxythymin triphosphat DU – 145 Dòng tế bào ung thƣ biểu mơ tuyến tiền liệt ngƣ i ERK Kinase liên quan tới tín hiệu ngoại bào GATA – Yếu tố vận chuyển acid aminobutyric gama GPT Glutamic pyruvic transaminase GS/MS Gas chromatography and mass spectrometry HA Hyaluronic acid hACAT Acyl CoA cholesterol acyltransferase ngƣ i HEHS Mẫu Hàm ếch thu hái Hƣơng Sơn- Mỹ Đức- Hà Nội HepG2 Dòng tế bào ung thƣ gan HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ngƣ i HL – 60 Dòng tế bào ung thƣ bạch cầu ngƣ i IC100, IC50 Nồng độ ức chế tăng trƣởng 100% (50%) tế bào ung thƣ IL Interleukin iNOS Men tổng hợp NO cảm ứng LDL Lipoprotein tỉ trọng th p LPS Lipopolysaccarid m – ARN Acid ribonucleic thông tin MAPK Kinase hoạt h a mitogen MDA Malonyl dialdehyd MSH Hormon kích thích tế bào biểu b tạo sắc tố NC/Nga Phía bắc Carolina NF - kappaB Yếu tố nhân kappaB NSAIDs Thuốc chống viêm giảm đau không steroid NXB Nhà xu t PC3 Dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PCR Polymerase Chain Reaction RANKL Yếu tố hoạt h a receptor phối tử yếu tố nhân kappa B RAPD Random Amplified Polymorphic AND RAW 264.7 SK – Hep – SK-BR-3 SK-MEL-28 SOD SREBP T-47D T98G Th1, Th2 TLCT CCT TLTK TNF UV Dòng tế bào đại thực bào đơn nhân bệnh bạch cầu chuột Dòng tế bào ung thƣ gan Dòng tế bào ung thƣ vú Dòng tế bào ung thƣ da Superoxid dismutase Protein gắn yếu tố điều chỉnh sterol Dòng tế bào ung thƣ vú Dòng tế bào ung thƣ u nguyên bào đệm Tế bào T sản xu t cytokine Trọng lƣợng thể chuột cống trắng Tài liệu tham khảo Yếu tố hoại tử khối u Ánh sáng tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 2.1 Tên bảng So sánh đặc điểm h nh thái thực vật Hàm ếch đƣợc mô tả tài liệu Các nghiên cứu giới tác dụng sinh học Hàm ếch (Saururus chinensis (Lour.) Baill) Địa điểm, th i gian thu hái mã số tiêu mẫu Trang 23 Hàm ếch Bảng 2.2 Bảng 2.3 Bảng 2.4 Các thành phần điều kiện phản ứng PCR Các phản ứng hố học dùng để định tính nh m ch t Đánh giá phản ứng da mức độ gây ban đ phù 26 28 35 nề Bảng 2.5 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Đánh giá khả gây kích ứng da th T m lƣợc đặc điểm h nh thái loài Hàm ếch thu hái địa điểm khác Ma trận vết ảnh điện di mẫu hàm ếch mồi khác Hệ số di truyền mẫu thu hái địa điểm khác Kết định tính nh m ch t phần mặt đ t Hàm ếch Kết định lƣợng cắn toàn phần phân đoạn chiết xu t Hàm ếch Kết định lƣợng tinh dầu dƣợc liệu Kết thực nghiệm thử tác dụng kháng khuẩn kháng n m mẫu Hàm Ếch Kết thử kích ứng da cao hàm ếch 3:1 chiết xu t cồn 96% Kết thử kích ứng da cao Hàm ếch 3:1 chiết xu t 35 39 48 49 50 51 52 56 58 58 cồn 70% Bảng 3.10 Bảng 3.11 Kết thử kích ứng da cao hàm ếch 3:1 chiết xu t nƣớc Tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột sau gây viêm thử nghiệm tác dụng kháng viêm đƣ ng da cao l ng HE2 tỷ lệ 3:1 cồn 70% 59 60 DANH MỤC CÁC HÌNH V Số hình Hình 1.1 H nh 3.2 Tên hình Cơng thức c u tạo số lignan phân lập đƣợc từ Hàm ếch Công thức c u tạo số flavonoid phân lập đƣợc từ Hàm ếch Công thức c u tạo alcaloid phân lập đƣợc từ Hàm ếch H nh thái thực vật mẫu hàm ếch thu hái Hƣơng Sơn – Mỹ Đức Vi phẫu rễ HEHS H nh 3.3 Vi phẫu thân rễ HEHS 42 H nh 3.4 Vi phẫu thân HEHS 43 H nh 3.5 Vi phẫu cuống HEHS 44 H nh 3.6 Vi phẫu HEHS 45 H nh 3.7 Đặc điểm giải phẫu bột HEHS 46 H nh 3.8 Đặc điểm giải phẫu bột thân HEHS 46 Hình 3.9 Hình ảnh vết AND mẫu Hàm ếch mồi 48 Hình 1.2 Hình 1.3 H nh 3.1 Trang 7 40 42 khác Hình 3.10 Sơ đồ phả hệ mẫu hàm ếch 49 Hình 3.11 Phổ phân tích cơng thức c u tạo Myristicin 54 Hình 3.12 H nh ảnh phổ công thức c u tạo safrole 55 Hình 3.13 H nh ảnh vòng vơ khuẩn mẫu thử kháng sinh 57 VSV Hình 3.14 H nh biểu mức độ ức chế phù viêm bàn chân chuột lô th i điểm đo thí nghiệm thử tác dụng kháng viêm đƣ ng ngòai da HE2 61 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm da dị ứng bệnh da phổ biến giới Việt Nam bệnh chiếm tỷ lệ khoảng 20-25% so với bệnh da khác Hiện bệnh c xu hƣớng gia tăng yếu tố từ tác động lên thể ngày nhiều nhƣ: h a ch t ô nhiễm yếu tố thuận lợi thuộc địa nhƣ rối loạn chức nội tạng nội tiết… Bệnh hay tái phát thƣ ng kèm với bội nhiễm Tuy khơng ảnh hƣởng trực tiếp tới tính mạng nhƣng gây kh chịu r t lớn cho bệnh nhân sinh hoạt hàng ngày đồng th i c thể gây nhiều biến chứng không đƣợc điều trị kịp th i Nguyên nhân gây bệnh thƣ ng phức tạp nhiều không rõ V phác đồ điều trị bệnh Viêm da dị ứng giảm triệu chứng Thuốc c thành phần Corticoid đƣợc sử dụng nhƣ thuốc đầu tay điều trị thuốc đáp ứng mạnh nh ng yêu cầu điều trị nhƣ chống viêm giảm ngứa giảm dị ứng… [1], [8], [13], [23] Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc gây nhiều tác dụng phụ: kh liền sẹo c thể h p thu qua da gây loãng xƣơng loét dày – tá tràng [23] Hƣớng tới an toàn điều trị bệnh viêm da dị ứng xu hƣớng giới t m kiếm loại thuốc từ c để thay dần thuốc c nguồn gốc từ Corticoid tổng hợp Cây Hàm Ếch hay gọi Tam Bạch Bảo (Saururus chinensis Baill họ Lá gi p Saururaceae) phân bố tập chung tỉnh vùng núi th p trung du đồng phía Bắc thuốc đƣợc sử dụng lâu đ i phổ biến cộng đồng nhiều nƣớc phƣơng Đông nhƣ: Trung Quốc 84], Việt Nam [7], [21], v.v… để ch a nhiều chứng bệnh khác bật bệnh da nhƣ: nhọt viêm mủ da eczema lở loét 21], v.v… Trên giới c nhiều nghiên cứu thành phần hoá học tác dụng dƣợc lý Hàm ếch, đ phân lập đƣợc nhiều hoạt ch t sinh học chứng minh Hàm ếch c ng nhƣ hoạt ch t phân lập đƣợc c tác dụng sinh học nhƣ: chống viêm [47], [51], bảo vệ gan 47 72 chống hen 56 v.v… Nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng chống viêm c ng nhƣ chế chống viêm Hàm ếch hoạt ch t phân lập đƣợc từ Hàm ếch Ở Việt Nam c nghiên cứu sơ đặc điểm thực vật thành phần h a học tác dụng chống viêm Hàm ếch Tuy nhiên nh ng nghiên cứu sâu tính đa dạng sinh học dƣới loài thành phần h a học c ng nhƣ tác dụng dƣợc lý cần thiết cho loài thực vật c tiềm làm thuốc ch a bệnh viêm da dị ứng th chƣa c Để g p phần nâng cao giá trị sử dụng dƣợc liệu c ng nhƣ c nh ng đ ng g p nh tr nh nghiên cứu thuốc điều trị bệnh Viêm da dị ứng tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng sinh học thành phần hóa học số tác dụng sinh học loài Hàm ếch” với mục tiêu sau: - Xác định tính đa dạng sinh học lồi Hàm ếch - Nghiên cứu thành phần hóa học Hàm ếch - Nghiên cứu độ kích ứng da, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn Hàm ếch 10 Vòng vơ khuẩn vi khuẩn Sta Vòng vơ khuẩn vi khuẩn Shi Vòng vơ khuẩn vi khuẩn Pro Vòng vơ khuẩn vi khuẩn Sal Hình 3.13 Hình ảnh vòng vơ khuẩn mẫu thử, kháng sinh VSV Qua bảng 3.7 hình 3.13, rút số nhận xét sau:  Mẫu cao l ng dƣợc liệu 3:1 chiết cồn 96% (mẫu 1) có tác dụng với vi khuẩn thử  Mẫu cao l ng dƣợc liệu 3:1 chiết cồn 70% (mẫu 2) có tác dụng với vi khuẩn thử  Mẫu cao l ng dƣợc liệu 3:1 chiết nƣớc (mẫu 3) có tác dụng với vi khuẩn thử  Với chủng vi khuẩn Bs, Bp, SL, kháng sinh thử khơng có tác dụng đ mẫu cao l ng 3:1 chiết cồn 70% lại có tác dụng  Cả mẫu khơng có tác dụng với Candida albican  So sánh vòng vơ khuẩn mẫu thử với ta th y: Đƣ ng kính vòng vơ khuẩn mẫu lớn hẳn so với mẫu mẫu Chứng t khả kháng khuẩn mẫu tốt nh t 65 Như vậy: Cao l ng 3:1 chiết cồn 70% cho kết kháng khuẩn tốt, có tác dụng với vi khuẩn thử 3.1.3.2 Kết thử độ kích ứng da Kết thử độ kích ứng da th đƣợc trình bày bảng 3.8, 3.9, 3.10 dƣới Bảng 3.8 Kết thử kích ứng da cao hàm ếch 3:1 chiết xuất cồn 96% Thỏ số 24 48 72 Tổng điểm 24 -72 Điểm đ p ứng/thỏ (Tổng điểm/3) B P B P B P 0 1 2 3 2 0 1 2 3 0 1 2 1,7 Tổng điểm kích ứng thỏ 5,7 Điểm kích ứng trung bình mẫu thử 1,9 Từ bảng kết trên, ta th y cao hàm ếch 3:1 chiết cồn 96% kích ứng nhẹ Bảng 3.9 Kết thử kích ứng da cao hàm ếch 3:1 chiết xuất cồn 70% Thỏ số 24 48 72 Tổng điểm 24 -72 Điểm đ p ứng/thỏ (Tổng điểm/3) B P B P B P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tổng điểm kích ứng thỏ 66 Điểm kích ứng trung bình mẫu thử Từ bảng kết trên, ta th y cao hàm ếch 3:1 chiết cồn 70% không kích ứng Bảng 3.10 Kết thử kích ứng da cao hàm ếch 3:1 chiết xuất nước Thỏ số 24 48 72 Tổng điểm 24 -72 Điểm đ p ứng/thỏ (Tổng điểm/3) B P B P B P 0 2 2,3 1 2 3 2 2,7 Tổng điểm kích ứng thỏ 8,0 Điểm kích ứng trung bình mẫu thử 2,7 Từ bảng kết trên, ta th y cao hàm ếch 3:1 chiết nƣớc c độ kích ứng vừa phải 3.1.3.3 Kết thử tác dụng chống viêm đường da Kết nghiên cứu tác dụng chống viêm cao hàm ếch 3:1 chiết cồn 70% theo đƣ ng qua da đƣợc tr nh bày bảng 3.11 hình 3.14 67 Bảng 3.11 T lệ tăng thể tích bàn chân chuột sau gây viêm thử nghiệm tác dụng kháng viêm đường da cao lỏng HE2 t lệ 3:1 cồn 70% Chứng (a) V1 43,92±10,77 Profenid gel (b) HE2 HE2 30 µl (c) 60 µl (d) 16,20±4,34 35,35±5,27 34,32±5,13 p pb-a,c-a,d-a