Nghiên cứu chiết xuất và tác dụng dược lý của bài thuốc chữa viêm da đa khớp dạng thấp

Đểcó thể sử dụng bài thuốc hiệu quả, an toàn và tiện lợi hơn, được phép của BộY tế, Vụ KH-ĐT BộY tế, Viện Dược liệu phối hợp với Công ty Cổ 2 phần Y Dược học dân tộc Hòa Bình tiến hành thực hiện đềtài “Nghiên cứu chiết xuất và tác dụng dược lý của bài thuốc chữa viêm đa khớp dạng thấp”. Mục tiêu của đềtài: Đềtài nhằm mục tiêu nghiên cứu chiết xuất và tác dụng dược lý của bài thuốc chữa viêm đa khớp dạng thấp làm cho thuốc an toàn, hiệu quảvà tiện lợi hơn nhưng vẫn đảm bảo các nguyên tắc của Y học cổtruyền. Nội dung nghiên cứu: 1. Phân tích thành phần hóa học của các vịthuốc chính trong bài thuốc và trong “Cao chữa thấp khớp”. 2. Nghiên cứu cải tiến phương pháp chiết xuất bán thành phẩm từbài thuốc. 3. Nghiên cứu một sốtác dụng dược lý của “Cao chữa thấp khớp” và chếphẩm chiết xuất mới so sánh với một sốthuốc tham chiếu tương ứng: ‚ Tác dụng chống viêm cấp. ‚ Tác dụng chống viêm mạn. ‚ Tác dụng giảm đau (thực hiện trên 2 mô hình: gây đau bằng acid acetic và gây đau bằng tấm nóng). ‚ Tác dụng hạsốt.

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA BÀI THUỐC CHỮA VIÊM

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA BÀI THUỐC CHỮA VIÊM ĐA KHỚP DẠNG THẤP

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Bùi Thị Bằng

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1 Tên đề tài: Nghiên cứu chiết xuất và tác dụng dược lý của bài thuốc chữa viêm

đa khớp dạng thấp

2 Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Bùi Thị Bằng

TS Trịnh Thị Điệp

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu

4 Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế

5 Thư ký đề tài: TS Trịnh Thị Điệp

6 Danh sách những người thực hiện chính:

1 PGS TS Bùi Thị Bằng Viện Dược liệu

2 TS Trịnh Thị Điệp Viện Dược liệu

3 PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương Trung tâm Sâm và Dược liệu TP

Hồ Chí Minh (TT SDL TPHCM)

4 DS Nguyễn Kim Phượng Viện Dược liệu

5 TS Lê Kim Loan Viện Dược liệu

6 DS CKI Nguyễn Kim Bích Viện Dược liệu

7 CN Trương Vĩnh Phúc Viện Dược liệu

8 ThS Nguyễn Thị Phương Viện Dược liệu

9 ThS Nguyễn Thị Phượng Viện Dược liệu

10 ThS Đỗ Thị Phương Viện Dược liệu

11 DS Phan Thị Phượng Viện Dược liệu

12 CN Đặng Ngọc Bích Viện Dược liệu

13 ThS Nguyễn Thị Hồng Anh Viện Dược liệu

14 Th.S Trần Mỹ Tiên TT SDL TPHCM

15 DS Lương Kim Bích TT SDL TPHCM

16 CN Hồ Việt Anh TT SDL TPHCM

17 CN Lê Minh Triết TT SDL TPHCM

18 DSTC Nguyễn Thị Nụ Viện Dược liệu

19 DSTC Trịnh Thị Nga Viện Dược liệu

20 DSTC Nguyễn Thị Huyền Phương Viện Dược liệu

21 Lương y Phạm Quang Huy Cty CP Y Dược học dân tộc Hòa Bình

22 DS Bùi Thị Thích Cty CP Y Dược học dân tộc Hòa Bình

7 Thời gian thực hiện: từ tháng 11/2007 đến tháng 5/2010

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

(Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) ACR American College of Rheumatology

AST Aspartate aminotransaminase

BP Dược điển Anh (British Pharmacopoeia)

BuOH Butanol

CMC Carboxy methyl cellulose

COX Cyclooxygenase

cs Cộng sự

DĐVN Dược điển Việt Nam

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMARD Thuốc chống thấp khớp thay đổi được bệnh (Disease

Modifying AntiRheumatic Drugs) DMSO Dimethylsulfoxyd

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

KHCN Khoa học công nghệ

MeOH Methanol

MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry)

NSAID Thuốc chống viêm phi steroid (Non-steroidal

TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

1.2 Một số thông tin chung về 17 vị thuốc trong bài thuốc 14

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu hóa học và chiết xuất 202.2.1.1 Phương pháp định tính các nhóm chất 202.2.1.2 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc các chất 23

2.2.1.4 Phương pháp nghiên cứu chiết xuất bán thành phẩm 26

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý và độc tính 272.2.2.1 Mẫu thử 272.2.2.2 Động vật nghiên cứu 272.2.2.3 Phương pháp thử tác dụng chống viêm cấp 282.2.2.4 Phương pháp thử tác dụng chống viêm mạn 282.2.2.4 Phương pháp thử tác dụng giảm đau 292.2.2.4.1 Thực nghiệm gây đau xoắn bụng bằng acid acetic 292.2.2.4.2 Thực nghiệm gây đau bằng tấm nóng 29

2.2.2.6 Phương pháp thử độc tính cấp 312.2.2.7 Phương pháp thử độc tính bán trường diễn 31

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tiêu chuẩn hóa bán thành phẩm và

thuốc

34

3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học của bài thuốc 363.1.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong các dược liệu bằng phản ứng

3.1.3 Định lượng phân đoạn chất tan trong ethyl acetat và phân đoạn chất

tủa trong hỗn hợp aceton – diethylether (4:1)

40

3.1.4 Phân lập và xác định cấu trúc các chất trong vị thuốc hy thiêm 41

3.2 Nghiên cứu cải tiến phương pháp chiết xuất bài thuốc 433.2.1.Thiết kế nghiên cứu 443.2.2 Chiết xuất các sản phẩm để thử sàng lọc tác dụng chống viêm cấp

và giảm đau

45

3.2.3 Tác dụng chống viêm và giảm đau của các chế phẩm chiết xuất 463.2.3.1 Tác dụng chống viêm cấp của các chế phẩm chiết xuất 473.2.3.2 Tác dụng giảm đau của các chế phẩm chiết xuất 493.2.4 Xây dựng quy trình chiết xuất cao bán thành phẩm từ bài thuốc 503.2.4.1 Xây dựng quy trình chiết xuất cao bán thành phẩm từ bài thuốc

quy mô phòng thí nghiệm

50

3.2.4.2 Triển khai quy trình chiết xuất cao bán thành phẩm từ bài thuốc

quy mô pilot

53

3.3 Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của cao chữa thấp khớp và

sản phẩm chiết xuất mới từ bài thuốc

56

3.3.1 Kết quả thử tác dụng chống viêm cấp 563.3.2 Kết quả thử tác dụng chống viêm mạn 59

3.3.3.1 Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau xoắn bụng bằng acid

3.5 Nghiên cứu bào chế Viên chữa thấp khớp 76

3.5.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của tá dược rã đến chất lượng viên nén 773.5.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ các tá dược rã đến chất lượng viên

3.7 Theo dõi độ ổn định của Viên chữa thấp khớp 92

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm đa khớp dạng thấp là một bệnh thường gặp trong các bệnh khớp mạn tính Đây là bệnh mang tính xã hội vì tỷ lệ mắc bệnh cao, diễn biến kéo dài, hậu quả dẫn đến biến dạng khớp, dính khớp, cứng khớp, bệnh nhân có thể trở nên tàn phế, mất khả năng vận động và lao động Tỷ lệ mắc bệnh chung là khoảng 0,5 -5% dân số người lớn trên thế giới, ở Việt Nam tỷ lệ này vào khoảng 0,5 – 0,55% dân số [1], [39]

Hiện nay thuốc điều trị viêm đa khớp dạng thấp trong y học hiện đại có nhiều loại thuộc các nhóm: thuốc giảm đau, thuốc chống viêm phi steroid (NSAID), corticosteroid, thuốc ức chế miễn dịch … Các thuốc này đã và đang

có đóng góp đáng kể trong kiểm soát bệnh, cải thiện tình trạng sức khỏe của bệnh nhân nhưng vẫn còn có nhiều tác dụng không mong muốn như gây loét dạ dày, tá tràng, loãng xương, teo cơ và nhiều rối loạn ở các cơ quan khác Một số thuốc mới có ít tác dụng không mong muốn hơn nhưng giá thành còn rất cao Cho đến nay, mặc dù bệnh đã được quan tâm nghiên cứu nhiều, nhất là ở các nước phát triển, nhưng viêm đa khớp dạng thấp vẫn là một căn bệnh mạn tính và khó điều trị Người bệnh phải kiên trì điều trị lâu dài và có xu hướng tìm đến các thuốc có ít tác dụng phụ với giá cả hợp lý Vì vậy, thuốc có nguồn gốc từ thảo mộc đã và đang là lựa chọn của nhiều thầy thuốc và bệnh nhân Trong y học cổ truyền nhiều vị thuốc, bài thuốc đã được ông cha chúng ta sử dụng từ ngàn xưa để chữa thấp khớp Bài thuốc chữa thấp khớp do Công ty cổ phần y dược học dân tộc Hòa Bình, mà tiền thân là Phòng nghiên cứu Đông y Hòa Bình sưu tầm, là kết quả thừa kế những kinh nghiệm hay, bài thuốc quý của các dân tộc tại tỉnh Hòa Bình Lúc đầu bài thuốc chữa bệnh thấp khớp được sử dụng dưới dạng thuốc thang đóng gói tổng hợp các loại dược liệu băm

thái và sau đó được nấu thành cao mềm “Cao chữa thấp khớp” đã được Bộ Y

tế duyệt cấp số đăng ký và lưu hành trên toàn quốc từ năm 1989 đến nay Thuốc đã được sử dụng điều trị có kết quả tốt cho nhiều người bị bệnh thấp khớp cấp và mạn tính Tuy nhiên, dạng bào chế này không hoàn toàn thuận tiện cho bệnh nhân, khối lượng thuốc phải uống mỗi ngày tương đối lớn, từ 15 đến

20 g cao mềm pha trong nước Bài thuốc cũng chưa được kiểm chứng tác dụng dược lý và độ an toàn bằng thực nghiệm khoa học

Để có thể sử dụng bài thuốc hiệu quả, an toàn và tiện lợi hơn, được phép của Bộ Y tế, Vụ KH-ĐT Bộ Y tế, Viện Dược liệu phối hợp với Công ty Cổ

phần Y Dược học dân tộc Hòa Bình tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và tác dụng dược lý của bài thuốc chữa viêm đa khớp dạng thấp”

Mục tiêu của đề tài:

Đề tài nhằm mục tiêu nghiên cứu chiết xuất và tác dụng dược lý của bài thuốc chữa viêm đa khớp dạng thấp làm cho thuốc an toàn, hiệu quả và tiện lợi hơn nhưng vẫn đảm bảo các nguyên tắc của Y học cổ truyền

Nội dung nghiên cứu:

1 Phân tích thành phần hóa học của các vị thuốc chính trong bài thuốc và trong “Cao chữa thấp khớp”

2 Nghiên cứu cải tiến phương pháp chiết xuất bán thành phẩm từ bài thuốc

3 Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của “Cao chữa thấp khớp” và chế phẩm chiết xuất mới so sánh với một số thuốc tham chiếu tương ứng:

5 Nghiên cứu dạng bào chế và độ ổn định của viên thuốc chữa thấp khớp

6 Xây dựng tiêu chuẩn của bán thành phẩm và viên thuốc chữa thấp khớp

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về thuốc chữa viêm đa khớp dạng thấp

1.1.1 Tóm tắt đại cương về bệnh viêm đa khớp dạng thấp

*Theo Y học hiện đại :

Viêm đa khớp dạng thấp (VĐKDT) là một bệnh tự miễn khá điển hình ở người, dưới dạng viêm mạn tính ở nhiều khớp ngoại biên với biểu hiện khá đặc trưng: sưng khớp, đau khớp, cứng khớp buổi sáng và đối xứng hai bên Ngoài biểu hiện chính tại khớp, người bệnh còn có các biểu hiện toàn thân (mệt mỏi, xanh xao, sốt, gầy sút…) và tổn thương các cơ quan khác [1], [23], [31]

VĐKDT diễn biến từng đợt, ở giai đoạn đầu, nếu được phát hiện sớm và chữa trị tích cực, đúng cách, bệnh có thể thuyên giảm tốt Nếu bệnh đã chuyển sang giai đoạn hai, xuất hiện tổn thương ở sụn khớp và đầu xương, người bệnh có nguy cơ bị biến dạng khớp, dính khớp, cứng khớp và mất khả năng vận động của khớp

Số người mới mắc bệnh hàng năm : 25–30 người/100.000 dân/mỗi năm Khoảng 50 % bệnh nhân bị ảnh hưởng chức năng nặng nề và bị giảm tuổi thọ Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi nhưng thường gặp nhất là tuổi 30 – 60

Bệnh gặp nhiều ở nữ, tỷ lệ Nữ/Nam là 3/1.Tỷ lệ mắc bệnh của phụ nữ béo phì cao gấp 5 lần so với những phụ nữ bình thường

Sinh bệnh học

Những năm gần đây, đã có những hiểu biết sâu hơn về đáp ứng viêm và cơ chế hủy hoại tổ chức của bệnh VĐKDT Tuy nhiên nguyên nhân của bệnh, yếu tố khởi phát và duy trì sự tồn tại lâu dài của bệnh vẫn còn là ẩn số Gần đây người ta cho rằng viêm đa khớp dạng thấp là một bệnh tự miễn, với sự tham gia của các yếu

tố sau [1], [37]:

- Tác nhân gây bệnh: có thể là virus, vi khuẩn, dị nguyên nhưng chưa được xác định chắc chắn

- Yếu tố cơ địa: bệnh có liên quan rõ rệt đến giới tính (70-80% bệnh nhân là nữ) và tuổi (60-70% gặp ở người trên 30 tuổi)

- Yếu tố di truyền: VĐKDT có tính gia đình, có liên quan với kháng nguyên hóa hợp tổ chức HLA DR4 (gặp 60-70% bệnh nhân có yếu tố này, trong khi tỷ lệ này ở cộng đồng chỉ là 30%)

- Các yếu tố thuận lợi khác: môi trường sống ẩm thấp, cơ thể suy yếu mệt mỏi, nhiễm lạnh, phẫu thuật

Quan niệm về điều trị:

Cho đến nay, bệnh VĐKDT vẫn là bệnh chưa có khả năng chữa khỏi Mục đích cao nhất của điều trị VĐKDT là làm giảm đau, giảm các khó chịu, ngăn chặn các biến dạng và giữ gìn các chức năng bình thường của khớp Do các nguyên nhân xác thực của bệnh vẫn chưa được biết rõ, việc điều trị hiện nay vẫn chỉ nhắm vào các yếu tố trong quá trình viêm mạn Các hậu quả của VĐKDT cấp tính và mạn tính đều do viêm kéo dài, không điều khiển và kiểm soát được gây nên phá hủy mô và mất chức năng của các khớp Vì vậy nguyên tắc điều trị là phải kiểm soát trọn vẹn, lâu dài và cơ bản quá trình viêm đó [31]

*Theo Y học cổ truyền :

Y học cổ truyền (YHCT) quan niệm tất cả các bệnh có đau nhức ở khớp

xương, có sưng nóng đỏ hay chỉ tê, nặng ở tại khớp đều nằm trong phạm trù chứng

tý hay bệnh tý Tý có nghĩa là tắc nghẽn không thông

+ Viêm khớp dạng thấp tiến triển :Đợt cấp của viêm khớp dạng thấp với các triệu chứng các khớp sưng, nóng, đỏ, đau xuất hiện đối xứng, có tính chất tiến triển (sưng, đau, nóng đỏ từ khớp này chuyển sang khớp khác, nhưng khớp ban đầu bị vẫn sưng, đau nóng đỏ, xuất hiện ở các khớp cổ tay, khuỷu tay, cổ chân, khớp gối đặc biệt là khớp bàn ngón chân và tay), cử động khớp khó khăn, sốt, ra

mồ hôi, sợ gió, rêu lưỡi vàng mỏng, chất lưỡi đỏ, nước tiểu vàng, mạch hoạt sác, theo Đông y gọi là thể phong thấp nhiệt tý

+ Viêm khớp dạng thấp kéo dài có biến dạng khớp, teo cơ, dính cứng khớp, Đông y gọi là thể đàm ứ ở kinh lạc

Quan niệm về bệnh sinh:

- Do sức đề kháng và khả năng tự bảo vệ của cơ thể không đầy đủ, các yếu tố gây bệnh là Phong – Hàn - Thấp cùng phối hợp tác động xâm phạm đến kinh lạc –

cơ – khớp, làm cho sự vận hành của khí huyết bị tắc nghẽn không thông gây ra sưng đau, hoặc không sưng mà chỉ đau tê mỏi nặng ở một khu vực khớp xương

hoặc toàn thân

- Do chính khí hư suy vì mắc bệnh lâu ngày, hay do người già các chức năng hoạt động cơ thể bị suy yếu, làm cho khí huyết cũng giảm sút không nuôi dưỡng được cân mạch gây nên tình trạng thoái hóa khớp xương và gây nên đau

Quan niệm về điều trị:

- Khu phong, thanh nhiệt, hoạt huyết, lợi niệu, trừ thấp Do quan niệm sưng – đau khớp xương là do tắc nghẽn sự vận hành của khí huyết, và do chức năng tạng phủ suy yếu ảnh hưởng đến việc tạo ra khí huyết làm cho khí huyết giảm sút không nuôi dưỡng cân mạch đầy đủ gây ra đau nhức khớp xương nên việc điều trị nhằm vào mục tiêu giải tỏa sự tắc nghẽn, đưa các yếu tố gây bệnh (phong, hàn, thấp, nhiệt) ra ngoài và bổ dưỡng khí huyết - mạnh gân xương, đề phòng sự tái phát của bệnh

- Các phương pháp điều trị bao gồm từ không dùng thuốc như: tập luyện vận động, dưỡng sinh, xoa bóp, chườm nóng, ăn uống và châm cứu, đến việc dùng thuốc và điều trị bên ngoài như đắp bó thuốc ngoài khớp sưng đau đến uống trong,

sử dụng các loại thực vật, động vật và khoáng chất vào điều trị

1.1.2 Thuốc điều trị bệnh VĐKDT

1.1.2.1.Thuốc tân dược

Có 3 nhóm thuốc thường được dùng trong điều trị VĐKDT:

- Các thuốc chống viêm phi steroid (NSAID)

- Corticosteroid

- Thuốc chống thấp khớp thay đổi được bệnh (DMARD)

*Các thuốc chống viêm phi steroid:

Tác dụng chính của các thuốc này là làm giảm triệu chứng bệnh (kháng viêm, giảm đau, giảm cứng khớp), nhưng không thể làm thay đổi tiến triển của bệnh cũng như không giúp phòng tránh biến dạng khớp

Cơ chế của thuốc:

- Ức chế tổng hợp các prostaglandin (PG) do ức chế enzym cyclooxygenase COX-1 và COX-2, làm giảm PG E2 và F1α là những chất trung gian hóa học của phản ứng viêm

- Làm bền vững màng tiêu thể ngăn cản giải phóng các men tiêu thể là những yếu tố gây phản ứng viêm mạnh

Tác dụng không mong muốn: thường liên quan đến tác dụng ức chế tổng hợp PG

- Loét dạ dày, ruột: PG, đặc biệt là PG E2 có tác dụng làm tăng tạo chất nhầy Thuốc ức chế tổng hợp PG làm niêm mạc dạ dày bị mất lớp bảo vệ trước sự tấn công của acid dịch vị

- Làm kéo dài thời gian chảy máu do ngưng kết tiểu cầu

- Với thận, PG có vai trò điều hòa tuần hoàn thận Ức chế tổng hợp PG gây hoại tử gan và sau là viêm thận kẽ mạn, giảm chức phận cầu thận

- Dễ gây quái thai, rối loạn ở phổi, gây cơn hen giả, tăng nguy cơ tim mạch

Một số thuốc chống viêm phi steroid [1], [19], [31]:

- Dẫn xuất salicylat (aspirin, diflunisal)

- Dẫn xuất pyrazolon (phenylbutazon)

- Dẫn xuất acetic (indometacin, sulindac, diclofenac)

- Dẫn xuất oxicam (piroxicam, tenoxicam)

- Dẫn xuất propionic (ibuprofen, naproxen, fenoprofen, ketoprofen)

- Nhóm ức chế chọn lọc COX-2 (meloxicam, celecoxib, nimesilide)

*Các thuốc nhóm corticosteroid:

Corticosteroid vừa có tác dụng chống viêm mạnh vừa có tác dụng ức chế miễn dịch nên làm giảm các triệu chứng của VĐKDT rất nhanh chóng và rõ ràng

Có thể dùng đường uống, tiêm ven, tiêm bắp hoặc tiêm tại chỗ

Cơ chế tác dụng chống viêm: ức chế sản xuất kháng thể, ức chế khả năng di

chuyển và tập trung bạch cầu, cản trở thực bào, hạn chế việc giải phóng và phát huy tác dụng của các enzym tiêu thể, ức chế quá trình tổng hợp PG do ức chế enzym phospholipase A2 [19]

Tác dụng không mong muốn [1], [31] :

- Trên hệ miễn dịch: làm giảm sức đề kháng của cơ thể, tăng nguy cơ nhiễm trùng, nhiễm lao, nhiễm nấm, nhiễm virus và các nhiễm trùng cơ hội khác

- Trên hệ cơ xương khớp: gây loãng xương, teo cơ, gây hoại tử vô khuẩn ở các đầu xương, rối loạn phát triển xương

- Trên hệ tiêu hóa: viêm loét dạ dày - tá tràng

- Trên hệ tim mạch: tăng huyết áp, gây phù do giữ nước và muối; làm mất kali gây mệt mỏi, liệt nhẹ, rối loạn nhịp tim

- Trên da và niêm mạc: trứng cá, rậm lông, teo da, rạn da, lâu liền sẹo

- Trên mắt: đục thủy tinh thể, tăng nhãn áp

- Trên chuyển hóa: tăng đường huyết; rối loạn lipid máu, rối loạn phân bố mỡ trong cơ thể, gây hội chứng cushing, rối loạn nước và điện giải

- Trên hệ thần kinh, tâm thần: kích thích, mất ngủ, run, hoang tưởng, trầm cảm, loạn cảm

- Tai biến do ngừng thuốc đột ngột: bệnh bột phát trở lại, suy thượng thận cấp

Một số thuốc corticosteroid thường dùng [1], [19], [31]: Cortison, hydrocortison,

prednison, prednisolon, methyl prednisolon, triamcinolon, betamethason, dexamethason

*Thuốc chống thấp khớp cải thiện được bệnh (Disease Modifying antirheumatic Drugs - DMARD)

Các thuốc nhóm DMARD không có tác dụng giảm đau ngay và thường có tác dụng rõ rệt trên lâm sàng sau hàng tháng điều trị Chúng làm hạn chế quá trình phát triển của bệnh, trong khi ấy vẫn tồn tại một mức độ viêm mạn tính nhất định nên lúc đầu hoặc từng giai đoạn phải dùng kết hợp với một thuốc kháng viêm Các thuốc thuộc nhóm này làm chậm được tiến triển của tổn thương ăn mòn khớp và làm chậm sự lan rộng các tổn thương này Tuy nhiên, thuốc phải được duy trì lâu dài (suốt đời nếu không có tác dụng phụ buộc phải ngừng thuốc) vì bệnh thường tái phát trở lại sau khi ngừng thuốc

Một số thuốc chống thấp khớp cải thiện được bệnh [19], [31]:Methotrexat, cloroquin và hydroxycloroquin, sulphasalazin, leflunomid, muối vàng

Tóm lại, VĐKDT không đơn thuần là một bệnh lý tại khớp mà là một bệnh

lý tự miễn điển hình với các biểu hiện tại khớp, toàn thân, ngoài khớp ở nhiều mức

độ khác nhau, diễn biến phức tạp, gây hậu quả nặng nề, cần được điều trị tích cực ngay từ đầu Việc kiểm sóat sớm bệnh là điều kiện chủ yếu để hạn chế tối đa

những tổn thương khớp không hồi phục và các hạn chế chức năng của khớp Các thuốc NSAID và corticosteroid chỉ giúp làm giảm nhẹ các triệu chứng bệnh Điều trị sớm bằng các thuốc chống thấp khớp thay đổi được bệnh (DMARD) có thể giúp tránh các tổn thương khớp không hồi phục Xu thế của thế giới hiện nay là sử dụng DMARD cổ điển đơn độc hoặc phối hợp với nhau hoặc phối hợp với các thuốc mới và các biện pháp điều trị sinh học kháng TNF-α, kháng thụ thể interleukin 1 Tuy nhiên, các thuốc trên đều có thể gây nhiều tác dụng không mong muốn

1.1.2.2.Thuốc đông dược điều trị VĐKDT

Một số bài thuốc điều trị VĐKDT lưu hành trên thị trường:

Thị trường thuốc chữa các bệnh đau nhức xương, khớp và VĐKDT rất phong phú và đa dạng Nhu cầu của nhân dân về loại thuốc này cũng ngày càng gia tăng Hầu hết các công ty Dược và các cơ sở thuốc Đông dược đều sản xuất mặt hàng thuốc này Dưới đây là một số trong rất nhiều loại thuốc đông dược chữa các chứng đau nhức xương, khớp và VĐKDT đang lưu hành trên thị trường

Bảng 1.1 Một số thuốc chữa thấp khớp đang lưu hành trên thị trường

STT Tên thuốc Thành phần Dạng bào chế Nhà sản xuất

1 Cao chữa

thấp khớp

Bạch mao căn, bạch hoa xà, câu đằng, cốt khí, hy thiêm, hoàng lực, tang chi, tất bát, tầm gửi, sâm đại hành, mộc miên, cát bối, vảy tê tê, thiên niên kiện, thổ phục linh, kê

Hoàn cứng Hộp 10 túi x

5 gram

Công ty CP Traphaco

3 Hoàn phong

thấp

Hy thiêm, ngưu tất, quế chi, cẩu tích, ngũ gia bì, mật ong, sinh địa, đường kính, acid benzoic, acid citric

Hoàn mềm 10g - hộp giấy 6 viên

Công ty CP Dược phẩm Nam Hà

4 Hy đan Hy thiêm, ngũ gia bì chân

chim, mã tiền chế

Hoàn cứng Công ty CP

Dược - Vật tư

Y tế Thanh Hóa

Hoàn cứng

Lọ 250 viên (30g) hoặc

400 viên (48g)

Cơ sở sản xuất thuốc YHCT

bà Giằng

6 Phong tê

thấp

Hà thủ ô đỏ, thổ phục linh, phòng kỷ, hy thiêm, thương nhĩ tử, thiên niên kiện

Thuốc nước uống

Hộp 1 chai 80ml, hộp 1 chai 200ml

Công ty TNHH Dược phẩm Fito Pharma

Thuốc nước Hộp 1 chai 270ml

Công ty CP Dược Hậu Giang

gia bì, cam thảo

Thuốc nước uống

Độc hoạt, khương hoạt, tang

ký sinh, xuyên tần giao, phòng phong, tế tân, đương qui

Hoàn cứng Hộp 1lọ x

60 viên

Vạn Xương đường

10 Tuzamin Tục đoạn, phòng phong, hy

thiêm, độc hoạt, tần giao, bạch thược, ngưu tất, thiên niên kiện

Viên nang Hộp 3 vỉ, 10

vỉ x 10

Công ty CP Dược Trung ương

Mediplantex

11 Vimatime Mã tiền chế, thương truật,

hương phụ, mộc hương, địa liền và quế chi

Viên nén bao phim

Công ty Dược khoa - Đại học Dược Hà Nội

10

Công ty CP dược phẩm

Hộp 10gói x 5gam hoàn cứng

Công ty TNHH dược phẩm Thiên Thảo

14 Yêu thống

hoàn

Đỗ trọng, tục đoạn, độc hoạt, cẩu tích, cốt toái bổ, sinh địa, đương qui, khương hoạt, thiên ma, hà thủ ô đỏ, đan sâm

Hộp 10 hoàn mềm X 7 g

Cơ sở Đặng Nguyên Đường

Nhận xét:

- Các thuốc đông dược thường là các bài thuốc cổ phương, cổ phương gia giảm, gồm nhiều vị thuốc Các bài thuốc được lập trên cơ sở lý luận về chứng bệnh đau nhức xương khớp của đông y: Huyết hư sinh phong, can thận hư sinh phong, phong - hàn - thấp xâm nhập gây phong thấp Thành phần gồm 2 nhóm chính:

+ Thuốc trị bệnh: với công năng trừ phong thấp, chỉ thống

+ Thuốc bổ: Bổ huyết, bổ khí, bổ gan thận, mạnh gân cốt

Ngoài ra, trong các bài thuốc còn có các vị thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu Một nguyên lý phổ biến của y học cổ truyền được áp dụng trong các bài thuốc là: công bổ kiêm trị, bổ chính để công tà, bổ khí huyết gan thận để trừ phong hàn thấp

- Các vị thuốc thường gặp trong các bài thuốc chữa viêm khớp: hy thiêm,

độc hoạt, tang ký sinh, tục đoạn, quế chi, ngưu tất, đương qui, xuyên khung, thiên

niên kiện và mã tiền chế

- Dạng bào chế đơn giản, phổ biến là dạng thuốc nước, viên hoàn cứng, hoàn mềm, cao mềm Một số ít thuốc được bào chế hiện đại hơn như viên nén bao phim, viên nang

- Hầu hết các bài thuốc được dùng theo kinh nghiệm, tác dụng và độ an toàn chưa được chứng minh khoa học trên thực nghiệm hoặc trên lâm sàng Tiêu chuẩn chất lượng chưa cao, chưa có các chỉ tiêu định lượng hoạt chất để kiểm soát chất lượng và bảo đảm chất lượng ổn định trong sản xuất và lưu thông

Các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng [35], [38], [85], [94]:

Gần đây người ta cho rằng sử dụng các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng có tác dụng trong phòng và hỗ trợ điều trị VĐKDT

-Những loại cá giàu acid béo hệ Omega-3 gồm: cá hồi, cá thu, các trích, cá mòi, cá ngừ, cá trống [38]

-Acid béo hệ Omega-6 GLA (tức acid gamma-linolenic): có khả năng ngăn chặn tiến trình sản sinh ra các chất prostaglandin gây chứng viêm [94]

-Các vitamin C, D, E, K và beta-carotene (có tác dụng chống oxy hóa) có thể giúp phòng tránh được một số dạng viêm khớp Vitamin C và D có khả năng cải thiện bệnh viêm xương- khớp

Những nghiên cứu mới về các hợp chất tự nhiên có tác dụng chống viêm khớp:

Những năm gần đây các nhà nghiên cứu bắt đầu quan tâm và đẩy mạnh việc nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có tác dụng giảm nhẹ các triệu chứng của VĐKDT Kết quả thu được rất khả quan: dường như tất cả những chất có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch đều thể hiện tác dụng cải thiện rõ rệt các chứng viêm, sưng, đau khớp và hệ thống miễn dịch ở chuột bị gây VĐKDT tiến triển Các hợp chất được phát hiện có tác dụng chống viêm khớp trên thực nghiệm và một số chất đã được thử nghiệm trên lâm sàng rất phong phú về số lượng và đa dạng về cấu trúc hóa học, là những chất, nhóm chất rất phổ biến trong thiên nhiên, như: saponin, flavonoid, glucosid, anthraquinon, terpenoid, lacton, dầu nhựa v.v Kết quả này mở ra triển vọng sử dụng các hợp chất tự nhiên một cách hiệu quả và ít độc hại trong điều trị các triệu chứng VĐKDT Xu hướng chung hiện nay là nghiên cứu sàng lọc, chiết xuất định hướng tìm các chất, nhóm chất hoặc cao tinh chế tiêu chuẩn dùng làm thuốc thay vì sử dụng cao toàn phần Một

số thuốc thảo mộc cũng được thử nghiệm trên lâm sàng có kết quả khả quan Dưới đây là một số thí dụ:

Các hợp chất phenolic:

Catechin: Catechin với liều uống 60, 120mg/kg thể trọng đã ức chế viêm,

sưng bàn chân và chỉ số viêm đa khớp ở chuột bị gây viêm khớp thực nghiệm [70]

Flavonoid: Flavonoid toàn phần chiết xuất từ Turpinia arguta Seen với các

liều thử 80, 160, 320 mg/kg thể trọng đã giảm viêm, sưng và những thay đổi bệnh

lý ở bàn chân chuột bị gây viêm khớp thực nghiệm [68 ] Flavonoid toàn phần

chiết xuất từ Litsea coreana Levl với các liều thử 50, 100, 200 mg/kg đã ức chế

viêm khớp ở chuột bị gây viêm khớp thực nghiệm [107]

Astilbin: Cai và cs (Trường Đại học Dược Nam Kinh Trung Quốc) đã nghiên

cứu tác dụng chống viêm khớp của astilbin - flavonoid chiết xuất từ thổ phục linh

(Rhizoma Smilacis glabrae) trên chuột gây viêm khớp bằng collagen so sánh với

cyclosporin A (CsA) Kết quả cho thấy astilbin và CsA đều ức chế sưng bàn chân chuột và sự viêm khớp nhưng khác với CsA là astilbin không làm giảm trọng lượng cơ thể chuột như CsA Giải phẫu khớp cho thấy ở chuột không được điều trị khớp bị sưng, tăng sinh hoạt dịch và sụn khớp bị phá hủy Trong khi đó ở chuột được điều trị bằng astilbin hoặc CsA khớp được bảo toàn Các tác giả cho rằng astilbin có thể là chất điều trị viêm khớp có hiệu quả như CsA nhưng ít độc hơn [44]

Epigallocatechin-3-gallate (EGCG): “Epigallocatechin-3-gallate - một hợp

chất trong trà xanh có thể trở thành phương thuốc hiệu nghiệm đối với những người bị bệnh thấp khớp" là kết luận của các nhà nghiên cứu tại ĐH Sức khỏe Michigan Nhóm nghiên cứu đã phân tích hợp chất chống viêm được chiết xuất từ trà xanh và nhận thấy rằng hợp chất có tên epigallocatechin-3-gallate có thể ức chế khả năng sản xuất một số loại phân tử gây viêm và hủy hoại các khớp Hợp chất này trong trà xanh cũng được xem là có tác dụng tiêu viêm và giúp phục hồi các khớp bị viêm [35] Nhiều nghiên cứu khác cũng xác nhận tác dụng cải thiện viêm khớp của EGCG trên chuột thực nghiệm [81]

Anthraquinon: Cho chuột uống anthraquinon toàn phần (60 và 120 mg/kg) chiết xuất từ thiến thảo (Rubia cordifolia L.) đã làm giảm viêm, sưng khớp, giảm

mức interleukin 1, 2, 6 và yếu tố hoại tử (TNF) ở chuột bị gây viêm khớp bổ trợ [103]

Glucosid:

Paeoniflorin - glucosid chiết xuất từ Radix Paeoniae albae với các liều 5,

10, 20 mg/kg thể trọng chuột x 14 - 20 ngày đã ức chế viêm khớp và khôi phục trọng lượng các cơ quan miễn dịch ở chuột bị gây viêm khớp thực nghiệm [120] Cho chuột bị gây viêm khớp thực nghiệm uống glucosid toàn phần (50,100 mg/kg

thể trọng) chiết xuất từ mẫu đơn (Paeonia lactiflora Pall) đã ức chế viêm khớp tiến

triển ở chân chuột [109].

Glucosid toàn phần (30, 60, 120 mg/kg) chiết xuất từ mộc qua (Chaenomeles speciosa) có tác dụng giảm viêm, sưng, đau và chỉ số viêm đa khớp trên toàn thân

chuột bị gây viêm đa khớp bằng nghiệm pháp bổ trợ [51]

có triển vọng trong điều trị các triệu chứng VĐKDT [43]

Artesunate: Một nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học Mỹ và Trung

quốc cho thấy artesunate - dẫn xuất của artemisinin có tác dụng ức chế sự biểu hiện của yếu tố sinh mạch máu trên nguyên bào sợi của hoạt dịch phân lập từ người bệnh VĐKDT tiến triển Vì vậy nhóm tác giả cho rằng artesunate có triển vọng trong điều trị VĐKDT [110]

Saponin:

Saponin từ bồ kết (Gleditsia sinensis Lam.): Cho chuột uống phân đoạn

saponin toàn phần chiết xuất từ cây bồ kết với các liều 50, 100 và 200 mg/kg thể trọng đã làm giảm mức độ trầm trọng của viêm khớp bị gây bởi collagen II Xét nghiệm mô bệnh học khớp xương chuột được điều trị bằng saponin cho thấy giảm

sự thâm nhiễm viêm của tế bào, giảm sự tăng sinh hoạt dịch ở khớp và giảm kháng thể tự miễn kháng collagen II trong huyết thanh [59]

1.2 Một số thông tin chung về 17 vị thuốc trong bài thuốc – đối tượng nghiên cứu của đề tài

Bảng 1.2 Các thông tin về các vị thuốc trong bài thuốc

Stt Tên vị thuốc quy kinh Tính vị, Công năng Chủ trị Thành phần hóa học chính Tác dụng dược lý

[14], [15]

Thanh nhiệt giải biểu, khu phong trừ thấp, lợi thủy thông lâm, tiêu viêm [14], [15]

Cảm mạo phát sốt, phong thấp đau lưng, nhức xương, viêm khớp, sưng gối, kinh nguyệt không đều, ứ huyết trong bụng, hàn thấp, chân tay co quắp, bí tiểu tiện, đái buốt [14], [15]

Lignan gravinon A và B, sesquiterpen cylindren, arundoin, biphenyl ether cylindol A và B, hợp chất phenol imperanen [67], [75], [76], [77], [84]

Dịch chiết nước rễ cỏ tranh có tác dụng lợi tiểu, cầm máu, kháng khuẩn Chất coixol có trong thân rễ có tác dụng ức chế sức co bóp của cơ vân Imperanen

có tác dụng ức chế ngưng kết tiểu cầu thỏ Ngoài ra, rễ cỏ tranh còn có tác dụng an thần, giải nhiệt, giảm đau [2], [52]

[15]

Khử phong, giảm đau, tán ứ, tiêu thũng, giải độc, sát trùng [15]

Tràng nhạc, bạch huyết, bế kinh, tăng huyết áp [15]

Toàn cây bạch hoa xà có flavonoid, hợp chất phenol, triterpen, acid hữu cơ Trong

rễ, thân, lá đều có plumbagin [13], [22], [27], [28], [45], [91]

Dịch chiết bạch hoa xà có tác dụng chống viêm, chống đông máu, chống oxy hóa, chống u [2] Nguyễn Thị Vân Thái và cs đã chứng minh bạch hoa xà

có tác dụng điều trị viêm quanh khớp vai [30]

Plumbagin có tác dụng gây chết tế bào theo chương trình ở nhiều dòng tế bào ung thư và tác dụng kháng khuẩn mạnh [13], [22], [27], [28], [45], [91]

3 Câu đằng Ngọt, mát, Thanh nhiệt, Đau đầu, chóng Thành phần hóa học chính là Nước sắc câu đằng, alcaloid toàn phần

(Ramulus

cum Unco

Uncariae)

vào 2 kinh can, tâm bào [14], [15]

bình can, trừ phong, trấn kinh [14], [15]

mặt, hoa mắt, ù tai

do huyết áp cao, trẻ

em sốt cao kinh giật, nổi ban, lên sởi, sưng khớp (phong nhiệt) [14], [15]

alcaloid Thân và rễ câu đằng

U rhynchophyla chứa 0,041%

alcaloid toàn phần, trong đó rhynchophylin chiếm 28,9%, isorhynchophylin chiếm 14,7%

của câu đằng, hoạt chất rhynchophylin

có tác dụng hạ huyết áp rất rõ rệt trên động vật thực nghiệm Ngoài ra, câu đằng có tác dụng chống loạn nhịp tim,

an thần, chống co thắt cơ trơn [2]

Uncaria tomentosa được đánh giá là

một trong những cây thuốc có hiệu quả trong điều trị viêm đa khớp dạng thấp [82], [95], [96]

[14], [15]

Khu phong lợi thấp, tán

ứ chỉ thống, ngừng ho tiêu đờm

[14], [15]

Khớp xương tê đau, hoàng đản do thấp nhiệt, bụng báng,

ho có nhiều đờm, bỏng nước, bỏng lửa, ung thũng sang độc (mụn lở, nhọt độc), sưng đau do sang chấn [14], [15]

Thành phần hóa học chủ yếu trong cốt khí là các polyphenol như flavonoid, anthranoid [92]

Hợp chất stilben có trong cốt khí củ là resveratrol đã được chứng minh là hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa, chống lão hóa, chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn và nhiều tác dụng khác [65], [74], [78]

Cốt khí củ có tác dụng chống viêm trên các mô hình gây viêm thực nghiệm: gây phù chân chuột bằng kaolin và dextran, gây rỉ dịch màng phổi bằng tinh dầu thông, gây u hạt dưới da bằng amian, gây viêm dị ứng và viêm đa khớp bằng vaccin BCG, có tác dụng giảm đau trên

cả 2 mô hình mâm nóng và gây đau xoắn bụng bằng acid acetic [2], [18]

[14], [15]

Khu phong thấp, lợi quan tiết (khớp xương), giải độc [14], [15]

Phong thấp tê đau (thuộc nhiệt), gân cốt mềm yếu, lưng gối mỏi rời rã, tứ chi tê buốt, bán thân bất toại, phong chẩn thấp sang (thuộc nhiệt) [14], [15]

Thành phần hóa học chủ yếu trong hy thiêm là ent-pimarane diterpenoid và diterpenoid

darutosid, hythiemosid A và

B, 7beta-hydroxydarutigenol, 9beta-hydroxydarutigenol, 16- O-acetyldarutigenol, 15,16-di- O-acetyldarutosid ) [24], [55], [89], [116]

Lá hy thiêm có tác dụng ức chế khá mạnh giai đoạn viêm cấp tính trong thí nghiệm gây phù chân chuột cống trắng bằng kaolin và ức chế nhẹ giai đoạn viêm mạn tính [2] Dịch chiết cồn hy thiêm và các diterpenoid của hy thiêm

có tác dụng ức chế miễn dịch trên thực

nghiệm in vivo [99], [108] Hợp chất

pubetalin phân lập từ hy thiêm có tác dụng độc tế bào mạnh trên các dòng tế

bào ung thư B16 melanoma, A549, L1210 với ED 50 tương ứng là 0,45, 0,79, 0,37µg/ml [83]

Tán hàn, trục thấp, ôn trung, trị hỏa, sát trùng [20]

Chữa bụng lạnh đau, thổ tả, tẩy giun [20]

Alkaloid (nitidin chelerythin, dihydrochelerythrin,

oxyavicin, methoxychelerythrin, 8- hydroxydihydrochelerythrin) là thành phần chính của hoàng lực [47], [64], [66]

8-Các alcaloid nitidin và chelerythin có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm và cũng có tác dụng nhất định trên lâm sàng đối với bệnh bạch cầu hạt mạn tính Ở Trung Quốc, đã có báo cáo lâm sàng: dung dịch tiêm chế từ hoàng lực liều tương đương 3g dược liệu/ngày

có tác dụng giảm đau trên 500 bệnh nhân đau dây thần kinh, đau đầu, đau phong thấp, đau dạ dày [3] Các alkaloid benzophenanthridin trong hoàng lực nitidin, dihydrochelerythrin, oxyavicin, 8-methoxychelerythrin và 8- hydroxydihydrochelerythrin có tác dụng chống viêm và giảm đau như hydrocortison [60]

7 Tang chi

(Ramulus

Mori albae)

Hơi đắng, bình Vào kinh can [14], [15]

Trừ phong thấp, thông lợi khớp

[14], [15]

Khớp vai, khớp cánh tay đau, tê bại [14], [15]

Hầu hết các công bố tập trung nghiên cứu trên lá, quả và vỏ

rễ, chưa tìm được những nghiên cứu trên cành của dâu tằm Trong lá của cây dâu tằm

có chứa flavonoid, prenyloid, benzofuran…[111]

Dịch chiết methanol của lá dâu tằm có tác dụng chống viêm, ức chế miễn dịch [48], [41]

8 Tất bát

(Fructus

Piperis longi)

Cay, nóng, vào các kinh

vị, đại trường [14], [15]

Ôn trung, tán hàn, hạ khí, chỉ thống [14], [15]

Thượng vị đau lạnh, nôn mửa, tiêu chảy, thiên đầu thống Dùng ngoài chữa đau răng [14], [15]

Alkaloid khung piperidin, phenolic amid và tinh dầu [71], [72]

Cao chiết cồn và các alkaloid đã được chứng minh có tác dụng chống kết tập

tiểu cầu in vitro [63], [86] Tất bát có tác

dụng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh, tim [98], [101], [106] Rễ tất bát

đã được chứng minh có tác dụng giảm đau trên thực nghiệm [86]

Bổ gan thận, mạnh gân xương, an thai, lợi sữa [14], [15]

Gân cốt tê đau, động thai, phụ nữ sau khi đẻ ít sữa [14], [15]

Thành phần chính trong các loài tầm gửi là flavonoid như quercetin, avicularin

Tang ký sinh có tác dụng hạ huyết áp, lợi niệu trên chó mèo ở liều 0,4-0,5g/kg

thể trọng, làm giãn mạch ngoại biên in vitro và giảm trương lực cơ trơn và nhu

động ruột thỏ cô lập [17], [29] Tang ký

sinh L parasiticus được chứng minh là

có tác dụng giúp tăng mức độ hồi phục xương bị tổn thương [112]

[14], [15]

Trừ phong thấp, mạnh gân xương [14], [15]

Phong hàn tê đau, thắt lưng đầu gối đau lạnh, chân co rút tê bại [14], [15]

Serquiterpenoid, tinh dầu, triterpenoid, acid béo [79], [114]

Thân rễ thiên niên kiện có tác dụng ức chế yếu phù bàn chân chuột gây bằng kaolin, không ảnh hưởng trên u hạt thực nghiệm gây bằng amian và gây thu teo tuyến ức chuột cống đực non mức độ yếu [3] Serquiterpenoid của thiên niên kiện có ảnh hưởng đến sự phát triển của

tế bào xương in vitro [117]

11 Tục đoạn

(Radix

Dipsaci)

Đắng, cay, hơi ấm; vào các kinh can, thận

Bổ gan thận, mạnh gân xương, nối chiết thương (làm lành

Thắt lưng, đầu gối mỏi yếu, phong thấp tê đau, băng huyết, rong huyết, kinh nguyệt nhiều,

Saponin triterpen là thành phần

chính trong tục đoạn D asper,

ngoài ra còn có các hợp chất iridoid, bis-iridoid glycozid, polysaccharid [32], [33], [61],

Trong tục đoạn có các hoạt chất có tác dụng độc tế bào (saponin), chống oxy hóa (dẫn xuất của acid caffeoyl quinic), điều hòa miễn dịch (polysaccharid) [61], [62], [119] Dich chiết rễ tục đoạn có

[14], [15] vết gẫy, dập

xương), chỉ huyết [14], [15]

có thai ra máu, sưng đau do sang chấn [14], [15]

[102], [119] tác dụng chống loãng xương trên thực

[14], [15]

Trừ thấp, giải độc, thông lợi các khớp [14], [15]

Thấp nhiệt, lâm trọc, đới hạ, ung thũng, tràng nhạc,

lở ngứa, giang mai, trúng độc thủy ngân gây ra chân tay co quắp, gân xương đau nhức [14], [15]

Flavonoid : astilbin, isoastilbin, engeletin… [3], [46], [113]

Thổ phục linh có hoạt tính trị giun, sán, kháng virus, lợi tiểu, hạ đường huyết và

có nhứng tính chất của một thuốc chống viêm steroid như có tác dụng chống viêm cấp và mạn tính, gây thu teo tuyến

ức (ức chế miễn dịch), chống dị ứng, kháng histamin [3], [57] Tuy nhiên, nghiên cứu của Đỗ Trung Đàm và cs cho thấy cao chiết cồn 40% của thổ phục linh có tác dụng chống viêm cấp

và mạn tính yếu và cho rằng vai trò của thổ phục linh trong các bài thuốc chữa thấp khớp là do khả năng giải độc, loại trừ các chất độc sinh ra do quá trình viêm [16]

13 Kê huyết

đằng (Caulis

Spatholobi)

Đắng, ngọt, ấm; vào các kinh can, thận [14], [15]

Bổ huyết hoạt huyết, thông kinh lạc [14], [15]

Kinh nguyệt không đều, huyết hư, da vàng, tê bại, liệt, phong thấp tê đau [14], [15]

Flavonoid và các hợp chất phenol khác: catechin, naringenin, coumestrol, acid protocatechuic,

pseudobaptigenin, genistein…[50], [115], [118]

Kê huyết đằng có tác dụng chữa thiếu

máu hư lao [97] Cao chiết từ S cuberctus có hoạt tính chống ung thư và chống u di căn in vivo [56], [100]

14 Sâm đại

hành

(Bulbus

Hơi ngọt, hơi ấm; vào

3 kinh can,

Tư âm, dưỡng

huyết, chỉ

Thiếu máu, vàng

da, hoa mắt, nhức đầu,; ho ra máu,

Eleutherin, isoeleutherin, eleutherol [3] Dịch chiết toàn phần củ sâm đại hành có tác dụng kháng khuẩn mạnh, tác dụng

chống viêm cấp và mạn tính, tác dụng

Eleutherinis

subaphyllae)

tỳ, phế [14], [15]

huyết sinh

cơ, chỉ khái [14], [15]

băng huyết, thương tích lưu huyết (giã tươi đắp), ho gà viêm họng, mụn nhọt, chốc lở ngứa,

tê bại do thiếu dinh dưỡng [14], [15]

tăng hồng cầu và huyết sắc tố chuột trên

mô hình gây thiếu máu bằng acetat chì Các hoạt chất eleutherin, isoeleutherin, eleutherol có hoạt tính kháng khuẩn và làm tăng lưu lượng tuần hoàn ở tim cô lập chuột lang [3]

15 Mộc miên

(Cortex

Salmaliae)

Vị cay, tính bình [2], [20]

Khu phong, trừ thấp, hoạt huyết, tiêu thũng

Vỏ cây bó gẫy xương; cầm máu, chữa lậu, thông tiểu [2], [20]

Daucosterol, oleanolic acid, hesperidin, acid 2-O- methylisohemigossylic, lupeol [36], [58], [93]

Acid 2-O-methylisohemigossylic và lupeol có tác dụng gây chết tế bào theo chương trình ở dòng tế bào u bạch cầu tiền tủy bào HL-60 [36], [58], [93]

Thanh nhiệt, giải độc, tiêu thũng [2], [20]

Chữa cảm sốt, ho, đau bụng, mụn nhọt, chốc lở, ghẻ

Giúp tiêu hóa, phục hồi sức khỏe sau khi sinh [2], [20]

Cát bối chứa seselin, norbraylin, β-sitosterol Rễ chứa quinolin alkaloid, bis- tetrahydrofuran lignan (sesamolin và yangambin) Lá

chứa tinh dầu thơm (0,06%) và alcaloid (acronycin) [2], [42], [49]

Acronycin có tác dụng chống ung thư, trên thực nghiệm có tác dụng đối với bệnh bạch cầu [2], [42], [49]

17 Vảy tê tê

vị [20]

Tán huyết, thông lạc, tan ung nhọt [20]

Trị đau nhức các khớp xương, đầu xương Làm thuốc chữa đậu, trẩn, tắc tia sữa [20]

Các nguyên tố vi lượng Fe 675mg/kg, Mn 424mg/kg, Zn 190mg/kg và Cu 115mg/kg [21]

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các vị thuốc trong bài thuốc chữa viêm đa khớp

dạng thấp và cao chữa thấp khớp đều do Công ty cổ phần Y Dược học dân tộc Hòa

Bình cung cấp

Tỷ lệ thành phần các vị thuốc trong bài thuốc như sau:

Bạch mao căn (Rhizoma Imperatae cylindricae) 2,5 % Đạt DĐVN 3

Bạch hoa xà (Herba Plumbagonis zeylanicae) 6,7 % Đạt TCCS

Câu đằng (Ramulus cum Unco Uncariae) 5,0 % Đạt DĐVN 3

Cốt khí (Radix Polygoni cuspidati) 10,0 % Đạt DĐVN 3

Hy thiêm (Herba Siegesbeckiae) 3,3 % Đạt DĐVN 3

Hoàng lực (Caulis Zanthoxyli nitidi) 6,7 % Đạt TCCS

Tang chi (Ramulus Mori albae) 3,3 % Đạt DĐVN 3

Tất bát (Fructus Piperis longi) 3,3 % Đạt DĐVN 3

Tầm gửi (Ramulus Loranthi) 6,7 % Đạt DĐVN I, T 2

Thiên niên kiện (Rhizoma Homalomenae) 3,3 % Đạt DĐVN 3

Thổ phục linh (Rhizoma Smilacis glabrae) 3,3 % Đạt DĐVN 3

Kê huyết đằng (Caulis Spatholobi) 10,0 % Đạt DĐVN 3

Sâm đại hành (Bulbus Eleutherinis subaphyllae) 16,7 % Đạt DĐVN 3

Mộc miên (Cortex Salmaliae) 6,7 % Đạt TCCS

Cát bối (Folium Acronychiae laurifoliae) 5,0 % Đạt TCCS

Vảy tê tê (Squama Manitis) 0,8 % Đạt DĐVN I, T 2

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu hóa học và chiết xuất

2.2.1.1 Phương pháp định tính các nhóm chất

- Chiết các nhóm chất chính của bài thuốc theo phương pháp chiết phân

đoạn bằng các dung môi theo độ phân cực tăng dần

- Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học đặc

trưng

- Phân tích các nhóm chất theo phương pháp phân tích sàng lọc các hợp

chất thiên nhiên bằng sắc ký lớp mỏng:

1 Định tính nhóm alcaloid

Chuẩn bị mẫu: lấy 2-3g chế phẩm cao chiết bài thuốc Tiến hành chiết bằng

methanol, cô cạn thành cắn, hòa cắn trong 10ml nước, thêm 3ml dung dịch amoniac đậm đặc, chiết lấy phân đoạn dicloromethan, gộp các dịch chiết, làm bay hơi dung môi trên cách thủy đến cạn Hòa cắn thu được trong 2ml methanol được dung dịch chấm sắc ký

Pha tĩnh: silicagel G60 F245 tráng sẵn (Merck), đã hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ

Hệ dung môi [4], [90]

Toluen - ethylacetat (7:3) - ammoniac bão hòa

Benzen - ethanol (9:2)

Ethylacetat - acid acetic - acid formic - nước (100: 10: 10: 2)

Cloroform - methanol - nước (6,5: 2,5: 0,5)

Phát hiện : Thuốc thử Dragendorff và dung dịch acid sulfuric 10%/ ethanol

Thuốc thử Dragendorff và dung dịch natri nitrit 5% trong cồn 70% Với các thuốc thử trên các alcaloid thường cho các vết có màu vàng đến nâu

2 Định tính nhóm terpenoid

Chuẩn bị mẫu: lấy 2-3g chế phẩm cao chiết bài thuốc Tiến hành chiết bằng

methanol và hỗn hợp methanol: nước (4:1), làm bay hơi dung môi đến cắn, hòa cắn trong 2ml methanol được dung dịch chấm sắc ký

Pha tĩnh: silicagel G60 F245 tráng sẵn (Merck), đã hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ

Hệ dung môi [4], [90]

Cloroform - methanol (9:1) (4:1) Æ định tính dạng aglycol

Cloroform – methanol – amoniac (7,5: 2,5: 0,5)Æ định tính dạng glycosid Cloroform – methanol - nước (6,5: 2,5: 0,5)Æ định tính dạng glycosid

Phát hiện: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol

Anisaldehyd – acid sulfuric Với các thuốc thử trên các terpenoid thường cho các vết có màu khác nhau

từ màu xanh tím đến tím tuỳ thuộc vào bản chất của từng thành phần cụ thể

3 Định tính nhóm flavonoid

Chuẩn bị mẫu: lấy 2-3g chế phẩm cao chiết bài thuốc Tiến hành chiết bằng

methanol và hỗn hợp methanol: nước (4:1), làm bay hơi dung môi đến cắn, hòa cắn trong 2ml methanol được dung dịch chấm sắc ký

Pha tĩnh: silicagel G60 F245 tráng sẵn (Merck), đã hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ

Thuốc thử Natural product/UV366nm

Với các thuốc thử trên các thành phần thuộc nhóm flavonoid thường cho các vết phát quang màu đặc trưng

4 Định tính nhóm coumarin

Chuẩn bị mẫu: Tiến hành giống định tính nhóm terpenoid

Pha tĩnh: silicagel G60 F245 tráng sẵn (Merck), đã hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ

Hệ dung môi [4]

Toluen - ethylacetat (9:1); (7: 3) Æ định tính dạng aglycol

Toluen - ethylacetat - aceton - acid formic - nước (5:2:2:1) Æ định tính dạng aglycol

Ethylacetat - acid acetic - acid formic - nước (10:1:1:2) Æ định tính dạng glycosid

Phát hiện

Quan sát dưới đèn tử ngoại UV366nm

Dung dịch KOH 5% trong cồn/ quan sát dưới đèn tử ngoại UV 366nm

Các thành phần thuộc nhóm coumarin thường có phát quang dưới UV 366nm và phát quang đậm lên sau khi phun thuốc thử kali hydroxyd

5 Định tính nhóm đường và acid amin [4]

Chuẩn bị mẫu: lấy 2-3g chế phẩm cao chiết bài thuốc Tiến hành chiết bằng hỗn

hợp methanol: nước (4:1), làm bay hơi dung môi đến cạn, hòa cắn thu được trong 2ml hỗn hợp dung môi trên, được dung dịch chấm sắc ký

Pha tĩnh: silicagel G F245 tráng sẵn (Merck), đã hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ

Hệ dung môi:

Ethylacetat - acid acetic - acid formic - nước (10:1:1:2)

Cloroform - methanol - nước (6,5: 2,5: 0,5)

Isopropanol - acid acetic - nước (4:1:1)

n-butanol- acid acetic- nước (4:1:5); (8:3:2)

2.2.1.2 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc các chất

- Chiết xuất các phân đoạn trong dược liệu bằng các dung môi hữu cơ theo độ phân cực tăng dần

- Phân lập các hợp chất trong dược liệu bằng sắc ký cột Theo dõi các phân

đoạn sắc ký bằng SKLM:

+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254

(Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

+ Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063mm, Merck) và silica gel pha đảo YMC (30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.)

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý

và các phương pháp phổ bao gồm: điểm chảy, phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân:

+ Điểm chảy được đo trên máy Stuart SMP3

+ Phổ tử ngoại (UV) được ghi trên máy UV-VIS Cary 1E

+ Phổ hồng ngoại (IR) được đo dưới dạng viên nén KBr trên máy Impact

410 Nicolet tại Viện Hoá học, VKHCNVN

+ Phổ khối lượng (MS) được đo trên máy AGILENT 6310 Ion Trap của Viện Hoá học các hợp chất tự nhiên, VKHCNVN

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, VKHCNVN Chất nội chuẩn là tetramethyl silan

2.2.1.3 Phương pháp định lượng

- Định lượng phân đoạn chất tan trong ethyl acetat theo phương pháp cân:

Mô tả phương pháp:

Định lượng phân đoạn chất tan trong ethyl acetat trong dược liệu:

Cân chính xác khoảng 4g dược liệu xay nhỏ (P gam) đã xác định độ ẩm (W

%), cho vào bình cầu 500ml Thêm 200ml methanol, tiến hành chiết siêu âm trong

30 phút Cân khối lượng bình cùng dung môi trước và sau khi chiết Bổ sung dung môi cho đến khối lượng ban đầu Lọc lấy 100ml dịch lọc (tương đương 2g dược liệu) Cô cạn trên bếp cách thủy đến cắn Hòa cắn trong 20ml nước, chuyển vào bình lắng gạn Lắc với đồng lượng ether dầu vài lần đến khi dịch chiết ether dầu hết màu Pha nước còn lại được lắc tiếp với đồng lượng ethyl acetat Gạn lớp ethyl acetat vào cốc đã sấy đến khối lượng không đổi Tiếp tục làm như vậy đến khi dịch chiết ethyl acetat không màu Cô dịch ethyl acetat trên bếp cách thủy đến cắn Sấy cốc cùng cắn trong tủ sấy ở 1050C trong 3 giờ Để cốc trong bình hút ẩm 30 phút

và cân nhanh Tính khối lượng cắn (a gam)

Hàm lượng chất chiết được trong ethyl acetat được tính theo công thức:

a × 20000 X(%) =

P × (100 – W) Trong đó: X: Hàm lượng chất chiết được bằng ethyl acetat trong dược liệu (%) P: Khối lượng bột dược liệu đã cân để định lượng (g)

a: Khối lượng của cắn (g)

W: Độ ẩm của dược liệu (%)

- Định lượng phân đoạn chất tủa trong hỗn hợp aceton - diethylether (4:1) trong dược liệu, trong cao bán thành phẩm và trong viên chữa thấp khớp bằng phương pháp cân

Mô tả phương pháp:

Định lượng phân đoạn chất tủa trong hỗn hợp aceton - diethylether (4:1) trong dược liệu:

Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu (P gam) đã xác định độ ẩm (W

%), cho vào túi lọc rồi chiết Soxhlet với methanol đến khi dịch chiết không màu Dịch chiết methanol được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay cho tới khi còn khoảng 40ml Để nguội, lọc qua giấy lọc Tráng giấy lọc bằng 10ml methanol Cô còn khoảng 30ml Rót từ từ vào 300ml hỗn hợp aceton – diethylether (4:1) Để cốc vào tủ lạnh qua đêm Gạn lấy tủa Để tủa ngoài không khí cho hay hơi hết dung môi, hòa lại trong 20ml methanol, lọc, tráng giấy lọc bằng 10ml methanol Rót từ từ dịch methanol vào 300ml hỗn hợp aceton – diethylether (4:1), để lạnh qua đêm Gạn lọc lấy tủa Sấy tủa trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 600C đến khối lượng không đổi Cân và tính hàm lượng chất tủa trong aceton-diethyl ether (4:1) theo công thức sau:

a × 10000 X(%) =

P × (100 – W) Trong đó: X: Hàm lượng chất tủa trong aceton-diethyl ether (4:1) trong dược liệu (%)

P: Khối lượng bột dược liệu đã cân để định lượng (g)

a: Khối lượng của tủa (g)

W: Độ ẩm của dược liệu (%)

Định lượng phân đoạn chất tủa trong hỗn hợp aceton - diethylether (4:1) trong cao bán thành phẩm:

Cân chính xác khoảng 0,3g chế phẩm cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 40ml methanol, lắc siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc vào cốc có mỏ có dung tích 100ml, rửa bình nón và giấy lọc bằng 10ml methanol Gộp dịch rửa vào cốc có

mỏ trên Cô dịch chiết methanol trên cách thủy đến còn khoảng 5ml, để nguội Thêm 50ml hỗn hợp aceton- diethylether (4:1), khuấy đều, để lắng qua đêm ở nhiệt

độ 2-30C Lọc nhanh tủa vào giấy lọc (đã sấy ở 1050C trong 3 giờ và cân xác định

khối lượng) Tráng cốc và tủa bằng 10ml hỗn hợp aceton- diethylether (4:1) Sấy giấy và tủa ở 1050C trong 3 giờ, lấy ra để trong bình hút ẩm 15 phút, cân nhanh xác định khối lượng Hàm lượng các chất tủa trong hỗn hợp aceton - diethylether (4:1) được tính theo công thức:

a × 10000 X(%) =

P × (100 – W) Trong đó:

P: Khối lượng cao đã cân để định lượng (g)

a: Khối lượng của tủa (g)

để lắng qua đêm ở nhiệt độ 2-30C Lọc nhanh tủa vào giấy lọc (đã sấy ở 1050C trong 3 giờ và cân xác định khối lượng) Tráng cốc và tủa bằng 10ml hỗn hợp aceton- diethylether (4:1) Sấy giấy và tủa ở 1050C trong 3 giờ, lấy ra để trong bình hút ẩm 15 phút, cân nhanh xác định khối lượng

Hàm lượng các chất tủa trong hỗn hợp aceton- diethylether (4:1) trong mỗi viên được tính theo công thức:

a x MTBX(g/v) = -

P Trong đó:

a: Khối lượng tủa thu được (g)

MTB: Khối lượng trung bình viên đã loại bỏ lớp bao (g)

P: Khối lượng mẫu đem thử (g)

2.2.1.4 Phương pháp nghiên cứu chiết xuất bán thành phẩm

- Chiết xuất bài thuốc bằng hỗn hợp cồn – nước ở các tỷ lệ khác nhau Khảo sát nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ dung môi/dược liệu, phương pháp loại tạp

- Tiêu chí đánh giá và so sánh:

+ Hiệu suất chiết xuất + Tác dụng chống viêm cấp và tác dụng giảm đau trên chuột của các chế phẩm thu được

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý và độc tính

2.2.2.1 Mẫu thử

- Cao chữa thấp khớp của Cty CP Y Dược học dân tộc Hòa Bình

- Các mẫu chế phẩm cao chiết từ bài thuốc chữa viêm đa khớp dạng thấp

- Cao bán thành phẩm Viên chữa thấp khớp

Liều thử : Liều thử của các chế phẩm đều tính theo khối lượng dược liệu:

- Trên chuột nhắt: các liều tương đương 10g, 20g và 30g dược liệu/kg thể trọng/ngày

- Trên chuột cống: các liều tương đương 7g, 14g và 21g dược liệu/ kg thể trọng/ngày

- Trên thỏ: các liều tương đương 6g và 9g dược liệu/ kg thể trọng/ngày

Thuốc đối chiếu:

- Viên bao phim Voltarene 50® (Novartis Pharmaceutical Company) chứa

50 mg diclofenac sodium được cho uống ở liều 0,025 g/kg thể trọng chuột nhắt trắng

- Viên prednisolon (Đức), hàm lượng 5mg/viên, liều uống trên chuột cống trắng là 5mg/kg/ngày

- Paracetamol, liều uống 150mg/kg thể trọng thỏ

2.2.2.2 Động vật nghiên cứu

- Chuột nhắt trắng đực và cái (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng

lượng trung bình 22 g ± 2 g) được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang và Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội

- Chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai giống, trọng lượng 90-130g, khoẻ mạnh, do Trại chăn nuôi Học viện Quân y cung cấp

- Thỏ trưởng thành, cả hai giống, trọng lượng từ 1,8 – 2,2 kg, là những thỏ khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

Tiêm dưới da 0,05 ml carragenin 1% (pha trong dung dịch sinh lý NaCl 0,9% và pha trước khi dùng 30 phút) vào gan bàn chân phải sau của chuột nhắt trắng Chân trái không tiêm làm chân chứng

Chuột nhắt được cho uống nước cất (lô chứng) hoặc mẫu thử nghiệm (lô thử) hoặc thuốc đối chiếu diclofenac (Voltarene 50®, lô đối chiếu) 30 phút sau khi tiêm carragenin Để đánh giá mức độ viêm, đo độ phù bàn chân chuột vào các thời điểm sau khi tiêm carragenin 2, 3, 4 giờ Độ phù chân chuột được xác định bằng

đo thể tích chân chuột

Mức độ tăng thể tích chân chuột được tính theo công thức:

X% = [(Vphải – Vtrái )/ Vtrái ] x 100 Trong đó: X% là tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột; Vtrái là thể tích bàn chân trái không tiêm carragenin; và Vphải là thể tích bàn chân phải tiêm carragenin

Tác dụng ức chế phù được biểu thị bằng tỷ lệ % giảm mức độ tăng thể tích bàn chân chuột lô thử so với mức độ tăng của lô chứng và được tính theo công thức:

Y% = [(X%chứng – X%thử ) / X%chứng ] x 100Trong đó: Y% là tỷ lệ giảm mức độ phù bàn chân chuột; X%chứng là tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột lô chứng; X%thử là tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột lô thử thuốc

2.2.2.4 Phương pháp thử tác dụng chống viêm mạn

Tác dụng chống viêm mạn được thử trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amian [34], [53]

Thí nghiệm được thực hiện trên chuột cống trắng trưởng thành Chuẩn bị các viên sợi amian có đường kính khoảng 2mm, trọng lượng 30 ± 0,01mg, vê tròn và sấy tiệt trùng ở 1200C trong 2h Chuột được gây mê bằng ether Cạo sạch lông vùng lưng, dùng mũi kéo bấm một lỗ nhỏ ở da, luồn hai mũi kéo qua lỗ thủng, tách

kỹ để da không còn dính với cơ rồi cấy viên sợi amian vào nơi đã bóc tách da Khâu vết mổ và rắc thuốc bột sulfamid để tiệt trùng

Chuột được cho uống nước cất (lô chứng) hoặc mẫu thử nghiệm (lô thử) hoặc thuốc đối chiếu prednisolon trong 5 ngày liên tục, lần đầu ngay sau khi cấy viên sợi amian Sau khi uống thuốc liều cuối cùng được 5h, giết chuột bằng cloroform, bóc tách khối u và cân trọng lượng khối u bằng cân phân tích

Kết quả tác dụng chống viêm mạn được biểu thị bằng tỷ lệ % độ giảm trọng lượng u hạt ở lô thử thuốc so với lô chứng Công thức tính như sau:

X% = [(Mc – Mt )/ Mc ] x 100

Trong đó:

X% : Tỷ lệ % giảm trọng lượng u hạt so với chứng

Mc : Trọng lượng u hạt trung bình của lô chứng

Mt : Trọng lượng u hạt trung bình của lô thử thuốc

2.2.2.4 Phương pháp thử tác dụng giảm đau

2.2.2.4.1 Thực nghiệm gây đau xoắn bụng bằng acid acetic [10], [34], [69]:

Chuột nhắt trắng được cho uống nước cất (lô chứng) hoặc mẫu thử nghiệm (lô thử) hoặc thuốc đối chiếu diclofenac (Voltarene 50 ®, lô đối chiếu) Một giờ sau, tiêm phúc mô acid acetic 0,6% Sau 10 phút, ghi nhận số lần xoắn bụng do đau của động vật thử trong vòng 20 phút

Tác dụng giảm đau được biểu thị bằng tỷ lệ % giảm số lần xoắn bụng ở các chuột lô thử so với lô chứng và được tính theo công thức:

Y% = [(Số lần xoắn bụng chứng – Số lần xoắn bụng thử ) / Số lần xoắn bụng chứng ] x

Chuột được đặt trong máy gây đau bằng tấm nóng có nhiệt độ cố định của sàn máy là 55,50C Máy sẽ ghi lại thời gian từ khi chuột được đặt vào sàn máy đến khi chuột không chịu được nhiệt độ nóng ở gan bàn chân, khi đó sẽ xuất hiện hiện tượng chuột vẩy chân hoặc chuột nhẩy lên So sánh thời gian chuột chịu nóng trước khi uống thuốc với thời điểm sau khi uống thuốc 30phút, 60phút và 90phút

và với lô chứng không uống thuốc

Tiếp theo: Chia chuột thí nghiệm thành các lô:

- Lô chuột chứng trắng: không uống thuốc

- Các lô chuột thử mẫu nghiên cứu

Chuột được uống thuốc thử với các liều tương ứng Đo thời gian chịu nóng của từng chuột vào các thời điểm sau khi uống thuốc 30 phút, 60 phút và 90 phút:

T1 = Thời gian chịu nóng sau 30 phút uống thuốc

T2 = Thời gian chịu nóng sau 60 phút uống thuốc

T3 = Thời gian chịu nóng sau 90 phút uống thuốc

Chế phẩm thử được đánh giá là có tác dụng giảm đau có ý nghĩa khi chuột thử thuốc có thời gian phản ứng tăng ít nhất gấp 2 lần so với thời gian phản ứng trung bình của lô chứng

Cố định từng thỏ trên bàn khoảng 30 phút, tiếp theo, đo nhiệt độ thỏ theo đường hậu môn bằng máy đo nhiệt độ điện tử, mỗi con đo 2 lần, mỗi lần cách nhau

30 phút để lấy nhiệt độ trung bình của thỏ trước khi gây sốt, nếu 2 lần đo mà số liệu không tương đương nhau thì đo lại lần thứ 3

Cho các lô thỏ thử bài thuốc uống với liều tương ứng; lô tham chiếu uống paracetamol với liều 150mg/kg, đồng thời lô thỏ chứng uống nước với cùng thể tích của lô thử thuốc

Sau 30 phút cho thỏ uống, gây sốt cho tất cả các lô thỏ bằng cách tiêm theo đường tĩnh mạch tai dung dịch pyrogen (10mg pyrogen/100ml NaCl 0,9%) với liều 0,5ml/1kg thỏ

Đo nhiệt độ thỏ vào các thời điểm 60 phút; 90 phút và 120 phút sau khi gây sốt So sánh mức tăng nhiệt độ của các lô thử thuốc với lô chứng ở các thời điểm tương ứng Tác dụng hạ sốt của thuốc được biểu thị bằng % giảm mức tăng nhiệt

độ ở lô thử thuốc so với lô chứng

2.2.2.6 Phương pháp thử độc tính cấp [7], [11], [104]

Mô tả phương pháp:

Chuột nhắt trắng có trọng lượng 18-22g, khoẻ mạnh, không phân biệt giống, được chia ngẫu nhiên thành các lô Để chuột nhịn đói 12 giờ trước khi thí nghiệm Dùng kim đầu tù cho chuột uống thuốc theo mức liều quy định cho từng

lô, mỗi lần không quá 0,2ml/10g thể trọng, với các mức liều tăng dần Tìm liều tối

đa mà không có chuột nào chết và liều tối thiểu để 100% chuột thí nghiệm chết trong 1 lô Giữa 2 liều nói trên, thử từ 2 đến 3 liều trung gian Theo dõi tình trạng chung, hoạt động tự nhiên, hô hấp và tiêu hoá của chuột liên tục trong 72h sau dùng thuốc Đếm số chuột chết ở từng lô để xác định liều thấp nhất gây chết 100%

và liều cao nhất gây chết 0% Chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương đại thể Tính LD50 theo phương pháp của Karber-Behrens

Công thức tính: LD 50 = LD 100 - [∑ (d × z)] × 1/n

Trong đó: d là hiệu số liều của 2 liều kế tiếp

z là số chuột chết trung bình giữa 2 liều kế tiếp

n là số chuột trong 1 lô thí nghiệm

2.2.2.7 Phương pháp thử độc tính bán trường diễn [34]

+ Nguyên vật liệu:

- Động vật thí nghiệm: Thỏ trưởng thành, cả thỏ đực và thỏ cái, trọng lượng

từ 1,8 – 2,2 kg, là những thỏ khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

- Mẫu thử: Cao bán thành phẩm chiết xuất từ bài thuốc chữa viêm đa khớp

- Các bộ kít định lượng GOT (ASAT), GPT (ALAT), Ure, Creatinin, Protein toàn phần, Bilirubin toàn phần do hãng Human cung cấp

- Các bộ kít định lượng Hồng cầu, Bạch cầu, Hemoglobin, do hãng Sysmex cung cấp

- Máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout – Italia

- Máy phân tích máu tự động Sysmex KX 21 – Mỹ

+ Phương pháp nghiên cứu:

Sử dụng 2 lô thỏ thí nghiệm:

- 1 lô đối chứng sinh lý

- 1 lô thử, uống cao chiết từ bài thuốc chữa thấp khớp với liều gấp 10 lần liều dự định sử dụng trên lâm sàng (tương đương 20g dược liệu/kg thể trọng thỏ/ ngày x 30 ngày)

Mỗi ngày cho thỏ các lô thử thuốc uống thuốc và thỏ lô chứng uống nước

đã đun sôi để nguội 1 lần, kéo dài 30 ngày liên tiếp

Các chỉ số theo dõi:

Theo dõi chức năng gan:

+ Định lượng GOT (ASAT) và GPT (ALAT) trong máu theo phương pháp Reitman – Frankel dùng cơ chất L- Aspartat và L - Alanine

+ Định lượng protein toàn phần trong máu bằng phương pháp Biuret

+ Định lượng bilirubin trong máu bằng phương pháp so màu

Theo dõi chức năng thận:

+ Định lượng creatinin trong máu bằng phương pháp Jaffe

+ Định lượng ure trong máu bằng phương pháp Rappoport dùng men urease

Theo dõi chức năng tạo máu:

+ Đếm số lượng hồng cầu, bạch cầu, huyết sắc tố trên máy phân tích máu tự động

Xét nghiệm mô học: