BÔ Y TÉ TRlTÔNG DAI HOC DÜ0C HÀ NÔI m N G U Y Ê N ANH LY NGHIÊN CtJU ÂNH HUÔNG CÜA NHIÊT DÔ TÔI THÀNH PHAN HÔA HOC VÀ TAC DUNG DlfOC • LŸ CÜA VITHUOC HOÀNG LIÊN (KHÔA LUÂN TÔT NGHIÊP DLiüc SÏKHO 1990 - 2003) Nguèi huomg dân: TS. PHÙNG HÔA BÏNH DS. NGUYÊN THE MINH Nai thirc hiên: Bô mon Diïçfc hoc co truyên Phong Vi sinh - Bô mon Công nghiêp duac Phong nghiên cuu trung tâm Phong Duac lÿ Viên Duoc lieu Thôi gian thuc hiên: 3/2003 - 5/2003 • LÙl CfiM ON! Trong quâ trinh thuc hiên dê tài này, em dâ nhân duoc su nhiêt tînh giüp do cüa câc thây cô giâo. Dâc b iê t, nhô cô su hctng dân tân tînh, chu dâo cüa thây: TS. Phùng Hôa Binh , em dâ hoàn thành dê tài này . Em xin bày tô long kmh trong và biêt on sâu sàc tcti thây . Em xin chân thành câm on câc thây cô giâo trong bô mon Duoc co truyên, DS. Nguyén Thé Minh, thây: TS Cao Van Thu bô môn Công nghiêp Duoc - phong Vi sinh, thây: TS . Dô Ngoc Thanh, TS . Nguyên Dâng Hoà phông nghiên curu Trung tâm dâ tao diêu kiên giüp dô em hoàn thành dê tài này. Hà Nôi, thâng 5 nam 2003 Sinh viên Nguyên Anh Ly. MUC LUC Trang DAT VAN DE 1 PHAN 1: TONG QUAN 2 1.1- Dâc diêm thuc vât 2 1.2- Thành phân hoâ hoc 3 1.3- Tac dung 5 1.4- Công dung 7 V 1.5- Dinh lirçmg 8 1.6- Che bien 9 1.6.1 - Mue dîch che bien thuoc co truyên 9 1.6.2 - Câc phifcfng phâp che bien thuoc co truyên 9 1.6.3 - Câc phuong phâp che bien Hoàng liên 11 1.7- Nhân xét chung PHAN 2: THUC NGHIÊM VÀ KÊT QU 2.1 - Nguyên lieu, phuong tien và phuong phâp nghiên cihi 11 12 12 2.1.1 - Doi ttfçfng nghiên cüu 12 2.1.2 - Thiet bi, hoâ chat, sue vât thî nghiêm 12 2.1.3 - Phvtcfng phâp nghiên cûu 12 2.2 - Két quâ thuc nghiêm và nhân xét 16 2.2.1 - Théo doi ânh huông cüa nhiêt dô dén si/ doi màu cüa vi thuoc. 2.2.2 - Nghiên cüu su bien doi alcaloid ô câc MNC 16 16 2.2.3 - Nghiên cûu mot so tâc dung sinh hoc 2.3 - Bàn luân 31 36 2.3.1 - Phicong phâp dinh hcçfng alcaloid trong Hoàng lien 36 2.3.2 - Ânh huông nhiêt dô tâi thành phàn hoâ hoc 37 2.2.3 - Tâc dung sinh hoc 37 PHAN 3: KÉT LUÂN VÀ DE XUAT 3.1 - Ket luân 39 39 3.1.1 -Nhiêt dô ânh huông tâi màu sac vi thuô'c 39 3.1.2-Thành phàn hoâ hoc 39 3.1.3-Tâc 40 dung sinh hoc 3.2 - Mot vài ÿ kien de xuâ't 40 CAC KŸ HIÊU VIÉT TÂT. Ber : Berberin DL : Dirac lieu g(mg)/KgT.T : g(mg) duoc liêu/Kg thé trong suc vât thf nghiêm HPLC : Sâc kÿ long hiêu nâng cao MeOH : Methanol MNC : Mâu nghiên ciïu Pal : Palmatin SKLM : Sâc kÿ lorp mông t°: Nhiêt dô t: Thài gian TT: Thuoc thü DÂT VAN DE Vi thuôc Hoàng liên chân gà (Rhizoma Coptidis) là thân rë cüa nhiêu loài Hoàng liên thuôc chi Coptis ho Hoàng liên (Ranunculaceae). Thành phân hôa hoc chinh cüa vi thuôc Hoàng liên là alcaloid, trong dô chû yéu là Ber và Pal. Hoàng liên cô vi dàng tmh hàn, cô tâc dung khâng khuan [3, 7, 12], chông viêm [22], lai mât [1], ha huyét âp [3, 6]. Théo y hoc co truyên, truôc khi sü dung, câc vi thuôc duçfc ché bién nhàm tâng tâc dung diêu tri giâm tâc dung không mong muôn, tâng dô an toàn. Vi thuôc Hoàng liên duçfc ché bién theo nhiêu phuofng phâp khâc nhau, trong dô cô phuong phâp sao. Phuong phâp sao thuc chat là su tâc dông cüa nhiêt dô dén vi thuôc. Câc phuong phâp sao khâc nhau thi nhiêt dô tâc dông khâc nhau làm cho thành phân hôa hoc sê bién doi khâc nhau dân toi tâc dung sinh hoc khâc nhau. Vi vây, chüng tôi nghiên cüu dê tài này vôi mue dîch tîm hiëu su ânh huông cüa nhiêt dô (â mûc dô nhiêt dô khâc nhau trong khoâng thdi gian khâc nhau) dén Alcaloid cüa vi thuôc Hoàng liên Nôi dung nghiên cüu gôm: + Dinh tïnh Alcaloid bàng phân ûng voi thuôc thü chung. + Phân tich su bién doi Alcaloid bàng SKLM + Dinh luong Berberin, Palmatin. + Thü mot sô tâc dung sinh hoc: khâng khuan, an thân. 1 PHAN 1: TÔNG QUAN 1.1- DÂC DIÊM THÜC VÂT: • • • C6 nhiêu loài Hoàng liên chân gà: Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis teetoides C.Y. Cheng, Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao. Ho Hoàng liên (Ranunculaceae). Hoàng liên là cây thâo sô'ng nhiêu nâm cao chùng 1 5 - 3 5 cm, thân moc thang phfa trên phân nhânh, co nhiêu rê nhô. La moc so le tir thân rê lên, cuong la dài 6 - 12 cm. Phién la gôm 3 - 5 la chét, môi la chét lai chia thành nhiêu thùy mép cô nhüng rang ara [3, 2, 6, 7, 9, 12]. Cây thuông ra hoa vào mùa xuân. Hoa co 5 la dài màu vàng lue, cânh hoa hïnh müi mâc dài bàng 1/2 la dài, co nhiêu nhi dài bàng cânh hoa. Quâ dai co cuong trong chtra 7 - 8 hat màu xâm. Hoàng liên thucmg moc à vùng nui cao 1500 - 2500 m. Cây ua noi mât am thâ'p nhiêt dô 20 - 25 °C, dât dê thâo nuôc [3, 7, 9]. Hoàng liên trong bàng hat, thucmg trong vào mùa xuân [2, 7]. Thu hâi Hoàng liên vào cuôi mùa thu dàu mùa dông thâng 9 - 1 0 [3, 7, 12, 17, 24], néu là cây trong thï thu hâi sau 4 - 5 nâm. Hoàng liên moc hoang và trong nhiêu à Trung Quôc (TûXuyên, Hô Bac). Ô Viêt Nam, Hoàng liên moc hoang trên dây nui Hoàng liên Son (Sapa cô Coptis quinquesecta Wang, ô Quang Ba- Hà Giang cô Coptis chinensis Franch) [3,2,12]. - Bô phân dùng: Bô phân dùng cüa Hoàng liên là thân rê, dô là nhüng mâu cong queo dài tù 3 cm trô lên, rông 0,2 - 0,5 cm. Cô nhiêu dot khüc khuÿu, phân nhânh nhiêu giông hînh chân gà nên côn goi là Hoàng liên chân gà. Mât ngoài thân rê màu vàng nâu côn vêt tich cûa rê phu và cuô'ng lâ. The chat ctfng rân, bê ngang không phâng, phàn gô màu vàng tuai, phân vô và ruôt màu vàng dô [3, 24], không mùi, vi rat dâng, ton tai lâu trong miêng. 2 9 X Anh 1.1 : Mâu Hoàng liên lây tai SaPa Ghi chu: 1: Toàn cây 2: Hoa 3:Thân ré (MNC) 4: Thân rê 1.2- THÀNH PHAN HÔA HOC: Thành phàn hoa hoc chmh cüa thân rê là Alcaloid (5 -8 %), trong do chü yéu là Berberin, Palmatin, ngoài ra là Worenin, Coptisin, Jatrorizin, Magnoflorin, Columbamin [3,6, 9, 12]. Hàm lirong Alcaloid trong cây thay doi theo mùa và thcfi kÿ sinh truang cüa cây. Hàm luong Ber trong thân rê cao nhât vào thâng 9 -1 0 , thâp nhât vào thofi kÿ cây ra hoa. Trong la cüng cô Ber, à la già hàm luçmg Ber cao nhât vào thâng 7 10 khoâng 2,5 - 2,8 % [3, 20]. Ô hoa và hat cüng chüa 1 luong nhô Ber: hoa 0,56 %, hat 0,23 %. Ngoài Alcaloid trong thân rê Hoàng liên côn cô tinh bot, acid hùu co nhu acid ferulic [3]. 3 Công thuc eau tao cüa mot so Alcaloid trong Hoàng liên: Jatrorizin = - H r 2= - c h 3 R {= Berberin Ri + ~ ■CH2- Palmatin R, +R2 = - CH 3 Coptisin R - - H Worenin R = - CH3 CH 3O CH - COOH HO HO Acid ferulic CH 3 O M a g n o flo rin Mot so tînh chât vât lÿ cüa câc Alcaloid tlO, 11, 15, 21, 26Î duoc ghi à bàng 1.1 Bàng 1.1: Mot sô tmh chat vât lÿ cüa câc Alcaloid Alcaloid Nhiêt dô nông chây Cire dai hâp thu UV X max (nm) Ber dang base 144 °C 354, 278, 218 Ber dang nitrat ( N+) 205 °C 350, 264, 228 Ber clorid Pal dang nitrat ( N+) 427, 349, 266, 230 192 °C Pal clorid 340, 270, 224 430,348,267,227 D- tetrahydro Pal 142 °C L- tetrahydro Pal 147 °C DL- tetrahydro Pal 148 °C 4 335, 287 1.3- TAC DUNG: ♦♦♦ Tâc dung khâng khudn: Hoàng liên cô tâc dung khâng khuân manh dâc biêt là trên vi khuân Gram (-). Trong dô cô nhiêu vi khuân duông ruôt. Nuôc sâc Hoàng liên cô tâc dung rïc ché mot sô' vi khuân: Shigellashiga, Shigella dysenteriae, Vitrio cholerae, Streptococus virideus Bacilhis proteus, Bacillus typhi, Bacillus pyocyaneus, Staphylococus aureus... [3,12]. Y hoc cë truyên thucmg dùng Hoàng liên két hop vôi hoàng bâ, hoàng càm, chi tü trong bài Hoàng liên giâi dôc thang dê giâi dôc li truc khuân, tiêu chây cap, viêm màng nâo [4, 16]. Tâc dung khâng khuân cüa Hoàng liên theo co ché: Ber ûc ché sinh tong hop ARN, ADN và protein cüa té bào vi khuân [ 20 ,22 ]. Ngoài ra Ber côn tàng cucmg chiïc nàng thuc bào vi khuân cüa câc té bào miên dich bach câu [4]. Mot sô vi khuân Staphylococus aureus, Streptococus hemolyticus dê khâng thuoc vôi Ber sulfat nhung vôi bài Hoàng liên giâi dôc thang lai khô sinh ra tînh chat khâng thuôc [4, 20]. ❖ Tâc dung chong viêm: Do Ber cô tâc dung \xc ché giâi phông acid arachidonic tir màng té bào, giâm luong prostaglandin (PGI2) trong huyét tUdng [22], ûc ché hïnh thành u hat trên suc vât thuc nghiêm. ❖ Tâc dung trên tim: Ber làm giâm su co that cüa tim, làm giâm nhip tim trên chuôt thuc nghiêm [22]. Fang cho ràng vôi liêu lmg/kg trên mèo thî nghiêm, Ber làm giâm co co tâm thât. Ber cô tâc dung chông loan nhip tim, duoc xép vào nhôm thuôc dô'i khâng canh tranh vôi hê a , , a 2 adrenergic [20]. *X* Tâc dung ha huyét âp : 5 Do làm dân mach [3,6] thuông dùng dé phong ngùa xü vûa dông mach, do Ber làm giâm luçmg cholesterol trong huyét tuong [20]. ♦♦♦ Vôi dudng tiêu hoa: Hoàng liên vôi liêu nhô kich thich giûp su tiêu hoa tàng co bôp da dày, ruôt, chûa viêm da dày [3,6,12]. ♦♦♦ Tâc dung khâng virût cûm [4,6,20] : Nuôc sàc Hoàng liên vôi nông dô 50% nghiên cûu trên phôi gà cô tâc dung ûc chê su phât triën cua virût cüm chung PR8, 56S8 P.M [20]. ❖ Ba Protoberberin alcaloid tù dich chiét Hoàng liên cô tâc dung ûc ché monoamino oxydase (MAO), riêng Jatrorrhizin ûc chê' không canh tranh câ MAOA và MAOB (ô ti lap thé nâo chuôt công trâng) vôi giâ tri IC50 là 4pM và 62 (J.M. Côn Ber chî ûc ché canh tranh vôi MAOA vôi IC50 là 126 p,M trong khi Pal vôi IC5() = 200jiM cüng không ûc ché 2 enzim này [23]. ❖ Nhüng hop chat protoBer làm giâm hàm luçmg seretonin vôi IC50 cüa Ber là 3,0(xM cüa Pal là 16,5pM. Câc hop chat protoBer vôi liêu toi da 20(j,M không dôc hai vôi té bào P815 két quâ là Ber và Pal ûc ché hoat tmh enzim tryptophan hydroxylase do dô làm giâm hàm luong seretonin à té bào P8i5 [13]. ♦♦♦ Ber ûc ché su két tâp tiëu eau, làm giâm luong Thromboxan (TXB2), do dô cô tâc dung chông thiéu mâu nâo eue bô [22]. ♦> Dich chiét tù Hoàng liên cô tâc dung ûc ché su phât triën cüa té bào ung thu, Hoàng liên dâ ûc ché su phât triën khôi u và su hinh thành trong quàn thë dông té bào ung thu da dày, ruôt két, vü, phu thuôc vào liêu và thôi gian dùng. Su phât triën cüa té bào bi ûc ché hoàn toàn sau 3 ngày chiu tâc dung cüa thuôc à 10|ag/ml duoc thâo. Tâc dung ûc ché phât triën khôi u cüa Hoàng liên là do giân tiép ûc ché hoat tmh cüa CDC2 kinase. Tâc dung này nôi bât lên nhu môt mue tiêu diêu tri ung thu bàng hoa liêu phâp [18]. Thuc nghiêm tiê'n hành trên té bào u thân kinh dêm cüa chuôt, Chen cho ràng Ber ûc ché sinh t6ng hop ARN, ADN và protein và làm giâm nàng luong lase dë tiêu diêt té bào u thân kinh dêm [22]. 6 ♦♦♦ Ber co tâc dung vôi dan bào (leihsmania), diêt kÿ sinh trùng sot rét [2 0 , 21] ❖ Pal rïc ché epinephrine, co tâc dung khâng khuan, hoat hoâ acetylcholin esterase, hoat hoâ câ enzim anticholin esterase [21] ❖ Dôc tmh cüa Hoàng liên :Ber co LD50 =25 mg/Kg T .T , LD50 cüa hoàng liên sông = 6,875 ± 0,904 g/Kg T.T 0 ]. 1.4- CÔNG DUNG: *Theo y hoc co truyên, Hoàng liên cô tâc dung thanh nhiêt tâo thâp, thanh nhiêt tâ hôa [2,4]. *Hoàng liên cô vi dàng, tmh hàn, quy vào nàm kinh: tâm, tÿ, vi, can, dai tràng [4, 5 ,7, 20] * Công nâng chü tri: ■ Thanh nhiêt tâo thâ'p:diêu tri li, viêm ruôt. Hoàng liên cô tmh khâng khuan manh phé rông nên dùng dé tri li amip, li truc khuan [3,4, 24]. ■ Thanh tâm trùphiên: dùng dë diêu tri chùïïg tâm hôa thinh gây ra hôi hôp mât ngü, bon chôn, niêm mac luôi miêng phông dôp [4,24]. ■ - Thanh can sang mât: tri chiïng can hôa gây ra dau mât dô , sot cao xuât huyét hoàng dân , diên cuông phâ phâch ( can hoâ vuang ) [2, 7 ]. ■ Chi huyêt: dùng cho truông hap huyét nhiêt dân dén chây mâu cam, non ra mâu [4, 6]. ■ Gidi dôc ha hôa: diêu tri ung nhot dôc bên trong, sot cao mê sâng phât cuông [4, 6]. Trong dân gian thuàng dùng dich nuôc sàc Hoàng liên dë tri chûng dau mat dô, dùng ngoài dë tri nam ngoài da, eczema, viêm tai giûa cô mü [3,24] bôi ngoài diêu tri trê em tua luôi ,sung luôi ,viêm miêng , lô môi [7]. Can chu y; Hoàng liên vi rat dàng không nên dùng liêu cao kéo dài dë gây non, liêt thân kinh vi giâc, ton thuang dich vi, ân không biét ngon [4]. 7 1.5- DINH LÜONG ALCALOID: De dinh luçmg Alcaloid trong Hoàng liên cô nhiêu phuong phâp: • Dinh luong bàng phiïüng phâp cân [3,5,11 ] Nguyên tâc: Chiét alcaloid trong duoc lieu bàng côn, két tüa Ber bàng dung dich Kl, thêm aceton, kiêm hoa bàng amoniac de tao tüa phüc. Loc lày tüa sày khô dem cân. lg tüa tuong duong 898,2 mg Berberin. lml dich loc tuong ûng 0,0272 mg Berberin. Duoc diën Viêt Nam I quy djnh duoc lieu phâi cô ft nhât 4% Berberin. • Phtfcfng phâp acid base [3,11] Nguyên tac: Chiét alcaloid trong duoc lieu duôi dang base bàng dung môi hüu co ft phân eue, acid hoa dich chiét chuyën alcaloid sang dang muôi tan duoc trong nuôc. Gan lây lôp nuôc, kiêm hoa bàng NaOH, làc vôi dung môi hüu co ft phân eue de chuyën hét alcaloid base sang pha dung môi. Thêm chmh xâc mot luong acid HC1. Chuân dô HC1 du bàng NaOH, chî thi dô Methyl, tù dô trnh luong alcaloid. • Phtfong phâp dùng sac kÿ chê'hoâ de tâch roi do quang [11,24] Nguyên tâc: dùng SKLM dë tâch riêng câc alcaloid khôi hôn hop, cao lày riêng câc vét, phân hâp phu bàng dung môi thich hop, do quang ô buôc sông thïch hop. Mât dô quang tî le vôi nông dô dung dich alcaloid. • Phtfcfng phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLC) [15] Nguyên tac: Dich chiét alcaloid duoc tiêm vào côt sâc kÿ pha dông duoc bom liên tue qua côt tâch riêng câc alcaloid khôi hôn hop. Môi alcaloid khi ra khôi côt duoc detector UV nhân biét, biéu hiên ra bàng 1 pic. Diên tich pic tuong ung vôi nông dô alcaloid trong dung dich tiêm vào côt. 8 1.6. CHÉ BIEN: 1.6.1. Mue dîch che bién thuôc co truyên: > Loai bô nhüng thành phân không can thiét làm vi thuôc tôt hon lên. Giâm dôc tmh cüa vi thuôc vî du Ban ha ngâm trong nirôc vôi giâm hét vi ngüa, ché phu tu thành bach phu diêm phu dë giâm dôc tmh cüa aconitin [4, 12 , 14] > Giâm tâc dung không mong muôn, thay doi tâc dung cüa thuôc, vî du: Hà thü ô ché vôi dàu den dë giâm anthranoid, giâm tâc dung nhuân tay [4, 12]. > Giüp bâo quân thuôc tôt hon: làm on dinh duoc lieu trânh nam môc, vî du Hoè hoa trong diêu kiên am, men rutinase phân huÿ rutin thành queexetin làm hoè bi xâm di [4, 12]. > Làm thay doi tmh vi quy kinh cüa thuôc tù dô làm thay doi tâc dung cüa thuôc, vî du: Sinh dia vi dang tmh hàn, tâc dung thanh nhiêt luong huyét, sau khi ché vôi sa nhân, gùng, ruou duôi tâc dung cüa nhiêt trü thành thuc dia vi ngot tînh ôn cô tâc dung bo huyét ; hoàng kÿ trîch mât tàng quy kinh tÿ , tâng tâc dung bo khî [4, 7, 12]. > Làm tâng tâc dung cüa thuôc do làm giâm dô bên co hoc, tâng khâ nâng giâi phông hoat chat, làm mât mot sô thành phân không can thiét, sinh ra mot sô thành phân moi cô tâc dung diêu tri bênh. Vî du thâo quyét minh vi sao cô tâc dung nhuàn tây , sao vàng cô tâc dung nhuân ha, ha âp, sao chây cô tâc dung an thân [4] 1.6.2. Câc phuong phâp ché bién thuoc co truyên: Cô ba phuong phâp co bân ché bién thuôc co truyên: hoâ ché, thuÿ ché, thuÿ hoâ hop ché [4, 12]. ♦> Hoâ che: là phuong phâp ché bién chî dùng lüa, nhàm mue dîch: - Giâm dôc tînh, giâm tâc dung quâ manh cüa vi thuôc. - On dinh hoat chât trong vi thuôc. - Giâm dô bên co hoc cüa vi thuôc. Câc phuong phâp hoâ ché duoc ghi à bâng 1.2 9 Bàng 1.2: câc phuong phâp hoâ ché. Câc phirang phâp hoâ che Sao qua Sao truc tiép (không cô phu liêu) Sao vàng Sao vàng chây canh Sao vàng ha thô Nhiêt dô (°C) ' Màu sac vi thuôc 50-80 Màu cüa duac lieu sông Màu vàng 140-180 Màu vàng, canh màu den chây Giâm bot mùi vi khô chiu 100 -140 Vàng Cân bàng âm dueng cho vi thuoc 180 - 240 Sao chây 180-240 Sao câch cât 200 - 250 Sao Sao câch câm Sao câch hoat thach hoac van câp Làm khô và thofm thuoc trânh moi mot, on dinh hoat chat. 100 -140 Sao den (hâc sao) Sao giân tiép (cô phu liêu) Mue dich Mat ngoài màu den, bên trong màu vàng Mât ngoài màu den, bên trong màu nâu den Dân thuoc vào kinh tÿ Tàng tâc dung tiêu thuc giâm tmh mânh liêt cüa vi thuôc Tàng tâc dung câm mâu Truyên nhiêt dô dông dèu vào vi thuôc. Tàng tâc dung kiên tÿ, giâm tmh khô tâo cüa vi thuôc Trânh két dmh thuôc 200 Nung Hàng nghin Ché sirang Hàng nghln Vô ca hoâ, phâ vô câu truc cüa thuôc Tinh ché thuôc cô nguôn khoâng vât, à nhiêt dô cao câc hoat chat thàng hoa tâch ra khôi tap Giâm bôi chat dàu trong vi thuôc, giâm tmh kich ufng cüa vi thuôc Làm chin, giâm tmh mânh liêt cüa vi thuôc Làm thay doi tmh chat vi thuôc loai trîr nuôc trong câu truc phân tu tàng khâ nàng hüt nuôc làm sàn se Lùi Nirâng Hoâ phi Mot so công trinh nghiên cuu vê ânh huông cüa nhiêt dô tôi thành phàn hoâ hoc cüa duoc liêu cho thày : ô mue t° < 80° C ( tuong duong phuong phâp sao qua cüa YHCT ) thành phàn hoâ hoc cüa vi thuôc ft thay dôi : diosgenin trong thân rê mot sô loài thuôc chi Dioscorea L . ft thay doi à mire t° 50-60°C[ 10]. Ô mûc t° cao (180 -200° C) tuong duong sao chây cüa YHCT thành phàn hoâ hoc thay doi rat lôn . 10 Tuÿ theo mue dich sir dung mà ta lua chon phuong phâp ché bién khâc nhau. 1.6.3. Câc phuong phâp ché bién Hoàng liên: • Hoàng liên dé sông dùng dé tâ tâm hoâ, tri chüng phât ban diên cuông phiên khât. • Hoàng liên trich ruçru sao qua tâc dung tâp trung à nüa nguôi phia trên, tri viêm mât, lô miêng luôi [20 , 24] • Hoàng liên trich nuôc gùng tâng tâc dung à trung tiêu dùng trong truông hop dày bung, buôn non, non do câm mao phong nhiêt [20 , 24] • Hoàng liên trich nuôc ngô thù du cô tâc dung thanh can, diêu hoà truông vi, chông non, o chua [24] • Hoàng liên tâm giâm tri can hu hoâ [1] • Hoàng liên sao vôi hoàng thé cô tâc dung tiêu thuc chûa bênh cam ô trê con. • Hoàng liên trich mât lçm tri can dôm thuc hoâ. Mot sô công trînh dâ nghiên cüu vê ché bién Hoàng liên cho thây: Hoàng liên trich gùng cô tâc dung loi mât, ha sot tôt hon Hoàng liên sông. Hoàng liên ché giâm cô tâc dung loi mât tôt hon câ Hoàng liên trich gùng [1] 1.7 NHÂN XÉT CHUNG: Viêc ché bién làm ânh huông râ't nhiêu tôi tfnh chat cûa vi thuoc, qua ché bién tâc dung cüa vi thuoc cüng thay doi. Do dô cân nàm chàc duoc quy luât cüa ché bién dé tao ra nhüng tâc dung diêu tri bênh theo y muôn chü quan. De tâng giâ tri su dung cüa vi thuoc cân lua chon nhüng phuong phâp ché bién phù hop. 11 PHAN 2: THÜC NGHIÊM VÀ KÊT QU 2.1- NGUYÊN LIÊU PHI/ÛNG TIÊN, PHI/ONG PHÂP NGHIÊN CÜU: 2.1.1 Doi ttrong nghiên cuti: Chüng tôi tien hành nghiên cüu trên thân rê cây Hoàng liên (Rhizoma Coptidis) thuôc chi Coptis ho Ranunculaceae. Mâu lây tai Sapa thâng 9/2002. 2.1.2 Thiét b i, hoâ chat ,suc vât thî nghiêm . - Tü sây: Memmert, SHELLAB - May xâc dinh dô âm Précisa HA60 (Thuy Sï) - Cân phân tîch - Bô Shoxhlet 150 ml - May sâc kÿ long (HPLC) Thermo Finnigan. - Dung eu thüy tinh. - Chat chuân: Ber clorid, Pal sulfat do Viên Duçfc lieu cap Rotundin do khoa Duoc Hoc viên Quân y cap - Bân mông Silicagel GF254Merck. Hôa chat dat tiêu chuân phân tich (P.A): Methanol, Buthanol, acid clorydric, acid acetic dàc, Natrilauryl sulfat, Kalidihydrophosphat - Chüng vi khuan do phông vi sinh, Bô mon công nghiêp duçfc cap. 2.1.3 Phirong phâp nghiên cuti: 2.1.3.1 Chê bien: - Sây câc mâu Hoàng liên à câc müc nhiêt dô khâc nhau (tù 100° C dén 220 °C ) trong khoâng thefi gian 10’, 20’, 30’. - Nhân xét câm quan trên co sô màu cüa câc mâu nghiên cüu. - So bô dânh giâ mâu cô nhiêt dô và thôi gian cho sân phâm tuong duong sao vàng, sao chây. 2.1.3.2 - Nghiên cüu su: bien doi thành phân hôa hoc * Chiê't xuâ't: chiét bàng acid loâng trong MeOH [15] 12 * Nguyên tâc: trong môi truông acid alcaloid trong duoc liêu chuyën sang dang muôi dê tan trong MeOH. Dùng MeOH de chiét alcaloid. * Dinh tinh câc mâu nghiên cüu: - Dinh tinh bàng phân ûng vôi TT chung Alcaloid: Mayer, Dragendorff, Bouchardat. - Dinh tinh bàng SKLM: so sânh thành phân Alcaloid cüa câc mâu sây vôi nhau, vôi mâu sông, vôi chat chuân Ber, Pal, Rotundin. Dânh giâ so bô su bien doi thành phàn hoa hoc. * Dinh luong Alcaloid: Dinh luong Ber và Pal bàng HPLC dâ duoc TS. Pham Thanh Kÿ, Trinh Vàn Lâu nghiên ctru [15]. * Nguyên tac: Dich chiét duoc liêu duoc tiêm vào côt sàc kÿ và duoc pha dông chay qua côt tâch thành câc Alcaloid riêng biêt. Môi Alcaloid ra khôi côt duoc detector UV nhàn biét, biëu hiên ra bàng môt pic. Diên tich pic tî le thuân vôi nông dô dung dich Alcaloid. * Tmh két quâ theo công thuc (1) X% cc.sTvc y = --------—7----- r—.100 mO.Sc VT.rn.(\-a) (1) X: hàm luong hoat chat (%) Cc: nông dô hoat chat dich chuân tiêm sàc kÿ (mg/ml) (Berberin , Palmatin) Vc: thë tfch tiêm mâu chuân (|j,l) VT: thë tich tiêm mâu thü (|j.l) V : thë tich dich chiét thu duoc (ml) Sc: diên tich pic chat chuân Sj'. diên tfch pic chat thü m: khôi luong duoc liêu chiét (g) a: hàm âm cüa duoc lieu (%) So sânh diên tich pic cüa Ber, Pal trong mâu thü vôi diên tich Ber, Pal trong mâu chuân tù dô suy ra hàm luong Ber, Pal trong duoc liêu theo công thüc (1). 13 2.3.2.4 - Thütâc dung sinh hoc: * Nguyên tac chon mâu:Trên co sa phân tich dinh tînh, dinh luong , chüng tôi chon mâu dé thü tâc dung sinh hoc : mâu sông, mâu cô su thay dôî nhiêu vê thành phân hoâ hoc , hàm luong Ber , Pal. * Tâc dung khâng khudn: dùng phuong phâp khuyêch tan trên môi truông thach [19]. Nguyên tac: Dua trên su khuyêch tân cüa dich thü vào môi truông thach, üc ché su phât triên cüa vi khuân chï thi, tao ra câc vông vô khuân cô duông kmh tî le vôi hoat lue khâng khuân cüa thuoc. Chî tiêu theo dôi: so sânh duông kînh vèng vô khuân cüa MNC vôi khâng sinh dôi chüng và cüa câc MNC vôi nhau. * Tâc dung an thân: Thü tâc dung hiêp dông vôi thuôc ngü barbituric [25] (Viên Duoc lieu dâ chînh lÿ ) . Nguyên tac: Chuôt duoc uông thuôc (cao long câc MNC) sau môt thôi gian, gây ngü bàng thiopentan. Tâc dung tàng cuông thôi gian ngü cüa chuôt duoc dânh giâ bàng su kéo dài thôi gian ngü ô lô dùng thuôc so vôi lô chüng ( chî dùng thiopentan ). Chî tiêu theo dôi: thôi gian ngü cüa chuôt ô tu thé nàm ngüa, dén khi chuôt lât mînh trô dây trên bon chân. So sânh thôi gian ngü cüa câc lô dùng thuôc vôi lô chüng và câc lô dùng thuôc vôi nhau. Két qua: duoc xü lÿ theo phuong phâp thông kê âp dung cho sinh, y hoc [8] ô nguông 5%. ■ Xü lÿ sai s6 thô : loai sai sô nghi ngô (b) ra khôi mâu n - Tînh : 1 X = 14 t = L ? L ztL (2) J n -1 So sânh t vôi ta n tra trong bàng + Néu t > ta n : so b là sai so thô , loai bô + Nëu t < ta n : so b không phâi sai s6 thô , giù la i. ■ Thôi gian ngü cüa chuôt duoc tmh theo công thuc: y/n Trong dô: X : khoâng tin cây X : trung bînh công thôi gian ngü cüa lô thü. S: dô lêch chuân: S = n(n-1) t0: thay doi tuÿ theo bâc tu do cüa mâu phu thuôc vào xâc suât p cüa phép tînh. à dây ta xü lÿ két quâ vôi p = 0,95 (95%) ■ Dë kiëm tra hai mâu thü cô thuc su khâc nhau cô ÿ nghîa thông kê không, phâi dùng chi tiêu kiëm dinh Test t, tînh theo công thuc: _ |AT, -X , s Jy1n] + - n2 Trong dô: X{ là trung bînh cüa mâu 1 cô n, con chuôt X 2 là trung bînh cüa mâu 2 cô n2 con chuôt S2C là phuong sai chung cüa hai mâu s, = «, +n2-2 15 x^: thofi gian ngü cüa chuôt à mâu 1 x2i: thôi gian ngü cüa chuôt à mâu 2 Giâ tri t0 duorc tra trong bâng Student vôi bac tu do chung cüa hai mâu là: itj + n2 - 2. > Néu: t > t0 thi hai mâu khâc nhau cô ÿ nghîa thông kê à nguông 5%. t < t0thî hai mâu khâc nhau không cô ÿ nghîa thông kê à nguông 5%. 2.2 . K ÉT QUA THlTC NGHIÊM VÀ NHÂN XÉT. 2.2.1.Theo dôi ânh huông cüa nhiêt dô den sir doi màu cüa vi thuôc. Thân rë Hoàng liên duoc tâch nhô, bô rê con, rüa sach phüi khô thâi phiên chéo dây 2 - 4 mm, tan thành bôt thô. Sây bôt thô duoc liêu ô câc müc t° khâc nhau trong khoâng thôi gian khâc nhau (10 20 30 ’). Su dôi màu cüa vi thuôc duoc ghi à bâng 2.3. Bàng 2.3: Su chuyén màu cüa vi thuoc Hoàng liên khi sây â nhiêt dô khâc nhau. t sây t° (°C) Màu cüa câc MNC 10 100 110 130 140 150 160 180 200 220 Nhân xét: 20 Vàng Vàng Vàng Vàng dâm Vàng nâu Vàng nâu Nâu den Den 30 Vàng Vàng Vàng Vàng dâm Vàng nâu Nâu Den Den Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng dâm Nâu Nâu dâm Den Den > Câc mâu 100°C/30’, 110°C /10’, 20’, 30’, 130° / 10’, 20’, 30’, 140°C / 10 ; 20 ; màu câc mâu tuong duong nhau dêu cô màu vàng giông duoc liêu sông. > Câc mâu 140°C / 30 ; 150° / 10’, 20, 30 : câc mâu cô màu vàn dâm, tuong duong vôi sao vàng. > Câc mâu 200°C / 10’, 20, 30 ; 220°C / 10’, 20, 30 cô màu den tuong duong sao chây. 16 2.2.2. Nghiên cûu sir bien doi alcaloid à câc MNC 2.2.2.I. Chiét xuât alcaloid Dùng phuong phâp chiét bàng acid loâng trong MeOH [13] So dô chiét alcaloid duoc mô tâ à hînh 2.1 Hinh 2.1: Sa dô chiét xuât alcaloid trong câc MNC Cân chmh xâc 1 luong MNC theo bàng 2.7. Chiét bàng shoxhlet vôi dung môi MeOH: HCl ( 100 : 1), chiét tôi khi dich chiét không côn tua vôi thuôc thü Mayer, Dragendorff. Cât thu hôi MeOH trên nôi câch thuÿ. Cân alcaloid duoc chiét bàng nuôc nông 3 lân, môi lân vôi 20 ml. Loc. Cô câch thuÿ dich loc tôi can. Cân duoc hoà vào MeOH, chuyën vào binh dinh miic 50 ml, thêm MeOH tôi vach. Duoc dich alcaloid (A). 2.2.2.2. Dinh tînh alcaloid *t* Dinh tinh bàng thuoc thü chung: Chiét xuât alcaloid cüa câc MNC theo mue 2.2.2.1. Dich (A) duoc dinh tmh bàng câc TT: Mayer, Dragendorff, Bouchardat. Lây 1 ml dich (A) cho lân luot vào câc ông nghiêm, nhô vào môi ông nghiêm 1 - 2 giot TT. TT Mayer: phân rïng duong tmh (+) khi xuât hiên tüa trang. TT Dragendorff: phân ûng duong tmh (+) khi xuât hiên tüa vàng cam. TT Bouchardat: phân ûng duong tînh (+) khi xuât hiên tüa nâu. Kêï qua : tât câ câc MNC dêu cho phân üng duong tînh vôi TT chung alcaloid. ♦♦♦ Dinh tînh alcaloid bàng SKLM: So sânh mâu sô'ng vôi câc MNC (ô t° và thdi gian khâc nhau) cô chat chuân Ber, Pal, Rotundin. ■ Dich châm sâc kÿ: * MNC: Lây 1 ml dich (A) ô mue 2.2.2.1, cô can kiêm hoâ bàng amoniac 10%, chiét alcaloid base bàng cloroform, gan lây lôp cloroform, bôc hoi cloroform duoc cân. Hoâ tan cân trong 1 ml MeOH duoc dich châm MNC. * Alcaloid chuân: Ber clorid, Pal sulfat, rotundin; kiêm hôa bàng amoniac 10%, chiët alcaloid base bàng cloroform, bôc hoi cloroform dén cân. Hoà tan can trong 1 ml MeOH duoc dich châm chât chuân. ■ Chât hâp phu: silicagen GF254 (hâng Merck) kfch thuôc 10 cm x 10 cm, hoat hoâ ô 110°C trong 30 phüt ■ Hê dung môi khai triën: n Butanol: acid acetic bàng: nuôc [ 7 : 1 : 2 ] ■ Hiên màu: *Soi duôi ânh sang tir ngoai X = 366 nm *TT Dragendorff Két quâ phân tfch duoc ghi ô bàng 2.4 ,2.5, ânh 2 . 2, 23 Anh 2.2: Két quâ phân tich alcaloid trong câc MNC bàng SKLM ( hiên màu bàng TT Dragendorff) lU .V IIW ' \ ■M ' -m B P R S z 150° 160° 160° 160° 180° 180° 180° 200° 200° 200° 220° 220° 220° 30' 10’ 20’ 30’ 10’ 20’ 18 30’ 10’ 20’ 30’ 10’ 20’ 30’ *1 Anh 2.3: Két qua phân tich alcaloid trong câc MNC bàng SKLM ( hiên màu bàng ânh sâng tü ngoai  = 366 nm ) x 3 2 1 B o 100 30' o O 110 110 10’ 20’ O 110 30' O 130 10' O 130 20' O 130 30’ B P R 140° 140° 140° 150° 150° 150° 160° 160° 160° 10’ 20' 30’ 10’ 20' 30' 10' 20' 30' BP R R : Rotundin chuân Ghi chu : B : Ber chuân S : MNC sông P : Pal chuân 19 180° 180° 180° 200° 200° 200° 220° 220° 220° 10’ 20' 30’ 10' 20' 30' 10' 20’ 30’ Bàng 2.4 : Két qua phân tich alcaloid bàng SKLM (hiên màu diroi dèn tur ngoai A = 366 nm) Rf câc vet Chat chuan B 1 0,42 2 0,52 3 0,61 X 0,68 P + Sông R ++ + 100°C 110°C 130°C 140°C 150°C 160°C 30' 10' 20’ 30’ 10' 20’ 30’ 10' 20’ 30’ 10' 20’ 30’ 10' 20’ + + + + + + + + + + + + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 180°C 30’ 10' 20’ 200°C 30’ 220“C 10' 20’ 30’ 10' 20’ 30’ + + + + ++ + + + + + + + + ++ +++ ++ ++ + + + + + + + + + ++ ++ ++ +++ +++ + Bàng 2.5: Két quâ phân tich alcaloid bàng SKLM ( hiên màu bàng TT dragendorff ) Rf Chat chuan B 1 0,42 2 0,52 3 0,61 X 0,68 4 0,70 P Sông R + + 100W C 110°C 130°C 140°C 150°C 160"C 30’ 10' 20’ 30’ 10’ 20’ 30’ 10' 20’ 30’ 10' 20’ 30’ + + + + + + + + + + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 180°C * Ghi chu: B: Ber berin + : vêt nhô P: Palmatin ++: vêt vira R: Rotundin +++: vêt to Chat moi sinh ra dàt tên là X 20 220#C 20’ 30’ 10’ 20’ 30’ 10' 20’ 30’ 10 20’ ++ + + + + + + + + + + + +++ ++ ++ ++ ++ ++ + 200°C 10' 30’ ++ ++ + + + + + + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Nhân xét: > Hiên màu bàng dèn tü ngoai. Vét Ber chuân cô màu xanh , Pal chuân & vët sô 1 cô màu xanh • vàng , vét môi X cô màu nâu vàng cô Rf lân lugt là : 0,61 ; 0,52 ; 0,42 ; 0,68 • Rotundin chuân không phât quang duôi ânh dèn tu: ngoai ô buôc sông 366 nm • Câc màu sông; 100°C/30’; 110°C /10’, 20’, 30’; 130°C /10’, 20 , 30’, 140°C / 10’, 20’, 30’; 150°C / 10’, 20’, 30’; 160°C / 10’, 20’ tuongduong nhau cô 3 vét cô Rf lân luot là: 0,42 ; 0,52 ; 0,61 Trong dô: Vét 2 tuong duong Pal chuân Vét 3 tuong duong Ber chuân Câc mâu 160°C / 30 mât vét 1 • Mâu 180°C / 10 : cô 4 vét ; xuât hiên thêm vét X cô Rfx = 0,68, • Mâu 180°C / 20’, 30’; 200°C / 10’, 20’, 30’; 220°C / 10’, 20’, 30’ xuât hiên thêm vét X cô Rf = 0,68. Vét 1 côn rat mô. > Hiên màu bàng TT Dragendorff. • Tât câ câc vét dêu cô màu dô cam. • Vét Ber chuân , Pal chuân , Rotundin chuân cô Rf lân luot là : 0,61 ; 0,52 ; 0,70 • Câc mâu: sông, 100°C / 30’, 110°C - 150°C / 10’, 20’, 30’ tuong duong nhau: cô 3 vét cô Rf lân luot là: 0,42 ; 0,52 ; 0,61 Trong dô : Vét 2 tuong duong Pal chuân Vét 3 tuong duong Ber chuân. • Mâu 160°C / 10’, 20’; 180°C / 10’ mat vêt cô Rf = 0,42 • Câc mâu 160°C / 30’; 180°C / 20’, 30’; 200°C - 220°C / 10’, 20’, 30’ tuong duong nhau dêu cô 3 vét trong dô xuâthiên thêm vét X cô Rfx=0,68, mât vét cô Rf = 0,42 ( câc vét tuong duong Ber ,Pal chuân vân côn ). Nhu vây ô nhüng mâu sây ô t° cao , câcMNC tuong duong sao chây (160°C/30 ; 180°C/20, 21 30 ; 200°C - 220°C/10, 20, 30 ) dâ cô su biêh doi vê thành phàn hoâ hoc: vêt cü mât di, xuât hiên thêm vêt môi, câc vêt cô Rf = 0,52; 0,61 turong dirong vôi Ber, Pal vân côn. 2.2.23. Dinh luong Ber, Pal trong câc MNC * Xâc dinh dô dm cüa duac liêu: bàng mây précisa HA60 Két quâ sau 3 lân xâc dinh ghi à bâng 2.6 Bâng 2.6: Dô dm cüa duoc liêu Lân Dô âm (%) 1 9,8 2 9,6 3 10,1 Trung binh 9,8 * Chiét xuât: Cân chrnh xâc khoâng 5g bôt Hoàng liên sông. Sây à câc m ut t° và thôi gian khâc nhau nhii bàng 2.7 Bâng 2.7: Su thay doi khôi luong cüa câc MNC khi sây 10’ t sâ'y t°sây 20’ 30’ mDL m m mDL m m mDL m m sông sau sây dinh luong sông sau sây sông sau sây (g) (g) dinh luçmg (g) (g) dinh lirong (g) (g) (g) (g) 100 110 (g) 5,00 4,60 0,644 5,01 4,59 0,641 5,00 4,56 0,638 5,01 4,56 0,637 5,03 4,55 0,633 5,00 4,51 0,631 130 5,03 4,61 0,641 140 5,03 4,59 0,639 160 5,05 4,58 0,635 5,05 4,52 0,632 5,03 4,52 0,629 180 5,00 4,48 0,630 5,01 4,55 0,636 5,08 4,51 0,638 5,00 4,40 6,16 5,01 4,22 0,613 5,00 4,24 0,594 200 220 5,02 4,36 0,608 22 - Cân chmh xâc khoâng 0,7g duoc lieu sông: mDL sông = 0,704(g). Câc MNC khâc cân 1 luçmg tuong duong 0,7g duoc lieu sông khôi luong câc MNC dem dinh luong ( duoc ghi ô bàng 2.7). Chiét bàng shoxhlet theo quy trînh chiét xuât à mue 2.2.2.1 * Chuan bi mâu: + MNC: lây 1 ml dich A cho vào bînh dinh mire 10 ml thêm MeOH vira du. + Mâu chuan: là dung dich chuan chira hôn hop Ber và Pal. Cân 0,1216 Ber chuan, cho vào bînh dinh mire 100ml thêm MeOH tôi vach, pha loâng 2 lân duoc dung dich Ber cô nông dô 0,608 mg/ml (dung dich 1). Cân 0,0318g Pal chuan, cho vào bînh dinh mire 100ml thêm MeOH tôi vach, pha loâng 2 lân duoc dung dich Pal cô nông dô 0,159 mg/ml (dung dich 2). Lây 1 ml dung dich 1 và 1 ml dung dich 2 cho vào bînh dinh mrïc 10ml thêm MeOH tôi vach duoc dung dich chuan hôn hop. * Diêu kiên sac kÿ: + Côt Thermo hypersil Flow Hypurity C18 (150 x 4,6 mm, 5 p ) Nhiêt dô côt 35°C + Bom P4ooo + Bô phân tiêm mâu tu dông và ôn dinh côt AS 3000 +Pha dông: Hoà tan 1,73g Kalidihydrophosphat, 0,85g Natrilaurylsulfat trong 1000 ml hôn hop dung môi nuôc - acetonitril (1: 1), loc qua màng loc 0,45 p m, duôi khi bàng siêu âm. + Detector UV 6000 LP ô duôi sông 345 nm + Toc dô dông 1,2 ml/phüt. + Diëu khiën bàng hê thông phân mêm Chrom Quest 2.51 * Tiénhành: + Xâc dinh thài gian li(u cüa Ber và Pal: Tiêm 20 p 1 lân luot dung dich chuan Ber và Pal vào côt. Bom liên tue pha dông qua côt. Thôi gian luu cüa Ber : tluu = 8,9 ± 0,3 (phüt) 23 Pal : tluu= 8,2 ±0,3 (phüt) + Khâo sât khoâng tuyén tmh cüa Ber và Pal. Pha dung dich chuân Ber cô nông dô 0,03 dën 0,09 mg/ml, dung dich Pal chuân tù 0,007 - 0,0025 mg/ml chay sâc kÿ. Tmh phuong trinh hôi quy và hê sô tuong quan tuyê'n tmh giûa diên tich pic và nông dô. Kët quâ duoc ghi a bàng 2.8, hinh 2.1 Bàng 2. 8: Tirong quan nông dô và diên tich pic cua Ber Nông dô mg/ml Diên tîch pic 0,0304 6221655 0,0608 11956696 0,0912 19473833 Bâng 2.9 : Tuong quan nông dô và diên tich pic cüa Pal Nông dô mg/ml Diên tîch pic 0,00795 2211059 0,0159 3848758 0,02385 5872561 Hinh 2.1: Du&ng chuân Ber và Pal Berberin Palmatin nông dô nông dô Câc MNC dinh luçmg cô nông dô hoat chât nâm trong khoâng dâ khâo sât cô su liên quan tuyê'n tmh giûa diên tich pic và nông dô câc chât nghiên cùu. + Hàm luong Ber và Pal trong câc MNC duoc tmh theo công thuc (1) o mue 2.1. 2* Két quâ dinh luçmg duç/c ghi à bâng 2.10, hinh 2.2 - 2.6 Bâng 2.10: Tuong quan giüa diên tich pic và hàm luong alcaloid MNC Diên tich pic V tiêm mâu Ber Pal Hàm Iiroong (%) Ber Pal Ber chuân pi 20 Pal chuân 20 Ber + Pal chuân 20 12912022 3654610 Sông 10 12993944 4353011 7,82 2,43 100°C/30’ 10 12850737 4185741 7,78 2,35 110#C/20’ 10 12804013 4040813 7,76 2,17 110°C/30’ 10 13156977 4116144 7,97 2,31 130°C/10’ 10 13410954 4426669 8,12 2,49 Ber + Pal chuân 20 16501714 3768226 130°C/20’ 10 16653685 4338800 7,84 2,36 130°C/30’ 10 15539358 4087569 7,36 2,23 140°C/10’ 10 15072686 4060914 7,14 2,21 140°C/30’ 10 15347145 3846674 7,28 2,09 160°C/10’ 10 13962634 3552323 6,62 1,93 160°C/20 10 13278934 3269719 6,29 1,78 160°C/30’ 10 9369482 2590217 4,44 1,41 180°C/10’ 10 12172912 3003863 S,11 180°C/20’ 10 11295094 2759911 5,35 1,50 180°C/30’ 10 9085765 2415628 4,31 1,31 200°C/20’ 20 9414382 2820516 2,23 0,77 200°C/30’ 20 10036946 3474247 2,38 0,94 220°C/10’ 20 7523185 2707870 1,78 0,74 220°C/20’ 20 3111925 1395227 0,74 0,38 1245445 81,3 3694559 81,5 Berberin chuân chî dat 81,3% nên nông dô chuân thuc cüa Ber = 0,0608 x 81,3% = 0,0494 mg/ml Palmatin chuân chî dat 81,5% nên nông dô chuân thuc cüa Pal = 0,0159 x 81,5 = 0,01296 (mg/ml). 25 1,64 Hînh 2.2: Sâc kÿ dâ hôn hffp Ber, Pal chuan 300 A R é te n tio n Time h 300 h 200 200 100 100 r\0 O *>o0 o Tf; O «O y© ro oo,^ en ror-~ ^ «O ITi 10 12 14 Hînh 2.3: Sâc kÿ do alcaloid mâu song R é te n tio n Time 400 400 200 200 Câc mâu sông và mâu < 140°C/10’, 20’, 30 ; 160°C/10’, 20’, 180°C/10, tî le chât môi gàn nhu ît thay doi xâp xî 11%. > Mâu 160°C/30’; 180°C/20’, 30’, 200°C/20’, 30’; 220°C/10’, 20’ chat (X) xôi sinh ra cô tî le tâng dân tù 11% lên27%. Trong khi ô nhüng mâu này tî lê Ber giâm manh tù > 50% xuông côn xâp xî 20%. Nhu vây à sâc kÿ dô HPLC cô su tuong dông vôi SKLM: ô mâu 160°C/30 sinh ra 1 chat môi. 180°C/20’, 30’, 200°C - 220°C/10’, 20’, 30’ sinh ra 1 chat môi. > Mâu 160°C/30’; 180°C - 220°C/10’, 20’, 30’: - Cùng thôi gian sây: t° càng cao hàm luong chât X càng tâng, hàm luong Ber, Pal càng giâm - .Cùng t° sây: thôi gian càng dài hàm luong chât X càng tàng, hàm luçmg Ber, Pal càng giâm. 2.2.3. Nghiên ciru mot sô tâc dung sinh hoc. 2.2.3.I. Nghiên cûu tâc dung khâng khuan: - MNC: Mâu 1 : sông Mâu 4 : sây à 180°C / 30’ Mâu 2 : sây à 140°C / 30’ Mâu 5 : sây ô 200°C / 30’ Mâu 3 : sây ô 160°C / 30’ Mâu 6 : sây à 220°C / 30’ - Phuong phâp: khuéch tan trên môi truông thach. * 5 chüng Gram (+): * 5 chüng Gram (-) : Bacillus subtilis (B.S) Salmonella typhi (Typ) Bacillus cereus (B.C) Shigella flexneri (Shi) Bacillus pumilus (B.P) Escherichia coli (E.C) Staphylococus aureus (Sta) Proteus mirabilis (Pro) Sarcina lutea (S.L) Pseudomonas aeruginosa (Pseu) 2.2.5.1 Chuân bi môi trtfàng: - Công thuc môi truông: 31 Pepton: 0,1g Cao thit: 0,06g NaCl: 0,1g Nuôc cât vùa dû 20 ml PH = 7,4 ± 0,2 Pha môi trucmg canh thang long , cho vào 10 ong nghiêm môi ông 1.5ml. Nüt bông mô, hâp tiêt trùng à 120° C trong 30’. De nguôi toi t° phong, cây môi chüng vi khuân kiëm dinh vào 1 ông. Nuôi cây trong tü âm 37°C trong 18-24 giôr cho vi khuân phât triën. 2.2.5.2. Chuân bi : - Duc câc khoanh giây loc cô duông krnh 6mm, hâp tiêt trùng à 110°C trong 30 phüt. - Mâu dôi chûng: tâm dung dich khâng sinh Penicillin G30UI/ml gentamicin lOUI/ml vào câc khoanh giây loc dâ tiêt trùng, sây khô khoanh giây ô 50°C, tâm nhu vây 3 làn. Tmh luong khâng sinh trong môi khoanh giây: Penicillin: 3 UI/1 khoanh. Gentamicin: 1UI/1 khoanh. - Mâu thû: Tâm dich cao long 1:1 vào câc khoanh giây loc, môi khoanh giây chûa khoâng 0,05g duoc liêu. 2.2.5.3. Tien hành kiêm dinh: - Môi truàng thach thucmg: Pepton: 3g Cao thit: 1,8g NaCl: 3g Thach bôt: 10,8g Nuôc câ't vùa dû 600ml PH = 7,4 ± 0,2 Cho vào 10 bînh non 100ml, môi bînh 60ml môi trtfdng thach thucmg, nüt bông mô, tiêt trùng à 120°C/30\ Lây ra de nguôi tôi 50°C, làn luot cho môi chûng vi khuân dâ chuân bi à phàn 2.2.5.1 vào 1 bînh, lac déu, chia ra 3 hôp pétri môi hôp 20ml. De nguôi tôi nhiêt dô phong. Dàt câc khoanh giây loc dâ chuân bi ô phân 2.2.5.2 theo thû tu dâ dinh. Dât câc hôp pétri vào tü nuôi cây 37°C trong 24 giô. Kê't qua duoc ghi à bâng 2.14 . 32 Bàng 2.14: Tâc dung khâng khudn cüa câc MNC Duông kînh vông vô khuân (mm) VK B.S B.C B.P Sta S.L Typ Shi E.C Pro Pseu 1 Sông 16,43 17,65 18,94 16,21 15,64 15,89 20,59 15,96 20,34 15,01 2 140°C/30 17,54 15,60 19,60 16,95 15,71 15,47 20,26 16,09 19,68 12,51 3 160°C/30 15,97 17,57 19,59 16,19 15,67 15,50 19,45 16,25 18,44 13,67 4 180°C/30 16,56 16,29 18,17 15,03 15,26 14,50 18,91 16,25 17,91 13,05 5 200°C/20 13,33 15,57 16,83 14,77 11,79 13,91 9,76 15,58 15,23 13,32 6 220°C/30’ 11,4 8,70 8,83 9,15 7,35 10,00 9,81 8,00 8,59 8,97 7 KS 7,30 7,60 7,28 0 0 13,20 12,59 13,01 12,70 18,00 Ghi chu: VK: chüng vi khuân KS: khâng sinh doi chüng *Nhân xét: Câc MNC dêu co tâc dung üc ché su phât triën cüa 10 chüng vi khuân kiëm dinh. Hoàng liên cô tâc dung manh nhât dôi vôi shigella flexneri. Két quâ này phù hop vôi nhiêu tài lieu cho ràng Hoàng liên cô tâc dung tôt vôi truc khuân li, Hoàng liên cô tâc dung khâng khuân manh phô rông.Vôi 4 MNC dâu; mâu 1, 2, 3, 4 tâc dung khâng khuân tuong duong nhau , mâu 5, 6 tâc dung khâng khuân giâm hon, dây là nhüng mâu sao chây nên hàm luong Ber và Pal côn rat ft do dô tâc dung khâng khuân cüng giâm. Vôi khâng sinh dôi chüng: penecillin không cô tâc dung vôi Sta, S.L ô nông dô 3 UI. Ô câc mâu sao chây tâc dung khâng khuân vân manh hon penicilin à nông dô3 UI. Vôi vi khuân Gr (-) câc mâu 1, 2, 3, 4 cô tâc dung manh hon câ gentamicin nông dô 1UI / khoanh giây, mâu 5, 6 tâc dung yéu hon gentamicin lUI/khoanh giây. 33 1«ki Ânh 2.4. Tâc dung khâng khuan cüa câc MNC Ghi chu: 7 :Khâng sinh doi chuïig 34 2.23.2 - Thü tâc dung an thân: * MNC : Mâu 1: Song Mâu 2: 140°C/30 Mâu 3: 160°C/30 Mâu 4: 200°C/30 Mâu 5: 220°C/30’ * Chuan bi mâu cao long 1:1 cüa 5 MNC trên: Sâc Hoàng liên: lây câc MNC mot luong tuong duong 100 g DL song sâc 3 lân môi lân vôi 200ml nuôc trong 30 (tinh tùr thôi diëm sôi). Loc qua bông. Dich loc duoc cô câch thuÿ tôi khi côn 100ml duoc cao long 1 : 1 . Tù cao long 1 : 1 pha thành cao long 1: 5 . * Chuan bi thiopentan: cân 40mg thiopentan hoà vôi 10ml NaCl 0,9%. * Tiê'nhành: Lô chüng: tiêm thiopentan tmh mach duôi liêu 40mg/kg T.T chuôt. Lô thû thuôc: cho chuôt uông thuôc vôi liêu 2g duoc liêu/kg T.T chuôt. Sau 20 phüt gây ngû bàng thiopentan tiêm tinh mach duôi vôi liêu 40mg/kg chuôt. Quan sât thôi gian ngü cüa lô chüng và lô thü thuôc theo tu thé nàm ngüa dén khi chuôt lât mînh trô dây trên 4 chân. Két quâ duoc ghi à bâng 2.15 Bâng 2.15: Thôi gian ngü cüa chuôt à câc MNC M NQ MNQ M NQ M NQ TT Chüng MNQ 16 10 6 22 6 11 1 10 6 39 120 11 2 7 11 8 9 7 18 9 3 30 22 11 9 8 92 4 15 18 6 16 41 5 7 15 27 12 148 9 6 9 15 17 19 166 10 7 8 20 98 73 87 25 8 6 14 93 89 53 7 101 9 22 51 94 32 17 10 7 12 10 12 14 51 8 11 16 25 10 52 11 12 8 46 67 9 16 16 7 13 20 27 29 8 63 11 14 12 10 40 19 15 5 13 16 6 35 Loai sai sô' thô theo công thrïc (2) ghi à phân phuong phâp nghiên cuu. Nhu vây: MNC,: chuôt sô 2,4,6,7,9,14 là sai sô thô (n,= 7). MNQ: chuôt sô 5,9,10 là sai sô thô (n2= 12). MNC3: chuôt sô 8 là sai sô' thô (n3= 14). MNC4: chuôt sô' 8,9,13 là sai sô' thô (n4= 13). MNC5: chuôt sô 10 là sai sô' thô (n5= 14). Bàng 2.16: Két qua Test t giûra MNC vôi mâu chümg và câc MNC (mâu sâ'y) vôi MNC, (mâu sông). Chumg Giâ tri MNCj MNC2 14,43 ± 2.43 12,75 ± 3M mnc3 mnc4 MNCS 14,84 t U,23 17,00 ± 4,60 t ngü trung bînh (phut) 7,12 ± 0,55 29,71 ± 9,00 Test t t 6,74 3,86 14,43 4,10 4,71 MNC voi to 2,08 2,06 2,05 2,05 2,05 Chümg p P < 0,001 P < 0,001 P < 0,001 P < 0,001 P < 0,001 Test t t 0,768 2,45 0,14 0,79 MNC voi to 2,11 2,09 2,1 2,09 MNC, p P>0,1 P < 0,05 P>0,1 P>0,1 *Nhân xét: - Tâ't câ 5 MNC dêu khâc mâu chiïng cô y nghla thô'ng kê (P < 0,001) - Ba MNC: 2,4,5 khâc MNC, không cô ÿ nghla thô'ng kê (P > 0,05) - MNC3 khâc MNC, cô ÿ nghla thô'ng kê (P < 0,05) 2.3 - BÀN LUÂN. 2.3.1 - Phuong phâp dinh luong alcaloid trong Hoàng liên. Ber, Pal là hai chat cô câ'u truc hoâ hoc tuong tu nhau, cô eue dai hâ'p thu ânh sang tü ngoai gân giô'ng nhau: cüa Ber clorid là 349,266, 230 (nm); cüa Pal clorid là 348, 267, 227 (nm) [15], 2 châ't này rat khô tâch hoàn toàn bàng SKLM và sàc kÿ côt. Sü dung phuong phâp HTLC cüa mot sô' tâc giâ [15] cô thé tâch tôt hai chât này. Theo tâc giâ Pham Thanh Kÿ và công s u , dùng côt Lichrosorb RP8 (10jL/m, 250 x 4 mm) vôi pha dông là 3,4g Kalidihdrophosphat, 1,7g Natrilaurylsulphat trong 1000 ml hô hop dung môi: nuôc - actonitril (1 : 1). 36 Chüng tôi dung côt Hypurity C18 (150 x 4,6mm, 5 jjm) và thay doi pha dông: 1,73g Kalidihdrophosphat, 0,85g Natrilaurylsulphat trong 1000 ml hôn hop dung môi: nuôc - actonitril (1 : 1), thay tâch rô ràng 2 pic Ber và Pal (hînh 2.2 - 2.6). Chüng tôi cüng thay doi toc dô dông lên 1,2 ml/phüt ([15] là 0,7ml/phût) thay Ber và Pal tâch tôt và giâm duoc tluu tù 13 - 14 phüt xuông côn 8 - 9 phüt (Phu lue). Nhu vây rüt ngân duoc thôi gian dinh luong và tiét kiêm duoc dung môi. 2.3.2 - Ânh hirang nhiêt dô dén thành phân hoâ hoc. * Dinh tinh: - Câc MNC dêu côn Ber và Pal -Sàc dô SKLM thêm vét môi à mire t° > 160°C -Sâc dô HPLC xuât hiên rô mot sô pic môi, dàc biêt pic cô tluu = 6,3 ± 0,3 phüt. Pic cô t,^ < 5 phüt giâm nhiêu. t° nông chây cüa Ber = 144°C, Pal = 192°°, nên ô t° > 200°C Ber, Pal bi phân huÿ tao ra chât môi. Két quâ dinh tmh bàng SKLM, HPLC thô'ng nhât vôi nhau. * Dinh luçfng: + Ber, Pal: t°càng cao Ber, Pal càng giâm (mâu sông Ber = 7,82%, Pal = 2,43%, mâu sây 220°C/20’ Ber = 0,74%, Pal = 0,38%). + Chât X (chât môi cô tluu = 6,3 ± 0,3 phüt) xuât hiên à mâu 160°C/30 tàng dân, tï le chât X so vôi tong sô câc thành phân trong MNC tàng dân (mâu 160°C/20\ 160°C/30, 220°C/10’, X chiém lan luot là: 12,83%, 17,19%, 27,02%). 2.3.3: Tâc dung sinh hoc 4» Tâc dung khâng khuan: Ô câc mâu sao qua và sao vàng tâc dung khâng khuan tuong duong duoc lieu sông. Nhüng mâu sao chây tâc dung khâng khuan giâm manh. Do dô khi dùng Hoàng liên vôi mue dich khâng khuan diêu tri câc bênh duông ruôt chi nên dùng sông hoâc sao qua (t° < 100°C). Theo YHCT: khi sao làm tàng tînh âm, giâm tînh hàn cho vi thuôc t° càng cao càng tâng tînh âm, càng giâm tâc dung thanh nhiêt, (làm mât) cüa vi thuôc. Két quâ nghiên cùu thây tâc dung khâng khuan phù hop vôi y lÿ YHCT: su dung dë diêu tri nhiêm khuan không nên sao ô t° cao. 37 * Tâc dung an thân: Chua thay tài liêu nào nêu tâc dung an thân cüa Hoàng liên , nhung két quâ nghiên ciru cho thây câc mâu Hoàng liên dêu cô tâc dung kéo dài giâc ngü thiopentan trên chuôt thi nghiêm (P < 0,001). Diêu dô phù hop vôi co ché tâc dung cüa Hoàng liên (làm giâm hung phân ) : - Giâm co co tâm thât tim [22] - Giâm nhip tim [22] - Dôi khâng canh tranh vôi a ,, a2 Adrenergic.[22] Do dô giâm hung phân cüa tim nên làm an diu thân kinh. Dô chmh là tâc dung thanh tâm hoâ cüa y hoc cô truyên. Chüng tôi tién hành thü nghiêm vôi liêu lOg/KgT.T và 5g/KgT.T thây ban dâu cüng cô tâc dung kéo dài giâc ngü nhung chuôt ngü mê met sau dô cô con không tînh dây roi chét. Két quâ này phù hop vôi tâc giâ Phucng Anh [1] dâ nghiên cüu duoc LD50 cüa Hoàng liên = 6,875 ± 0,904g/KgT.T. 38 PHAN 3: KET LUAN VA DE XUAT 3 .1 -K E T LUÂN Qua két quâ nghiên cun, chüng tôi dâ hoàn thành mue tiêu dê tài vôi mot so két luân sau: 3.1.1. Nhiêt dô ânh hirong den màu sac vi thuoc: - Ô m ut t° 100-140°C /10’, 20’ màu vi thuôc ît thay doi,giong màu duoc lieu sông tuong duong sao qua. - Ô mire t° 140 -150°C(tuong duong sao vàngjvi thuôc cô màu vàng dê'n vàng dâm tuong duong sao vàng. -Ô mü'c t° 200-220°C vi thuôc cô màu den tuong duong sao chây. 3.1.2. Thành phàh hoâ hoc: - Câc mâu sây tù 100-220°C dêu côn Berberin, Palmatin. - Dinh luong bàng HPLC trên co sô công trînh nghiên ciïu cüa môt so tâc giâ[15] , chüng tôi cô diêu chînh pha dông làm giâm tluu, giâm thôi gian và dung môi dinh luçmg , vân dâm bâo tâch tôt Berberin, Palmatin - Hàm luong Berberin, Palmatin giâm dân à mûc t°>160°C - Phân tich câc MNC bàng HPLC thây: cô nhiêu pic mât di, hînh thành nhiêu pic môi ( dâc biêt pic cô tluu = 6,3 ± 0,3 phüt ).Tÿ lê chât tâng dân tù câc MNC sây ô t° 160-220°C . Ô mü’c nhiêt dô > 200°C - 220°C tuong duong sao chây, thành phân hoâ hoc và hàm luong Berberin, Palmatin giâm rat nhiêu: mot so chât bi mât di, cô chât bi giâm hàm luong, sinh ra mot sô chât môi. Ô nhüng mâu sao chây: cô su tuong dông giüa quâ trînh giâm hàm luong cüa Ber, Pal và quâ trînh tâng hàm luong cüa chât môi X. 3.1.3. Tâc dung sinh hoc: Tâc dung khânh^ khudn: 39 Thành phàn hoâ hoc cüa vi thuoc co liên quan mât thiê't tôi tâc dung sinh hoc: câc mâu sao vàng, sao qua: tâc dung khâng khuân tuong duong mâu sông, câc mâu sao chây tâc dung khâng khuân giâm rô rêt, phù hop vôi lÿ thuyét y hoc cô truyên: khi dùng vôi tâc dung thanh nhiêt dé diêu tri viêm, nhiêm khuân không nên sao kÿ. Tâc dung an thân: Câc mâu Hoàng liên sao qua, sao vàng, sao chây dêu cô tâc dung an thân: kéo dài giâc ngü khi phôi hop vôi thiobarbitan. Két quâ nghiên ctru thây phù hop vôi câch dùng vi thuôc Hoàng liên cüaYHCT. 3.2 - MOT V À I Ÿ KIÉN DE XUÂT: ❖ Tiép tue phât triën dê tài nghiên ciîu này dë: + Xâc dinh hoat chat cô tâc dung an thân. + Xâc dinh chat môi X (vi cô tî lê lôn trong tông sô alcaloid). + Xây dung tiêu chuân ché bién Hoàng liên. 40 TAI LIEU THAM KHAO Tiëng Viêt 1/ Pham Thi Phuong Anh (2001) - Nghiên cüu ânh huông cüa phuong phâp ché bién vi thuoc Hoàng liên (Coptis chinensis) dê'n thành phân hoâ hoc và tâc dung sinh hoc - Luân vân thac si duçfc hoc. 2/ Bô KH CN&MT (1996) - Sâch do Viêt Nam (phân thitc vât) - NXB KHKT (tr. 100-102). 3/ Bô mon duoc lieu (1998) - Bài giâng duçfc lieu, tâp II - Trung tâm thông tin thu viên truông Dai hoc Duoc Hà Nôi. 4/ Bô mon DHCT (2002) - Dtiçfc hoc co truyên - NXB Y hoc Hà Nôi. 5/ Bô Y té (1983) - Duçfc diên Viêt Nam 1, tâp I - NXB Y hoc Hà Nôi. 6/ Vô Vàn Chi (1997) - Tù dién cây thuoc Viêt Nam - NXB Y hoc HN (tr. 565) 7/ Lê Tràn Dire (1997) - Cây thuoc Viêt Nam - NXB Nông Nghiêp (tr. 160167) 8/ Dào Hûu Hô (1994) - Giâo trinh thong kê toân hoc - NXB Dai hoc Quôc gia Hà Nôi. 9/ Pham Hoàng Hô (1999)- Cây cô Viêt Nam, tâp I - NXB Trê (trang 325). 10/ Nguyên Minh Khôi - Lê Dînh Bich (1999) "Khâo sât ânh hitông cüa nhiêt dô dê'n quâ trinh ché bién mot so loài thuôc chi Dioscorea L. làm nguyên lieu chiê't xuât diosgenin> Tap chi duçfc hoc - sô 7 (1999) (tr.16,17) 11/ Nguyên Liêm - Gop phân nghiên cüu vê thuc vât và hôa hoc cây vàng dang - Luân ân Phô tien si khoa hoc Hà Nôi 1981. 12/ Dô Tâ't Lçfi (1999) - Nhüng cây thuô'c và vi thuôc Viêt Nam - NXB Y hoc (trang 14,15, 189). 13/ D.T.Nhu (2003), "Tâc dung cüa nhiêu hoat chât proto Ber trên hàm luçmg seretonin â tê'bào P8iy\ Bân tin duçfc lieu, tâp 2- sô 1- 2003 (tr. 25). 14/ Pham Xuân Sinh (1999) - Phuang phâp ché bien thuoc co truyên - NXB Y hoc (tr.502 - 505). 15/ Nguyên Phuang Thâo- Trinh Vàn Lâu - Pham Thanh Kÿ (2002)"Nghiên cüu dinh luong Ber và Pal trong Hoàng liên bàng phuang phâp sac kÿ long hiêu nâng cao "y Tap chî Duoc liêu, tâp 7- so 3- 2002 (tr.79 - 82). 16/ Hoàng Duy Tân - Trân Vàn Nhû (1995) - Tuyên tâp phuang thang Dông y - NXB Dông Nai (tr.500). 17/ Pham Thiêp - Lê Vàn Thuân - Bùi Xuân Chuong (2000) - Cây thuoc bài thuoc và biêt duac - NXB Y hoc (tr.l 18,119). 18/ L.T.Thüy (2002) ->"Hoàng liên cao chiét duac thâo Trung Quoc ûc ché su phât trién té bào do ngân chân biéu hiên cüa proteincyclin BI và ûc chê'hoat tinh cüa CDC2kinase trên té bào ung thu a ngudi \ Bân tin duoc liêu, tâp 1- so 72002 (tr. 10-11). 19/ To mon vi nâm khâng sinh trucmg Dai hoc Duoc Hà Nôi (2000) - Kiérn nghiêm thuoc bàng phuang phâp VSV. 20/ Viên Duoc liêu (1993) - Tài nguyên cây thuoc Viêt Nam - NXB KHKT 1993 (tr.502 - 505). Tiê'ng Anh 21/ J.siwon (1982) - A Pharmacognostical study of some Indonesian médicinal plants ofthefarmily Mennispermaceae (page 1 5 - 17,46, 47). 22/ Kee Chang Huang (1999) - The pharmacology ofChinese Herbs second Edition CRC (page 75 - 76). 23/ Ling Dong Kong Christopher HK Cheng Christopher Renxiang Tan (2001) Monoanmin oxydase Inhibitors from rhizoma of Coptis chinensis. Planta medica vol 67. nol (page 74 - 76). 24/ Pharmacopeia ofthe people’s republic of China - Volum II 1997 (page 187- 188). 25/ Robert A. Tumer (1965) Screening methods in pharmacology Academic press (page 87 - 99). 26/ The Merck index - 2001 Thirteenth Edition (page 197). PHI L I C Sâc kÿ do aie MNC tnAU Mâu sông (toc dô dông 0,7 ml / phût ) (n A U M âu sông {toc dô dông 1,0 ml / phût ) Mâu sông (toc dô dàng 1,2 ml / phût ) Rétention Time 400 00> ir CO O 200 - ocv^j 0- 00 OOOCN 00 CM O tD TT CD CM t J- 2 200 m om o T^CO un CD r^ CD 00 0 CMCMM co i ^ v /’W J 4 /x— , L L 4 J i y v _ j J .. . ^ ----- 1 4t-j-j-------i I I ! ! ! 0 CM O) 00 mAU mAU 400 4 ! T 6 oo i 3 cb V Minutes _J_ „ 12 10 8 ■— - — 14 Berberin chuan Rétention Time 400 400 200 200 - mAU mAU i CM oo 00 ■^r 'duS o CD O CD en (D CM O 00 CD CM 00 -C O - 6 Minutes 8 10 12 14 Palmatin chuan Rétention Time 100 mAU mAU 100 i Rétention Time Minutes T ¥ C c/) ► — l O* O © n © Mâu sây ô 110° C /20’ j&>» mAU Mâu sây ô 130° C /10’ Minutes mAU mAU Mâu sây ô 130° C /20’ Minutes mAU mAU ’ Mâu sây à 130° C /30’ Mmutes mAU Mâu sây a 140° C /10’ Minutes Mâu sây à 140° C /30’ — ; 300 mAU mAU 300 0 2 4 6 8 10 12 14 Minutes mAU mAU Mâu sây ô 160° C /10’ Minutes mAU Mâu sây à 180° C /10’ mAU § 8 i k mAU i 73 i 2CD j > ro J -l > 1.362 1.682 o 2.573 Cl> =J o . 3 H 2 I 3 > 3 o » j > 4.248 4.592 CO» 5.052 C C/5 tû\ o 6.462 Minutes 7.075 Os Oo -C i. 8.430 n o 9.H65 12.033 mAU mAU mAU Rétention Time 73 (P CD 1.320 1.737 I ! < y 2.557 | V / 3.287 3.533 a3> 4.152 S 4.507 S p>» c/3 # Q* to 5.028 C 5.702 6.345 Minutes o o o 7.925 n 8.483 9.213 ! / o mAU Mâu sây à 180° C /30’ 2co>» c V) tû\ 00 o n O mAU mAU - 1.353 1.758 y 2.570 V ’ 3.323 C — 4.205 4.542 5.070 6 . 398 ( j 7.960 8.508 9.245 rnAU i mAU 7) ; 2- I 7J CD CD CD ZJ 1 370 1.790 H 3 3 2.583 CD 3 318 nçpv 4.225 5.065 & 3>» C 5.733 C/) VC5û\ 085 to to oo n 9.238 i I mAU [...]... C18 (150 x 4,6 mm, 5 p ) Nhiờt dụ cụt 35C + Bom P4ooo + Bụ phõn tiờm mõu tu dụng v ụn dinh cụt AS 3000 +Pha dụng: Ho tan 1,73g Kalidihydrophosphat, 0,85g Natrilaurylsulfat trong 1000 ml hụn hop dung mụi nuục - acetonitril (1: 1), loc qua mng loc 0,45 p m, duụi khi bng siờu õm + Detector UV 6000 LP ụ duụi sụng 345 nm + Toc dụ dụng 1,2 ml/phỹt + Diởu khiởn bng hờ thụng phõn mờm Chrom Quest 2.51 * Tiộnhnh:... (TXB2), do dụ cụ tõc dung chụng thiộu mõu nõo eue bụ [22] > Dich chiột tự Hong liờn cụ tõc dung ỷc chộ su phõt triởn cỹa tộ bo ung thu, Hong liờn dõ ỷc chộ su phõt triởn khụi u v su hinh thnh trong qun thở dụng tộ bo ung thu da dy, ruụt kột, vỹ, phu thuục vo liờu v thụi gian dựng Su phõt triởn cỹa tộ bo bi ỷc chộ hon ton sau 3 ngy chiu tõc dung cỹa thuục 10|ag/ml duoc thõo Tõc dung ỷc chộ phõt triởn khụi... thich hop, do quang ụ buục sụng thùch hop Mõt dụ quang tợ le vụi nụng dụ dung dich alcaloid Phtfcfng phõp sõc k long hiờu nõng cao (HPLC) [15] Nguyờn tac: Dich chiột alcaloid duoc tiờm vo cụt sõc k pha dụng duoc bom liờn tue qua cụt tõch riờng cõc alcaloid khụi hụn hop Mụi alcaloid khi ra khụi cụt duoc detector UV nhõn biột, biộu hiờn ra bng 1 pic Diờn tich pic tuong ung vụi nụng dụ alcaloid trong dung... phu liờu) Mue dich Mat ngoi mu den, bờn trong mu vng Mõt ngoi mu den, bờn trong mu nõu den Dõn thuoc vo kinh t Tng tõc dung tiờu thuc giõm tmh mõnh liờt cỹa vi thuục Tng tõc dung cõm mõu Truyờn nhiờt dụ dụng dốu vo vi thuục Tng tõc dung kiờn t, giõm tmh khụ tõo cỹa vi thuục Trõnh kột dmh thuục 200 Nung Hng nghin Chộ sirang Hng nghln Vụ ca hoõ, phõ vụ cõu truc cỹa thuục Tinh chộ thuục cụ nguụn khoõng võt,... bien doi thnh phn hoa hoc * Dinh luong Alcaloid: Dinh luong Ber v Pal bng HPLC dõ duoc TS Pham Thanh K, Trinh Vn Lõu nghiờn ctru [15] * Nguyờn tac: Dich chiột duoc liờu duoc tiờm vo cụt sc k v duoc pha dụng chay qua cụt tõch thnh cõc Alcaloid riờng biờt Mụi Alcaloid ra khụi cụt duoc detector UV nhn biột, biởu hiờn ra bng mụt pic Diờn tich pic tợ le thuõn vụi nụng dụ dung dich Alcaloid * Tmh kột quõ theo... cụ duụng kmh tợ le vụi hoat lue khõng khuõn cỹa thuoc Chợ tiờu theo dụi: so sõnh duụng kợnh vống vụ khuõn cỹa MNC vụi khõng sinh dụi chỹng v cỹa cõc MNC vụi nhau * Tõc dung an thõn: Thỹ tõc dung hiờp dụng vụi thuục ngỹ barbituric [25] (Viờn Duoc lieu dõ chợnh l ) Nguyờn tac: Chuụt duoc uụng thuục (cao long cõc MNC) sau mụt thụi gian, gõy ngỹ bng thiopentan Tõc dung tng cuụng thụi gian ngỹ cỹa chuụt...Do lm dõn mach [3,6] thuụng dựng dộ phong ngựa xỹ vỷa dụng mach, do Ber lm giõm luỗmg cholesterol trong huyột tuong [20] Vụi dudng tiờu hoa: Hong liờn vụi liờu nhụ kich thich giỷp su tiờu hoa tng co bụp da dy, ruụt, chỷa viờm da dy [3,6,12] Tõc dung khõng... + Toc dụ dụng 1,2 ml/phỹt + Diởu khiởn bng hờ thụng phõn mờm Chrom Quest 2.51 * Tiộnhnh: + Xõc dinh thi gian li(u cỹa Ber v Pal: Tiờm 20 p 1 lõn luot dung dich chuan Ber v Pal vo cụt Bom liờn tue pha dụng qua cụt Thụi gian luu cỹa Ber : tluu = 8,9 0,3 (phỹt) 23 Pal : tluu= 8,2 0,3 (phỹt) + Khõo sõt khoõng tuyộn tmh cỹa Ber v Pal Pha dung dich chuõn Ber cụ nụng dụ 0,03 dởn 0,09 mg/ml, dung dich Pal... 180C/20, 30, 200C/20, 30; 220C/10, 20 chat (X) xụi sinh ra cụ tợ le tõng dõn tự 11% lờn27% Trong khi ụ nhỹng mõu ny tợ lờ Ber giõm manh tự > 50% xuụng cụn xõp xợ 20% Nhu võy sõc k dụ HPLC cụ su tuong dụng vụi SKLM: ụ mõu 160C/30 sinh ra 1 chat mụi 180C/20, 30, 200C - 220C/10, 20, 30 sinh ra 1 chat mụi > Mõu 160C/30; 180C - 220C/10, 20, 30: - Cựng thụi gian sõy: t cng cao hm luong chõt X cng tõng, hm ... phõp khõc nhau, dụ cụ phuong phõp Phuong phõp thuc chat l su tõc dụng cỹa nhiờt dụ dộn vi thuục Cõc phuong phõp khõc thi nhiờt dụ tõc dụng khõc lm cho thnh phõn hụa hoc sờ biộn doi khõc dõn toi tõc... Hypurity C18 (150 x 4,6 mm, p ) Nhiờt dụ cụt 35C + Bom P4ooo + Bụ phõn tiờm mõu tu dụng v ụn dinh cụt AS 3000 +Pha dụng: Ho tan 1,73g Kalidihydrophosphat, 0,85g Natrilaurylsulfat 1000 ml hụn hop... dụ dụng 1,2 ml/phỹt + Diởu khiởn bng hờ thụng phõn mờm Chrom Quest 2.51 * Tiộnhnh: + Xõc dinh thi gian li(u cỹa Ber v Pal: Tiờm 20 p lõn luot dung dich chuan Ber v Pal vo cụt Bom liờn tue pha dụng