- Mẫu 9.1: tác dụng ức chế viêm ở mức độ trung bình (ức chế 55,63%).
4. Định tính: Qua kết quả khảo sát định tính phát hiện “vân tay” dược liệu trong
thành phẩm viên chữa thấp khớp đã xác định được dấu vân tay của 4 dược liệu: Hy thiêm, sâm đại hành, câu đằng, thổ phục linh (xem hình 3.16).
Hình 3.16. Sắc ký đồ định tính sâm đại hành (A,B); câu đằng (C); hy thiêm (D); thổ phục linh (E) trong cao và viên chữa thấp khớp.
Ghi chú: Ký hiệu
SDH: Sâm đại hành Bulbus Elentherinis Subaphyllae CD: Câu đằng Ramalus cum Unco Uncariae
HT: Hy thiêm Herba Siegesbeckiae
TPL: Thổ phục linh Rhizoma Smilacis glabrae 1: Viên chữa thấp khớp
2,3,4: Cao chữa thấp khớp
Hình A: Quan sát dưới UV 245nm; Hình B,C: Quan sát dưới UV 366nm; Hình D,E: Quan sát dưới ánh sáng thường.
Các phương pháp định tính xác định vân tay của các dược liệu trong thành phẩm viên được xây dựng như sau:
Định tính hy thiêm: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN IV, phụ lục 5.4)
Dụng cụ, thuốc thử:
- Bản mỏng silicagel G, tráng sẵn của Merck, được hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ.
- Ethyl acetat, methanol, ethanol tuyết đối (TT).
E
- Dung môi triển khai sắc ký: Cloroform – methanol – amoniac (7,5: 2,5: 0,5) - Hiện màu: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol
Cách tiến hành:
- Dung dịch thử: Lấy 10 viên, cạo bỏ lớp bao ngoài, tán mịn, thêm 10ml
methanol, lắc siêu âm 15 phút, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn thu
được trong 30ml nước rồi chuyển vào bình gạn, lắc với 40ml ethylacetat. Gạn lấy dịch
chiết ethylacetat, cô trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn thu được trong 2ml ethanol tuyệt
đối được dung dịch chấm sắc ký.
-Dung dịch đối chiếu: Lấy 1,3g bột hy thiêm, chiết hồi lưu trên cách thủy với
30ml hỗn hợp ethanol - nước (1:1) trong 1 giờ, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến
cạn. Hòa cắn thu được trong 30ml nước rồi chuyển vào bình gạn, lắc với 40ml ethylacetat. Gạn lấy dịch chiết ethylacetat, cô trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn thu được trong 2ml ethanol tuyệt đối được dung dịch chấm sắc ký.
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi đi được khoảng 10-13cm, lấy bản mỏng ra, để khơ ở nhiệt độ phịng rồi phun thuốc thử hiện màu, sấy bản mỏng ở 1200C cho đến khi hiện vết rõ.
Kết quả : Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng màu, cùng Rf với các vết thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
Định tính sâm đại hành: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN IV, phụ lục 5.4)
Dụng cụ, thuốc thử:
- Bản mỏng silicagel G, tráng sẵn của Merck, được hoạt hóa ở 1000C trong 30 phút.
- Ethyl acetat, methanol, ethanol tuyết đối (TT).
- Dung môi triển khai sắc ký: Toluen - ethylacetat (7: 3) - Đèn tử ngoại, bước sóng 254nm và 366nm
Cách tiến hành:
-Dung dịch đối chiếu: Lấy 6,5g bột sâm đại hành, chiết hồi lưu trên cách thủy
với 30ml hỗn hợp ethanol - nước (1:1) trong 1 giờ, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn thu được trong 30ml nước rồi chuyển vào bình gạn, lắc với 40ml ethylacetat. Gạn lấy dịch chiết ethylacetat, cô trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn thu được trong 2ml ethanol tuyệt đối được dung dịch chấm sắc ký.
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi đi được khoảng 12-13cm, lấy bản mỏng ra, để khơ ở nhiệt độ phịng, soi dưới đèn tử ngoại, bước sóng 254nm hoặc 366nm.
Kết quả : Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết phát quang cùng màu, cùng Rf với các vết thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
Định tính câu đằng: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN IV, phụ lục 5.4)
Dụng cụ, thuốc thử:
- Bản mỏng silicagel G, tráng sẵn của Merck, được hoạt hóa ở 1000C trong 30 phút.
- Ethyl acetat, methanol, ethanol tuyết đối (TT).
- Dung môi triển khai sắc ký: Cloroform – methanol – amoniac (7,5: 2,5: 0,5) - Đèn tử ngoại, bước sóng 366nm
Cách tiến hành:
- Dung dịch thử: Dùng dung dịch thử ở phần định tính hy thiêm.
-Dung dịch đối chiếu: Lấy 2g bột câu đằng, chiết hồi lưu trên cách thủy với
30ml hỗn hợp ethanol - nước (1:1) trong 1 giờ, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến
cạn. Hòa cắn thu được trong 30ml nước rồi chuyển vào bình gạn, lắc với 40ml ethylacetat. Gạn lấy dịch chiết ethylacetat, cơ trên cách thủy đến cạn. Hịa cắn thu được trong 2ml ethanol tuyệt đối được dung dịch chấm sắc ký.
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi đi được khoảng 12-13cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phịng, soi dưới đèn tử ngoại, bước sóng 366nm.
Kết quả : Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết phát quang cùng màu, cùng Rf với các vết thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
Định tính thổ phục linh:
Dụng cụ, thuốc thử:
- Bản mỏng silicagel G, tráng sẵn của Merck, được hoạt hóa ở 1000C trong 30 phút.
- Ethyl acetat, ethanol tuyết đối (TT).
- Dung môi triển khai sắc ký: Ethyl acetat – acid oxalic 10% (3:1), lấy lớp trên. - Hiện màu: Hơi amoniac.
Cách tiến hành:
- Dung dịch thử: Lấy 10 viên, cạo bỏ lớp bao ngồi, tán mịn, thêm 100ml nước, đun sơi nhẹ 1 giờ, để nguội, ly tâm. Chuyển dịch ly tâm vào bình gạn, lắc với 40ml ethylacetat. Gạn lấy dịch chiết ethylacetat, cơ trên cách thủy đến cạn. Hịa cắn thu được trong 1ml ethanol tuyệt đối được dung dịch chấm sắc ký.
-Dung dịch đối chiếu: Lấy 1,4g thổ phục linh đã tán nhỏ, thêm 100ml nước, đun sôi
nhẹ 1 giờ, để nguội, lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với 40ml ethylacetat. Gạn lấy dịch chiết ethylacetat, cơ trên cách thủy đến cạn. Hịa cắn thu được trong 1ml
ethanol tuyệt đối được dung dịch chấm sắc ký.
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi đi được khoảng 12-13cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phịng rồi đặt bản mỏng vào bình kín đã bão hòa hơi amoniac cho đến khi hiện rõ vết.
Kết quả : Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết phát quang cùng màu, cùng Rf với các vết thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
4. Định lượng
Tiến hành khảo sát định lượng theo các phương pháp như đã nêu ở mục
Phương pháp nghiên cứu. Kết quả đã lựa chọn phương pháp xác định chất tủa trong hỗn hợp dung môi aceton- diethylether (4:1). Phương pháp định lượng được xây dựng như sau:
Lấy 20 viên, cạo bỏ lớp bao ngoài, cân và xác định khối lượng trung bình viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác khoảng 0,5g bột viên cho vào bình nón dung tích 100ml,
thêm 40ml methanol, lắc siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc vào cốc có mỏ có dung tích 100ml, rửa bình nón và giấy lọc bằng 10ml methanol. Gộp dịch rửa vào cốc có mỏ trên. Cơ dịch chiết methanol trên cách thủy đến còn khoảng 5ml, để nguội. Thêm 50ml hỗn hợp aceton- diethylether (4:1), khuấy đều, để lắng qua đêm ở nhiệt độ 2-
30C. Lọc nhanh tủa vào giấy lọc (đã sấy ở 1050C trong 3 giờ và cân xác định khối lượng). Tráng cốc và tủa bằng 10ml hỗn hợp aceton- diethylether (4:1). Sấy giấy và tủa ở 1050C trong 3 giờ, lấy ra để trong bình hút ẩm 15 phút, cân nhanh xác định khối lượng.
Hàm lượng các chất tủa trong hỗn hợp aceton- diethylether (4:1) trong mỗi viên được tính theo cơng thức:
a x MTB X(g/v) = --------------- P
Trong đó:
a: Khối lượng tủa thu được (g)
MTB: Khối lượng trung bình viên đã loại bỏ lớp bao (g). P: Khối lượng mẫu đem thử (g)
Tiến hành định lượng trên các lô sản phẩm khác nhau. Từ kết quả khảo sát, dự kiến qui định hàm lượng tủa trong hỗn hợp aceton - diethylether (4:1) của viên là không được thấp hơn 0,04g/v.