(TIỂU LUẬN) báo cáo THỰC HÀNH môn THỰC HÀNH VI SINH y học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÔNG Á  BÁO CÁO THỰC HÀNH MƠN: THỰC HÀNH VI SINH Y HỌC Nhóm Phân nhóm Thành viên: 1) Cao Ngọc Tuấn 2) Trần Thị Khánh Tường 3) Huỳnh Thị Vi Đà Nẵng , ngày 21 tháng 03 năm 2022 I Kết phân lập vi khuẩn phương pháp cấy ria? Mục đích thực : Phân lập vi khuẩn Hóa chất, dụng cụ : Hố chất: + Mơi trường BHI + Mẫu vi khuẩn - Dụng cụ: + Đèn cồn + Que cấy vòng + Bật lửa + Đĩa thạch Các bước thực - Đốt que cấy lửa đèn cồn trước lấy mẫu vi khuẩn - Đợi 1-2 phút cho que cấy nguội dần (que cịn nóng làm chết vi khuẩn) lấy mẫu vi khuẩn vừa đủ - Ria ngang que hết 1/3 đĩa thạch (ria sát nhau), sau đốt que cấy - Xoay đĩa, ria lần thẳng góc với đường ria thứ nhất, chồng lên nửa đường ria cuối đường thứ - Xoay đĩa lần cuối, ria ngang chồng lên ½ đường rìa cuối đường thứ Đốt que cấy K ết - đĩa 1, 2, tách vi khuẩn đường số 1, không tách số - Đĩa có tượng lạ, không tách vi khuẩn đường số 2, lại xuất nhóm vi khuẩn lan rộng Hình 1: kết phân lập vi khuẩn phương pháp cấy ria Phân tích kết - Ở đĩa trên, thực thao tác ria mẫu vi khuẩn, đường thứ không chạm đường cấy thứ dẫn đến việc đường cấy thứ không xuất vi khuẩn nên không cấy tách khuẩn lạc đơn - Đặc biệt đĩa thứ 3, đường thứ không cấy vi khuẩn trình làm, sai sót làm rơi khuẩn thạch nên dẫn đến tượng ảnh  Kết luận: đĩa không đạt yêu cầu II Kết phân lập vi khuẩn phương pháp cấy truyền ? Mục đích thực hiện: Khảo sát sinh hóa vi sinh vật ban đầu sau trình truyền vi sinh vật từ môi trường sang môi trường khác, bảo quản, nhân giống Hóa chất, dụng cụ Hố chất: + Vi khuẩn E coli +Đĩa petri chứa thạch có mơi trường BHIA - Dụng cụ: + Que cấy vòng + Đĩa petri vô khuẩn + Đèn cồn + Găng tay cao su Các bước thực - Đốt que cấy lửa đèn cồn trước lấy mẫu vi khuẩn - Đợi 1-2 phút cho que cấy nguội dần (que cịn nóng làm chết vi khuẩn) lấy khuẩn lạc tăng sinh môi trường BHI lượng vừa đủ - Ria ngang que hết 1/3 đĩa thạch, sau đốt que cấy - Xoay đĩa, ria lần thẳng góc với đường ria thứ nhất, chồng lên nửa đường ria cuối đường thứ - Xoay đĩa lần cuối, ria ngang chồng lên ½ đường rìa cuối đường thứ - Đốt đỏ que cấy Kết Hình 2: Kết phân lập vi khuẩn phương pháp cấy truyền Phân tích kết - Cả đĩa khơng đạt yêu cầu - Ở đĩa Vi cấy: lượng vi khuẩn dày đặc lấy lượng vi khuẩn mẫu nhiều Đường cấy số hết nửa đĩa, vi khuẩn không tách - Đĩa Tường cấy: Đường cấy số tương đối đạt yêu cầu, nhiên đường cấy thứ 2, thứ không thấy rõ III Kết thử nghiệm môi trường MR-VP, SIM, simmon citrat: Mục đích thực - Thử nghiệm MR-VP khảo sát khả lên men sinh acetoin vi khuẩn - Thử nghiệm khả sử dụng Citrate nguồn carbon vi khuẩn - Thử ngiệm SIM: khảo sát tính di động vi khuẩn Hóa chất, dụng cụ - Hóa chất: Mơi trường: MR-VP, simmon citrate agar ,SIM; vi khuẩn E.coli phân lập vi khuẩn phương pháp cấy ria - Dụng cụ: đèn cồn, găng tay y tế, que cấy thẳng, que cấy vòng Các bước thực Thử nghiệm MR-VP:  Đốt que cấy vòng, làm nguội, dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn kết thu từ phương pháp phân lập vi khuẩn  Bỏ vi khuẩn vào mơi trường MR-VP sau lắc cho vi khuẩn tan  Đốt đỏ que cấy  Đợi 20 phút sau nhận xét Thử nghiệm Simmon citrate agar:  Đốt que cấy vòng, làm nguội, dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn kết thu từ phương pháp phân lập vi khuẩn  Cấy vi khuẩn vào môi trường simmon citratte agar lên mặt môi trường theo đường zig-zag  Đốt đỏ que cấy  Đem ủ nhiệt độ 37℃ tròng vòng 24h - Thử nghiệm SIM:  Đốt que cấy thẳng, làm nguội, dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn kết thu từ phương pháp phân lập vi khuẩn  Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào khối thạch tròn rút que cấy theo đường cấy thẳng để tránh làm rách thạch  Đốt đỏ que cấy  Đem ủ nhiệt độ 37℃ trịng vịng 24h Kết Hình 3: Kết thử ngiệm môi trường Simmon citrat, SIM MR-VP Phân tích kết A Mơi trường MR - VP: - Nếu vi khuẩn phản ứng dương tính (+) bề mặt môi trường chuyển sang màu nâu đỏ, phản ứng âm tính (-) bề mặt mơi trường khơng thay đổi màu Từ hình ảnh nhóm, thấy môi trường VP không bị thay đổi màu Kết luận: Phản ứng âm tính (-) Cho thấy vi khuẩn E.coli khơng sinh acetoin q trình lên men đường glucose B Môi trường Simmon citrat agar: - Theo lí thuyết vi khuẩn phản ứng dương tính mơi trường chuyển sang màu xanh lam( xanh dương), phản ứng âm tính mơi trường khơng thay đổi màu( giữ nguyên màu xanh rêu cũ) - Từ ảnh nhóm mơi trường khơng bị thay đổi màu chứng tỏ vi khuẩn E.coli không phản ứng với môi trường Simmon citrat agar Kết luận : phản ứng âm tính, vi khuẩn E.coli khơng sử dụng citrat nguồn carbon vi khuẩn C Môi trường SIM - Trên môi trường sim ta khảo sát khả di động vi khuẩn - Theo lý thuyết vi khuẩn phản ứng dương tính vi khuẩn di chuyển phía, phản ứng âm tính vi khuẩn im chỗ - Từ hình ảnh, ta thấy vi khuẩn E.coli di chuyển phía (dương tính) Đúng với lí thuyết đưa Kết luận: phản ứng dương tính, nhóm thực thao tác kết theo lý thuyết IV Kết thử nghiệm mơi trường KIA Mục đích thực Mơi trường KIA lúc phát khả sử dụng đường (glucose, lactose) khả sử dụng acid amin chứa lưu huỳnh sinh gas Hoá chất dụng cụ: - Đèn cồn, bật lửa, que cấy nhọn, khuẩn lạc Các bước thực - Vi khuẩn khảo sát cấy lần + Lần 1: Dùng que cấy vòng cấy mặt lớp thạch nghiêng theo đường zigzac + Lần 2: Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào khối thạch tròn đường cấy thẳng rút que cấy theo đường cấy thẳng để tránh làm rách thạch 4.Kết quả: - Theo lý thuyết kết gồm phần: + Phần thạch trong: đọc phản ứng sử dụng glucose: + màu vàng, màu đỏ, sinh ga có nứt thạch + Phần thạch nghiêng: Đọc phản ứng sử dụn lactose: + màu vàng, màu đỏ + Vùng tiếp giáp hai phần: Đọc phản ứng sinh H2S, dương tính có màu đen - Lọ 1,2,4,5 có sinh ga lọ 1,2,3,4,5 có sử dường glucose lactose Hình 4: Kết thử nghiệm mơi trường KIA Phân tích kết - Phần thạch nghiêng: bắt màu vàng (+) → phản ứng có sử dụng lactose - Vùng thạch trịn: bắt màu vàng (+) → phản ứng có sử dụng glucose - Vùng tiếp giáp phần: khơng có màu đen (-) → không sinh H2S - Cả ống ta có có tượng nứt thạch, chứng tỏ có sinh gas xảy - Ở vùng thạch nghiêng, vi khuẩn mọc lên theo đường cấy thấy di động vi khuẩn Tuy nhiên đường cấy ziczac sát dẫn đến vi khuẩn - Vùng thạch trịn ta khơng thấy khuẩn mọc lan ra, nguyên nhân thao tác cấy chưa thời gian ta đem ủ chưa đủ để vi khuẩn di động mọc lan V Kết phân tích định lượng Mục đích thực : Xác định mật độ vi sinh vật mẫu pha lỗng mẫu, cấy lên đĩa thạch sau đếm khuẩn lạc mọc Hóa chất, dụng cụ : - Mẫu vi khuẩn - Ống nghiệm - Micropipette - Dung dịch NaCl 0,9% - Đèn cồn - Đầu tuýp gắn với micropipette - Đĩa petri thạch môi trường BHA Que vô khuẩn Que cấy vi sinh Các bước thực Dùng micropipet hút ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% vào ống nghiệm (1) Tiến hành pha loãng mẫu: dùng micropipet cho vào hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch muối sinh lý lắc đều, ta có dung dịch có nồng độ 10-1 Sau lấy 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống 9ml nước muối sinh lý ống nghiệm chuẩn bị (1) thu ống nghiệm thứ có nồng độ 10 -2 Tiếp tục lấy 1ml dung dịch 10-2 cho vào dung dịch nước muối sinh lý 0,9% ống nghiệm thứ ta thu dung dịch có nồng độ 10-3, làm tương tự ống nghiệm thứ ta thu dung dịch có nồng độ 10-7 Sau pha xong, dùng micropipet hút 0,1ml dung dịch có nồng độ 10-1 cho vào đĩa petri đựng thạch môi trường BHA dùng que vô khuẩn trải khắp mặt thạch quét vòng quanh đĩa thạch Cứ xong hết đĩa với đĩa cuối dung dịch có nồng độ 10-7 Cuối đem ủ nhiệt độ 37 độ C 24h Kết - Đếm 34 khuẩn lạc đĩa petri đĩa số  Số lượng tế bào dung dịch: Áp dụng công thức: A= A= Với: A: tế bào vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu N: số khuẩn lạc đếm đĩa chọn V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa Fi: độ pha loãng tương ứng Phân tích kết Hình5: Kết phân tích định lượng VI Kết kháng sinh đồ, MIC Mục đích thực - Dùng để xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh thử nghiệm vi khuẩn gây bệnh, có nghĩa phát đề kháng kháng sinh vi khuẩn thử nghiệm Kháng sinh có tác dụng ức chế tiêu diệt vi khuẩn cách đặc hiệu Hóa chất, dụng cụ - Hóa chất: Đĩa thạch có mơi trường MHA, vi khuẩn E.coli phân lập vi khuẩn phương pháp cấy ria, nước muối sinh lý, 12 giấy kháng sinh khác - Dụng cụ: Đèn cồn, găng tay y tế, ống ngiệm có nút bơng, que cấy vô khuẩn, pipet nhựa Các bước thực Bư ớc 1: Pha loãng vi khuẩn với nước muối sinh lý đến độ đục chuẩn 0.5 McFarland (1-3.108 vi khuẩn/ml) Bư ớc 2: Trải vi khuẩn: dùng que vô trùng thấm dung dịch chuẩn pha loãng 0,5 McFarland, xoay que thành ông ngiệm để ép cho nước, trải lên mặt đĩa thạch thật kín Khi trải ½ hộp, xoay 60° trải lần 2, xoay hộp 60° trải lần Cuối dùng que bơng qt vịng xung quanh, sát hộp thạch Bư ớc 3: Sau trải vi khuẩn, ấp khô mặt thạch nhiệt độ 37℃ trình 15 phút Bư ớc 4: Đặt kháng sinh: dùng kẹp tiệt khuẩn (đốt lửa đèn cồn, làm nguội), kẹp khoanh giấy đặt lên mặt thạch cho tiếp xúc đều, đĩa thạch đặt loại kháng sinh khác cho khoảng cách kháng sinh đĩa thạch Các kháng sinh cách tối thiểu 2,5 cm cách thành hộp tối thiểu 2cm, không xê dịch kháng sinh sau đặt Chỉ phép đặt bề mặt đĩa thạch khô Bước 5: Ủ nhiệt độ 37℃ 24h Kết Hình 6: Kháng sinh đồ, MIC Phân tích kết Kết thưc kỹ thuật kháng sinh đồ: Trong trình thao tác trải đĩa vi khuẩn E coli chưa trải nên sản phẩm đĩa có đường vệt dài, đo đường kính vịng vơ khuẩn Các giấy kháng sinh trải cách nhau, dễ nhìn dễ dàng đo đường kính vịng vơ khuẩn - Do có nhầm lẫn dẫn đến thất lạc đĩa MHI, nên nhóm thí nghiệm thiếu kháng sinh Cefoxitin, Colistin, Tobramycin với yêu cầu nhóm thực hành khác Số đĩa thí nghiệm Kí Ac Đĩa Ci Cz M Đĩa Cu Im Kn Đĩa En Ge ... c? ?y: lượng vi khuẩn d? ?y đặc l? ?y lượng vi khuẩn mẫu nhiều Đường c? ?y số hết nửa đĩa, vi khuẩn không tách - Đĩa Tường c? ?y: Đường c? ?y số tương đối đạt y? ?u cầu, nhiên đường c? ?y thứ 2, thứ không th? ?y. ..  Kết luận: đĩa không đạt y? ?u cầu II Kết phân lập vi khuẩn phương pháp c? ?y truyền ? Mục đích thực hiện: Khảo sát sinh hóa vi sinh vật ban đầu sau q trình truyền vi sinh vật từ môi trường sang... khơng sinh H2S - Cả ống ta có có tượng nứt thạch, chứng tỏ có sinh gas x? ?y - Ở vùng thạch nghiêng, vi khuẩn mọc lên theo đường c? ?y th? ?y di động vi khuẩn Tuy nhiên đường c? ?y ziczac sát dẫn đến vi