Tổng hợp và xác định hoạt tính sinh học của các dẫn xuất phenothazine mới dựa trên dị vòng 1,3 thiazole

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHẠM THÁI PHƢƠNG TỔNG HỢP VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT PHENOTHIAZINE MỚI DỰA TRÊN DỊ VÒNG 1,3-THIAZOLE Chuyên ngành : KỸ THUẬT HÓA HỌC Mã chuyên ngành : 60520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NĂM 2017 Cơng trình đƣợc hồn thành Trƣờng Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Trần Nguyễn Minh Ân Ký tên: Ngƣời phản iện 1: PGS.TS Lê Thị Thanh Hƣơng Ngƣời phản iện 2: TS Cao Xuân Thắng Luận v n thạc s đƣợc ảo vệ Hội đồng ch m ảo vệ Luận v n thạc s Trƣờng Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày tháng n m 2017 Thành phần Hội đồng đánh giá luận v n thạc s gồm: PGS.TS Nguyễn V n Cƣờng - Chủ tịch hội đồng PGS.TS Lê Thị Thanh Hƣơng - Phản iện TS Cao Xuân Thắng - Phản iện PGS.TS Đoàn V n Hồng Thiện - Ủy viên TS V n Thanh Khuê - Thƣ ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng ch m ảo vệ luận v n thạc s ) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC BỘ CƠNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Phạm Thái Phƣơng MSHV: 15118771 Ngày, tháng, n m sinh: 24/01/1987 Nơi sinh: Bình Định Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã chuyên ngành: 60520301 I TÊN ĐỀ TÀI: Tổng hợp xác định hoạt tính sinh học dẫn xu t phenothiazine dựa dị vòng 1,3 thiazole NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Tổng hợp xác định c u trúc thử nghiệm hoạt tính sinh học phịng thí nghiệm (in-vitro) hợp ch t dị vịng 1,3-thiazole mang nhóm vị trí 2,4 từ nguyên liệu an đầu phenothiazine Trên sở thí nghiệm sinh học, tìm kiếm hợp ch t có hoạt tính kháng khuẩn, kháng n m kháng ung thƣ II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo QĐ số 2413/QĐ-ĐHCN ngày 15/12/2016 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 15/12/2017 IV NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trần Nguyễn Minh Ân Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 … NGƢỜI HƢỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƢỞNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC LỜI CẢM ƠN Luận v n thạc s chuyên ngành Kỹ thuật hóa học với đề tài “Tổng hợp xác định hoạt tính sinh học dẫn xu t phenothiazine dựa dị vòng 1,3 thiazole” kết q trình cố gắng khơng ngừng ản thân đƣợc giúp đỡ, động viên khích lệ q Thầy Cơ, ạn è đồng nghiệp ngƣời thân Qua trang viết xin gửi lời cảm ơn tới ngƣời giúp đỡ thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Tơi xin tỏ lịng kính trọng iết ơn sâu sắc giảng viên TS Trần Nguyễn Minh Ân trực tiếp tận tình hƣớng dẫn nhƣ cung c p tài liệu thông tin khoa học cần thiết cho luận v n Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo trƣờng Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh, khoa Cơng nghệ Hóa học, phịng Quản lý Sau đại học tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu khoa học Cuối xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp, đơn vị công tác giúp đỡ trình học tập thực Luận v n Học viên Phạm Thái Phƣơng i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Trong nghiên cứu này, từ ch t an đầu phenothiazine, tác giả tổng hợp ch t (1)-(4) (5a-e) Trong ch t (1)-(4) đƣợc cơng ố, (5a-e) dị vịng 1,3 thiazole mang nhóm vị trí 2,4 hợp ch t hoàn toàn Các hợp ch t (1)-(4) đƣợc phân tích FT-IR, 1H-13C NMR DEPT Các sản phẩm (5a-e) đƣợc phân tích FT-IR, 1H-13C NMR, DEPT MS Sau tổng hợp sản phẩm trung gian (4) (5a-e) đƣợc tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng n m, kháng ung thƣ Hợp ch t trung gian (4) thể hoạt tính kháng tế ung thƣ vú MDA-MB-231 Từ khóa: phenothiazine, 1,3 thiazole, kháng ung thƣ, kháng khuẩn, kh n n m ii ABSTRACT In this study, compounds (1)-(4) and (5a-e) were synthesized from phenothiazine Compounds (1)-(4) have been published, (5a-e) are heterocyclic 1,3-thiazole substitutes at position 2,4 are completely new compounds Compounds (1)-(4) were analyzed by FT-IR, 1H-13C NMR and DEPT The products (5a-e) were analyzed for FT-IR, 1H-13C NMR, DEPT and MS After synthesis, intermedia products (4) and (5a-e) were tested activities for anti-bacterial, anti-fungal, anti-cancer The intermedia compound (4) exhibited MDA-MB-23 breast cancer cell activity invitro Keywords: phenothiazine, 1,3 thiazole, anti-cancer, anti-bacterial, anti-fungal iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu ản thân Các kết nghiên cứu kết luận luận v n trung thực, không chép từ nguồn dƣới t kỳ t kỳ hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu đƣợc thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định TP HCM, ngày 10 tháng 01 n m 2017 Học viên Phạm Thái Phƣơng iv MỤC LỤC MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH ẢNH ix DANH MỤC BẢNG BIỂU xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiv Đặt v n đề .1 Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận phƣơng pháp nghiên cứu .3 Ý ngh a thực tiễn đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Dẫn xu t 1,3-thiazole 1.1.1 Hóa học dị vịng thiazole 1.1.2 Phƣơng pháp tổng hợp dẫn xu t thiazole 1.1.3 Hoạt tính sinh học thiazole 1.1.4 Các dƣợc phẩm chứa nhân thiazole 12 1.2 Phenothiazine 14 1.2.1 Giới thiệu phenothiazine .14 1.2.2 Hoạt tính sinh học phenothiazine .15 1.3 Các nghiên cứu dẫn xu t thiazole 16 CHƢƠNG TỔNG HỢP THỰC NGHIỆM 27 2.1 Phản ứng phenothiazine ethyl hóa 29 2.1.1 Hóa ch t dụng cụ 29 2.1.2 Thực phản ứng 30 2.1.3 Thu hồi làm ch t rắn 31 2.2 Phản ứng carbonyl hóa .33 2.2.1 Hóa ch t dụng cụ 33 2.2.2 Thực phản ứng 34 2.2.3 Thu hồi làm ch t rắn 35 2.3 Phản ứng brom hóa .37 2.3.1 Hóa ch t dụng cụ 37 2.3.2 Thực phản ứng 38 2.3.3 Thu hồi làm ch t rắn 39 2.4 Phản ứng hình thành bromoethyl phenothiazine thiosemicarbazone 40 2.4.1 Hóa ch t dụng cụ 40 2.4.2 Thực phản ứng 41 2.4.3 Thu hồi làm ch t rắn 42 v 2.5 Phản ứng với dẫn xu t -bromoketone 43 2.5.1 Phản ứng với 1-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-bromoethanone (a) .44 2.5.2 Phản ứng với 2-Bromo-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethanone (b) 46 2.5.3 Phản ứng với 2-Bromo-4′-hydroxy-3′-nitroacetophenone (c) 48 2.5.4 Phản ứng với 2-Bromo-1-(3,4-dihydro-2H-1,5-benzodioxepin-7-yl) ethanone (d) .50 2.5.5 Phản ứng với 4-Fluoro-3-(trifluoromethyl)phenacyl bromide (e) 52 2.6 Kiểm tra xác định c u trúc 54 2.6.1 Phƣơng pháp FT-IR 54 2.6.2 Phƣơng pháp phổ NMR 54 2.6.3 Phƣơng pháp phổ MS 54 2.7 Thử nghiệm hoạt tính sinh học 54 2.7.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng ung thƣ 83-85 55 2.7.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, n m 56 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 58 3.1 Hiệu xu t phản ứng 58 3.1.1 Phản ứng ethyl hóa phenothiazine 58 3.1.2 Phản ứng ethyl phenothiazine carbonyl 58 3.1.3 Phản ứng Bromethyl phenothiazine carbonyl 58 3.1.4 Phản ứng thiosemicarbazone hóa 59 3.1.5 Phản ứng với bromoketon a .59 3.1.6 Phản ứng với bromoketon b 59 3.1.7 Phản ứng với bromoketon c .60 3.1.8 Phản ứng với bromoketon d 60 3.1.9 Phản ứng với bromoketon e .60 3.2 Kết phân tích hóa lý .61 3.2.1 Hợp ch t (1) .61 3.2.2 Hợp ch t (2) .63 3.2.3 Hợp ch t (3) .65 3.2.4 Hợp ch t (4) .68 3.2.5 Hợp ch t (5a) 71 3.2.6 Hợp ch t (5b) 75 3.2.7 Hợp ch t (5c) 79 3.2.8 Hợp ch t (5d) 82 3.2.9 Hợp ch t (5e) 87 3.3 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học .90 3.3.1 Kết hoạt tính kháng ung thƣ 90 3.3.2 Kết hoạt tính kháng khuẩn, n m .92 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93 vi Kết tổng hợp thử nghiệm hoạt tính sinh học .93 Kiến nghị .94 PHỤ LỤC 103 Phụ lục 1.1 Phổ FT-IR hợp ch t (1) 103 Phụ lục 1.2 Phổ 1H NMR hợp ch t (1) 104 Phụ lục 1.3 Phổ 13C NMR hợp ch t (1) 107 Phụ lục 1.4 Phổ DEPT hợp ch t (1) 110 Phụ lục 2.1 Phổ FT-IR hợp ch t (2) 112 Phụ lục 2.2 Phổ 1H NMR hợp ch t (2) 113 Phụ lục 2.3 Phổ 13C NMR hợp ch t (2) 116 Phụ lục 2.4 Phổ DEPT hợp ch t (2) 119 Phụ lục 3.1 Phổ FT-IR hợp ch t (3) 121 Phụ lục 3.2 Phổ 1H NMR hợp ch t (3) 122 Phụ lục 3.3 Phổ 13C NMR hợp ch t (3) 125 Phụ lục 3.4 Phổ DEPT hợp ch t (3) 128 Phụ lục 4.1 Phổ FT-IR hợp ch t (4) 130 Phụ lục 4.2 Phổ 1H NMR hợp ch t (4) 131 Phụ lục 4.3 Phổ 13C NMR hợp ch t (4) 134 Phụ lục 4.4 Phổ DEPT hợp ch t (4) 137 Phụ lục 5.1 Phổ FT-IR hợp ch t 5a 139 Phụ lục 5.2 Phổ 1H NMR hợp ch t 5a 140 Phụ lục 5.3 Phổ 13C NMR hợp ch t 5a 143 Phụ lục 5.4 Phổ DEPT hợp ch t 5a 146 Phụ lục 5.5 Phổ MS hợp ch t 5a .148 Phụ lục 6.1 Phổ FT-IR hợp ch t 5b .149 Phụ lục 6.2 Phổ 1H NMR hợp ch t 5b 150 Phụ lục 6.3 Phổ 13C NMR hợp ch t 5b 153 Phụ lục 6.4 Phổ DEPT hợp ch t 5b .156 Phụ lục 6.5 Phổ MS hợp ch t 5b .158 Phụ lục 7.1 Phổ FT-IR hợp ch t 5c 159 Phụ lục 7.2 Phổ 1H NMR hợp ch t 5c 160 Phụ lục 7.3 Phổ 13C NMR hợp ch t 5c 163 Phụ lục 7.4 Phổ DEPT hợp ch t 5c 166 Phụ lục 7.5 Phổ MS hợp ch t 5c .168 Phụ lục 8.1 Phổ FT-IR hợp ch t 5d .169 Phụ lục 8.2 Phổ 1H NMR hợp ch t 5d 170 Phụ lục 8.3 Phổ 13C NMR hợp ch t 5d 173 Phụ lục 8.4 Phổ DEPT hợp ch t 5d .176 Phụ lục 8.5 Phổ MS hợp ch t 5d .178 vii water (out) water (in) Hình 2.26 Hệ thống phản ứng với -bromoketone (a-e) 2.5.1 Phản ứng với 1-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-bromoethanone (a) Hình 2.27 Phƣơng trình phản ứng với bromoketone a 2.5.1.1 Hóa chất sử dụng Toàn ộ khối lƣợng ch t rắn thể tích dung mơi đƣợc tính tốn xác Ch t rắn đƣợc cân ằng cân phân tích ( ốn số thập phân), dung mơi đƣợc l y xác ằng ình định mức Số liệu phản ứng cho 0.5 g tác ch t đầu (4) theo Bảng 2.7 44 Bảng 2.7 Số liệu thực nghiệm cho phản ứng với -bromoketone a Đơn vị Khối lƣợng g Khối lƣợng phân tử g/mol Số mol mol Tỉ lệ Hợp chất (4) -bromoketone a CH3COONa EtOH 0.5 0.3580 0.3 - 407.351 243.05 82.2 - 0.0012274 0.0014728 0.003682 - 1.2 - Tỷ trọng g/mL - - - - Thể tích mL - - - 10 2.5.1.2 Thực phản ứng Hòa tan 0.5 g ch t rắn (4) 0.358 g -bromoketone a ằng 10 mL EtOH ình cầu cổ 50 mL Thêm 0.3 g CH3COONa, tiến hành gia nhiệt nhiệt độ 65-70 o C khu y liên tục Trong suốt trình, phản ứng đƣợc theo dõi kiểm ằng sắt ký ảng mỏng Sau thời gian 11 khu y gia nhiệt, thông qua việc kiểm tra sắc ký ảng mỏng (ứng với hệ dung môi phân cực EA:Hex=3:7) nhận th y lƣợng tác ch t an đầu (4) -bromoketone a hết (Hình 2.29) Dừng phản ứng thu hồi ch t rắn Hình 2.28 Sắc ký bảng mỏng phản ứng với bromoketone sau 11 khu y Vết: (1) -romoketone a, (2) Tác ch t đầu, (3) Hệ phản ứng 2.5.1.3 Thu hồi làm chất rắn Kết thúc phản ứng, tiến hành lọc chân không để thu ch t rắn Ch t rắn đƣợc làm ằng phƣơng pháp kết tinh dung môi CHCl2 Lọc thu hồi ch t rắn làm khơ sản phẩm ằng ình hút chân không khối lƣợng không đổi thu đƣợc 0.62 g ch t rắn màu xám (5a) 45 Hình 2.29 Sắc ký bảng mỏng ch t rắn thu hồi sau xử lý Vết: (1) -bromoketone a,(2) Tác ch t đầu, (3) Ch t rắn thu hồi 2.5.2 Phản ứng với 2-Bromo-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethanone (b) Hình 2.30 Phƣơng trình phản ứng với -bromoketone b 2.5.2.1 Hóa chất sử dụng Tồn ộ khối lƣợng ch t rắn thể tích dung mơi đƣợc tính tốn xác Ch t rắn đƣợc cân ằng cân phân tích ( ốn số thập phân), dung mơi đƣợc l y xác ằng ình định mức Số liệu phản ứng cho 0.5 g tác ch t đầu (4) theo Bảng 2.8 46 Bảng 2.8 Số liệu cho phản ứng với -bromoketone b Đơn vị Khối lƣợng g Khối lƣợng Phân tử g/mol Số mol mol Tỉ lệ Hợp chất (4) -bromoketone b CH3COONa EtOH 0.5 0,361 0.3 - 407.351 245.07 82.2 - 0.0012274 0.0014728 0.003682 - 1.2 - Tỷ trọng g/mL - - - - Thể tích mL - - - 10 2.5.2.2 Thực phản ứng Hòa tan 0.5 g ch t rắn (4) 0.36 g -bromoketone b ằng 10 mL EtOH bình cầu cổ 50 mL Thêm 0.3 g CH3COONatiến hành gia nhiệt nhiệt độ 65-70 oC khu y liên tục Trong suốt trình, phản ứng đƣợc theo dõi kiểm ằng sắt ký ảng mỏng Sau thời gian 11 khu y gia nhiệt, thông qua việc kiểm tra sắc ký ảng mỏng (ứng với hệ dung môi phân cực EA:Hex = 3:7) nhận th y lƣợng tác ch t an đầu (4) -bromoketone b hết (Hình 2.32) Dừng phản ứng thu hồi sản phẩm Hình 2.31 Phản ứng -bromoketone b sau 11 khu y (1) Tác ch t đầu, (2) -bromoketon b, (3) Hệ phản ứng 2.5.2.3 Thu hồi làm chất rắn Kết thúc phản ứng, tiến hành lọc chân không để thu ch t rắn Ch t rắn đƣợc làm ằng phƣơng pháp kết tinh dung môi CHCl2 Lọc thu hồi ch t rắn làm khơ sản phẩm ằng ình hút chân không khối lƣợng không đổi thu đƣợc 47 0.637 g ch t rắn màu xám (5b) Hình 2.32 Sắc ký bảng mỏng ch t rắn thu hồi sau xử lý Vết: (1) Tác ch t đầu, (2) -Bromoketone b, (3) Ch t rắn thu hồi 2.5.3 Phản ứng với 2-Bromo-4′-hydroxy-3′-nitroacetophenone (c) Hình 2.33 Phƣơng trình phản ứng với -bromoketone c 2.5.3.1 Hóa chất sử dụng Tồn ộ khối lƣợng ch t rắn thể tích dung mơi đƣợc tính tốn xác Ch t rắn đƣợc cân ằng cân phân tích ( ốn số thập phân), dung mơi đƣợc l y xác ằng ình định mức Số liệu phản ứng cho 0.5 g tác ch t đầu (4) theo Bảng 2.9 48 Bảng 2.9 Số liệu thực nghiệm cho phản ứng với -bromoketone c Đơn vị Khối lƣợng g Khối lƣợng phân tử g/mol Số mol mol Tỉ lệ Hợp chất (4) -bromoketone c CH3COONa EtOH 0.5 0,383 0.3 - 407.351 260.04 82.2 - 0.0012274 0.0014728 0.003682 - 1.2 - Tỷ trọng g/mL - - - - Thể tích mL - - - 10 2.5.3.2 Thực phản ứng Hòa tan 0.5 g ch t rắn (4) 0.38 g -bromoketone c ằng 10 mL EtOH bình cầu cổ 50 mL Thêm 0.3 g CH3COONa, tiến hành gia nhiệt nhiệt độ 65-70 oC khu y liên tục Trong suốt trình, phản ứng đƣợc theo dõi kiểm ằng sắt ký ảng mỏng Sau thời gian 10 khu y gia nhiệt, thông qua việc kiểm tra sắc ký ảng mỏng (ứng với hệ dung môi phân cực 30% ethyl acetate 70% n-hexane) ta nhận th y lƣợng tác ch t an đầu (4) -bromoketone c hết (Hình 2.35) Dừng phản ứng thu hồi ch t rắn Hình 2.34 Hình ảnh sắc ký bảng mỏng phản ứng -bromoketone c sau Vết: (1) Tác ch t đầu, (2) -bromoketone c, (3) Hệ phản ứng 2.5.3.3 Thu hồi làm sản phẩm Kết thúc phản ứng, tiến hành lọc chân không để thu ch t rắn Ch t rắn đƣợc làm ằng phƣơng pháp kết tinh dung môi CHCl2 Lọc thu hồi ch t rắn làm 49 khô sản phẩm ằng ình hút chân khơng khối lƣợng không đổi thu đƣợc 0.637 g ch t rắn màu xám (5c) Hình 2.35 Xử lý sản phẩm -bromoketone c CHCl2 Vết: (1) Ch t rắn trƣớc xử lý, (2) Ch t rắn sau xử lý (3) Dung mơi 2.5.4 Phản ứng với 2-Bromo-1-(3,4-dihydro-2H-1,5-benzodioxepin-7-yl) ethanone (d) Hình 2.36 Phƣơng trình phản ứng với -bromoketone d 2.5.4.1 Hóa chất sử dụng Toàn ộ khối lƣợng ch t rắn thể tích dung mơi đƣợc tính tốn xác Ch t rắn đƣợc cân ằng cân phân tích ( ốn số thập phân), dung mơi đƣợc l y xác ằng ình định mức Số liệu phản ứng cho 0.5 g tác ch t đầu (4) theo Bảng 2.10 50 Bảng 2.10 Số liệu thực nghiệm cho phản ứng với -bromoketone d Đơn vị Khối lƣợng g Khối lƣợng phân tử g/mol Số mol mol Tỉ lệ Thể tích mL Hợp chất (4) -Bromoketone d CH3COONa EtOH 0.5 0,3328 0.3 - 407.351 271.11 82.2 - 0.0012274 0.0012274 0.003682 - 1 - - - - 10 2.5.4.2 Thực phản ứng Hòa tan 0.5 g ch t rắn (4) 0,3328 g -bromoketone d ằng 10 mL EtOH ình cầu cổ 50 mL Thêm 0.3 g CH3COONa, tiến hành gia nhiệt lên nhiệt độ 6570 oC khu y liên tục Trong suốt trình, phản ứng đƣợc theo dõi kiểm ằng sắt ký ảng mỏng Sau thời gian 10 khu y gia nhiệt, phản ứng kết thúc thông qua việc kiểm tra sắc ký ảng mỏng (ứng với hệ dung môi phân cực 30% ethyl acetate 70% nhexane) ta nhận th y lƣợng tác ch t an đầu (4) -bromoketone d hết (Hình 2.38) Dừng phản ứng thu hồi ch t rắn Hình 2.37 Hình sắc ký bảng mỏng phản ứng với -bromoketone sau 10 Vết: (1) Tác ch t đầu, (2) -bromoketone d, (3) Hệ phản ứng 2.5.4.3 Thu hồi làm chất rắn Kết thúc phản ứng, tiến hành lọc chân không để thu ch t rắn Ch t rắn đƣợc làm ằng phƣơng pháp kết tinh dung môi CHCl2 Lọc thu hồi ch t rắn làm 51 khơ sản phẩm ằng ình hút chân khơng khối lƣợng không đổi thu đƣợc 0.602 g ch t rắn màu xám (5d) Hình 2.38 Hình sắc ký bảng mỏng xử lý ch t rắn CHCl2 Vết: (1) Tác ch t đầu, (2) Ch t rắn trƣớc xử lý (3) Ch t rắn sau xử lý 2.5.5 Phản ứng với 4-Fluoro-3-(trifluoromethyl)phenacyl bromide (e) Hình 2.39 Phƣơng trình phản ứng với -bromoketone e 2.5.5.1 Hóa chất sử dụng Toàn ộ khối lƣợng ch t rắn thể tích dung mơi đƣợc tính tốn xác Ch t rắn đƣợc cân ằng cân phân tích ( ốn số thập phân), dung mơi đƣợc l y xác ằng ình định mức Số liệu phản ứng cho 0.5 g tác ch t đầu (4) theo Bảng 2.11 52 Bảng 2.11 Số liệu cho phản ứng với -bromoketone e Đơn vị Khối lƣợng g Khối lƣợng phân tử g/mol Số mol mol Tỉ lệ Thể tích mL Hợp chất (4) -bromoketon e CH3COONa EtOH 0.5 0,3849 0.3 - 407.351 285.04 82.2 - 0.0012274 0.0013502 0.003682 - 1.1 - - - - 10 2.5.5.2 Thực phản ứng Hòa tan 0.5 g ch t rắn (4) 0,3849 g -bromoketone e ằng 10 mL EtOH ình cầu cổ 50 mL Thêm 0.3 g CH3COONa, tiến hành gia nhiệt lên nhiệt độ 6570 oC khu y liên tục Trong suốt trình, phản ứng đƣợc theo dõi kiểm ằng sắt ký ảng mỏng Sau thời gian 10 khu y gia nhiệt, phản ứng kết thúc thông qua việc kiểm tra sắc ký ảng mỏng (ứng với hệ dung môi phân cực EA:Hex = 3:7) (Hình 2.41) nhận th y tác ch t an đầu (4) -bromoketone e hết Dừng phản ứng thu hồi ch t rắn Hình 2.40 Hình sắc ký bảng mỏng phản ứng với -bromoketone e sau 10 Vết: (1) Tác ch t đầu, (2) -bromoketone e, (3) Hệ phản ứng 2.5.5.3 Thu hồi làm chất rắn Kết thúc phản ứng, tiến hành lọc chân không để thu ch t rắn Ch t rắn đƣợc làm ằng phƣơng pháp kết tinh dung môi CHCl2 Lọc thu hồi ch t rắn làm 53 khơ sản phẩm ằng ình hút chân khơng khối lƣợng không đổi thu đƣợc 0.55 g ch t rắn màu xám (5e) Hình 2.41 Hình sắc ký bảng mỏng xử lý ch t rắn CHCl2 Vết: (1) Tác ch t đầu, (2) -bromoketone e, (3) Ch t rắn thu hồi 2.6 Kiểm tra xác định cấu trúc 2.6.1 Phương pháp FT-IR Phƣơng pháp xác định phổ FT-IR đƣợc kiểm tra máy The Bruker Tensor 37 FT-IR, trực thuộc khoa Cơng nghệ hóa học, Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh 2.6.2 Phương pháp phổ NMR Phƣơng pháp xác định phổ NMR đƣợc kiểm tra máy NMR: Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, phịng NMR, viện Hóa học, viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng QuốcViệt, Cầu Gi y, Hà Nội 2.6.3 Phương pháp phổ MS Kiểm tra phổ khối lƣợng (MS) đƣợc thực theo phƣơng pháp phun mù điện, thiết ị ESI-MS: microOTOF-Q II 10187 phòng phân tích, trực thuộc Viện hóa học - Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, số 01 Mạc Đ nh Chi, phƣờng Bến Nghé, Quận 1, TP Hồ Chí Minh 2.7 Thử nghiệm hoạt tính sinh học Các hợp ch t trung gian (4) hợp ch t sản phẩm (5a-e) đƣợc kiểm tra hoạt tính sinh học theo phƣơng pháp thử độc tính tế sàng lọc, Bộ mơn hóa dƣợc Đại 54 học Y dƣợc TP Hồ Chí Minh, số 41 Đinh Tiên Hồng - phƣờng Bến Nghé - quận - Tp Hồ Chí Minh 2.7.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư 83-85 2.7.1.1 Khảo sát độc tế bào in vitro theo phương pháp MTT Tiến hành: Dung dịch hợp ch t đƣợc pha DMSO nồng khác nhau, ch t tinh khiết tổng hợp nồng độ 10 mM Dung dịch tổng hợp đƣợc ảo quản nhiệt độ -20oC, rã đơng pha lỗng mơi trƣờng để đạt nồng độ khảo sát, vô trùng ằng cách chiếu UV 60 phút trƣớc dùng Tế ung thƣ vú MDA-MB-231 đƣợc nuôi môi trƣờng EMEM, ổ sung 10% FCS, L-glutamin mM, penicilin 100 mL, streptomycin 100 µg/mL Tế đƣợc ni ình ni c y 75 cm2, ủ 37oC, 5% CO2 Khi tế đạt trạng thái đông tụ (độ phủ 70-80%), thu tế chia vào đ a nuôi c y 96 giếng mật độ x 104 tế ào/cm2 Ủ 37 oC, 5% CO2 qua đêm để tế ám lên ề mặt đ a nuôi c y phát triển ổn định Xử lý tế với mẫu thử nồng độ khác Mẫu pha DMSO với nồng độ tƣơng đƣơng với nồng độ cuối mơi trƣờng (1%, 0,5%) paclitaxel 10 µM (đối với ch t phân lập) đƣợc tiến hành song song Những mẫu có nồng độ DMSO dƣới 0,25% (v/v) không ảnh hƣởng đến tỷ lệ sống tế nên sử dụng số liệu mẫu môi trƣờng không xử lý Thực mẫu cho điều kiện nuôi c y Sau thời gian xử lý, xác định tỷ lệ tế sống ằng phƣơng pháp MTT 2.7.1.2 Khảo sát tỷ lệ tế bào sống phương pháp MTT Nguyên tắc: Tỷ lệ tế sống đƣợc xác định nhờ hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) ty thể có tế sống SDH chuyển MTT [3(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium romid)] thành tinh thể formazan tan isopropanol acid hóa tạo dung dịch màu tím, đo OD 570 nm Giá trị OD phản ánh số lƣợng tế sống mẫu nuôi c y Thao tác: Tế HepG2 đƣợc nuôi c y xử lý đ a 96 giếng, ủ 37 °C, 5% 55 CO2 thời gian thích hợp (tùy theo thí nghiệm) Loại ỏ mơi trƣờng ni c y, ổ sung mơi trƣờng khơng có FCS chứa 0.05 mg/mL MTT, ủ 37 °C, 5% CO2 Bỏ mơi trƣờng có MTT, hịa tinh thể formazan tạo thành isopropanol acid hóa Lắc rung 10 phút nhiệt độ phòng Đo OD 570 nm máy đọc microplate MultiskanTM 2.7.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, nấm Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, n m đƣợc thực phịng Cơng nghệ sinh học trực thuộc trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, theo phƣơng pháp Kirby Bauer [86] 2.7.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn Các vi khuẩn thử nghiệm đƣợc nuôi môi trƣờng LB Broth đạt đƣợc độ đục 0.5 theo tiêu chuẩn McFarland Dịch vi khuẩn sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn hợp ch t 5a-e Dịch vi khuẩn 0.1mL đƣợc trãi đ a petri chứa môi trƣờng LB Agar theo phƣơng pháp trãi đ a Các đ a gi y th m vô trùng chứa 20 ul dung dịch đƣợc đặt lên bề mặt đ a petri dàn vi khuẩn Bảng 2.12 Môi trƣờng LB (Luria Bertani Medium) STT Nồng độ Tác chất Tryptone 10 g/L Yeast extract g/L NaCl 10 g/L Agar 15-20 g/L Nƣớc c t 1L o Tiếp theo, đ a petri đƣợc để yên C cho dung dịch th m vào môi trƣờng thạch sau đƣợc đem ủ 37 oC 16-18 Đ a kháng sinh Gentamycin (Công ty Alpha Chem, Việt Nam) đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng cho thí nghiệm Đối chứng âm đƣợc thực dung môi DMSO Khả n ng kháng khuần dung dịch B1/B3/MM chủng vi khuẩn đƣợc đo đƣờng kính vịng vơ khuẩn sau 16-18 nuôi ủ 56 Bảng 2.13 Các loại vi khuẩn dùng để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn STT Tên vi khuẩn Gram Bacillus cereus (+) Bacillus subtilis (+) Escherichia coli (-) Salmonella enterica (-) Staphylococcus aureus (+) Pseudomonas aeruginosa (+) 2.7.2.2 Hoạt tính kháng nấm Trƣờng hợp n m men Candida albicans đƣợc thực tƣơng tự nhƣ kiểm tra vi khuẩn với môi trƣờng dinh dƣỡng môi trƣờng Hansen (Bảng 2.14) Đ a kháng sinh Ketoconazole (Công ty Alpha Chem, Việt Nam) đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng cho thí nghiệm Đối chứng âm đƣợc thực dung môi DMSO Bảng 2.14 Môi trƣờng Hansen STT Nồng độ Tác chất Glucose 50.0 g/L Peptone 10.0 g/L K2HPO4 3.0 g/L MgSO4.7H2O 2.0 - 5.0 g/L Agar 20.0 g/L Nƣớc c t 1L Trƣờng hợp n m mốc Fusarium sp Colletotrichum sp đƣợc thực với môi trƣờng dinh dƣỡng môi trƣờng PGA (Bảng 2.15) c y điểm tâm petri Các dung dich hóa ch t đƣợc kiểm tra tƣơng tự nhƣ kiểm tra vi khuẩn Đ a kháng sinh Ketoconazole đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng cho thí nghiệm Đối chứng âm đƣợc thực dung môi DMSO Bảng 2.15 Môi trƣờng PGA (Potato Glucose Agar) STT Nồng độ Tác chất Khoai tây 200 g/L Glucose 20 g/L Agar 20 g/L Nƣớc c t 1L 57 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Hiệu xuất phản ứng 3.1.1 Phản ứng ethyl hóa phenothiazine Khối lƣợng tính theo lý thuyết : 0.076 x 227.0769 = 17.2578 g Khối lƣợng ch t rắn thu đƣợc thực tế qua q trình ethyl hóa 15.17 g 15,17 Vậy hiệu xu t trình : h% = 17,2578 100% = 87,9% 3.1.2 Phản ứng ethyl phenothiazine carbonyl Khối lƣợng theo lý thuyết : 0.044 x 255.072 = 11.223 g Khối lƣợng ch t rắn thu đƣợc thực tế qua q trình carbonyl hóa 8.87 g Vậy hiệu xu t trình : h% = 8.87 11.223 100% = 79.03% 3.1.3 Phản ứng Bromethyl phenothiazine carbonyl Khối lƣợng theo lý thuyết : 0.0235 x 332.98 = 7.825 g Khối lƣợng ch t rắn thu đƣợc thực tế qua q trình brom hóa 7.63 g 58 ... tính sinh học dẫn xu t phenothiazine dựa dị vòng 1,3 thiazole NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Tổng hợp xác định c u trúc thử nghiệm hoạt tính sinh học phịng thí nghiệm (in-vitro) hợp ch t dị vòng 1,3- thiazole. .. sulfone, hai vòng enzene với vòng thơm dị vòng thơm khác [50] Các áo cáo nhà khoa học giới chủ yếu tập trung vào tổng hợp dẫn xu t phenothiazine tiến hành xác định hoạt tính sinh học nhƣ hoạt tính kháng... trúc hợp ch t 22 23 Các nghiên cứu tác giả nƣớc chủ yếu tổng hợp xác định hoạt tính kháng khuẩn kháng n m số dẫn xu t thiazole 71-73, tổng hợp xác hoạt tính kháng viêm dẫn xu t 2-acylamido-thiazole