i BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài Tổng hợp và xác định hoạt tính chống oxy[.]
BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài Tổng hợp xác định hoạt tính chống oxy hóa Tryptophyllin L peptide phương pháp mơ hình thống kê định lượng 3DQSAR kết hợp với thực nghiệm in vitro Mã số đề tài: 21/1H03 Chủ nhiệm đề tài: TS TRẦN THỊ THANH NHÃ Đơn vị thực hiện: KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC TP HỒ CHÍ MINH, 11.2021 i Tp Hồ Chí Minh, … MỤC LỤC MỤC LỤC II DANH MỤC HÌNH ẢNH III DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC PHỤ LỤC VI LỜI CÁM ƠN PHẦN I THÔNG TIN CHUNG CHƯƠNG : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.2 Hiện trạng cơng trình nghiên cứu liên quan đến đề tài 10 1.2.1 Tình hình nghiên cứu quốc tế 10 1.2.2 Tình nghiên cứu nước: 11 1.2.3 Đánh giá kết cơng trình nghiên cứu cơng bố 11 1.3 Mơ hình mối quan hệ định lượng cấu trúc hoạt tính hợp chất (quantitative structure-activity relationship: QSAR) 12 1.3.1 Phương pháp So Sánh Trường Phân Tử (Comparative Molecular Field Analysis, CoMFA) 12 1.3.2 Phương pháp So Sánh Chỉ Số Tương Tự Phân Tử (Comparative Molecular Similarity Indices Analysis, CoMSIA) 15 1.4 Tổng hợp hữu chất mang pha rắn sử dụng kỹ thuật Fmoc 15 1.4.1 Chất (resin) nhóm liên kết (linker) 17 1.4.2 Các nhóm bảo vệ 18 1.4.3 Tác nhân hoạt hóa 20 CHƯƠNG : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 2.1 Phương pháp tính tốn 22 2.1.1 Nguồn liệu, tối ưu hóa cấu trúc xếp chồng phân tử 22 2.1.2 Mơ hình Trường lực mơ hình Gaussian 3D-QSAR 23 2.1.3 Thẩm định mơ hình 24 2.2 Thực nghiệm 25 2.2.1 Vật liệu 25 2.2.2 Phương pháp thực nghiệm 25 CHƯƠNG : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Mơ hình Trường lực mơ hình Gaussian 27 3.2 Xác định cấu trúc độ tinh khiết peptide tổng hợp 31 3.2.1 Peptide Pro-Trp-Tyr (P-W-Y) 32 3.2.2 Peptide Pro-Trp-Tyr(NH2) (P-W-Y(NH2)) 34 3.2.3 Peptide Pro -Tyr-Trp (P -Y-W) 36 3.2.4 Peptide Pro -Tyr-Trp(NH2) (P -Y-W(NH2)) 38 3.2.5 Peptide Leu-Pro-Trp-Tyr(NH2) (L-P-W-Y (NH2): tryptophyllin L 4.1) 40 3.3 Hoạt động bắt gốc tự ABTS+ 42 3.4 Phản ứng khử sắt 45 CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Minh họa trường tương tác phân tử điểm nút mạng lưới 12 Hình Quy trình xây dựng mơ hình trường phân tử 3D-QSAR CoMFA 14 Hình Quy trình tổng hợp peptide pha rắn 16 Hình Các liên kết linker thường sử dụng 18 Hình Hệ bảo vệ Fmoc/tBu 19 Hình Sự phân tách nhóm Boc 19 Hình Sự phân tách nhóm Fmoc 19 Hình Phản ứng nhóm amine acid carboxylic hoạt hóa 20 Hình Xếp chồng a) 108 peptide từ liệu TEAC b) 16 tryptophyllin L hai tripeptide thiết kế 23 Hình 10 Đồ thị tương quan hoạt tính từ thực nghiệm dự đốn tập huấn luyện tập kiểm tra rút từ mơ hình a), b) Trường lực c), d) Gaussian 28 Hình 11 Bản đồ biên dạng (contour) năm trường bắt nguồn từ mơ hình Trường lực (a) trường khơng gian (dương: xanh lục, âm: vàng); (b) Trường tương tác tĩnh điện (xanh lam: dương; đỏ: âm) 29 Hình 12 Bản đồ đường biên dạng năm trường bắt nguồn từ mơ hình Gaussian: (a) trường khơng gian (dương: xanh lục, âm: vàng); (b) trường tương tác tĩnh điện (xanh lam: dương; đỏ: âm); (c) trường kỵ nước (cam: dương, trắng: âm), (d) trường chất nhận liên kết hydro (xanh lục: dương; hồng tươi: âm); (e) trường cho liên kết hydro (tím: dương; xanh lam: âm) 30 Hình 13 Cấu trúc peptide P-W-Y 32 Hình 14 Phổ khối dương [M+H]+ peptide P-W-Y 33 Hình 15 Phổ HPLC peptide P-W-Y 33 Hình 16 Phổ khối dương +ESI MS/MS peptide P-W-Y 34 Hình 17 Cấu trúc peptide P-W-Y(NH2) 34 Hình 18 Khối phổ dương [M+H]+ peptide P-W-Y(NH2) 35 Hình 19 Phổ HPLC peptide P-W-Y(NH2) 36 Hình 20 Phổ khối dương +ESI MS/MS peptide P-W-Y(NH2) 36 Hình 21 Cấu trúc peptide P -Y-W 36 Hình 22 Phổ khối dương [M+H]+ peptide P-Y-W 37 Hình 23 Phổ HPLC peptide P-Y -W 37 Hình 24 Phổ khối dương +ESI MS/MS peptide P- Y-W 38 Hình 25 Cấu trúc peptide P -Y-W(NH2) 38 Hình 26 Phổ khối dương [M+H]+ peptide P-Y-W(NH2) 39 Hình 27 Phổ HPLC peptide P-Y-W(NH2) 39 Hình 28 Phổ khối dương +ESI MS/MS peptide P- Y-W(NH2) 40 Hình 29 Cấu trúc peptide L-P-W-Y (NH2) (tryptophyllin L 4.1) 40 Hình 30 Khối phổ dương [M+H]+ peptide L-P-W-Y(NH2) 41 Hình 31 Phổ HPLC peptide L-P-W-Y(NH2) 41 Hình 32 Phổ khối dương +ESI MS/MS peptide L-P-W-Y(NH2) 42 iii Hình 33 Giá trị bắt gốc ABTS+ tương đương trolox peptide nồng độ 8,2 M thời gian phút 42 Hình 34 Tốc độ phản ứng bắt cation gốc 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS˙ +) peptide nồng độ (a) 2,5 M (b) 10 M 44 Hình 35 TEAC peptide glutathione khoảng nồng độ từ 2,5 đến 10 M 45 Hình 36 Hoạt tính khử sắt tryptophyllin L peptide Trolox nồng độ 25 M 30 phút 46 Hình 37 Sự thay đổi khả khử sắt peptide theo thời gian ba nồng độ khác a) 25, b) 50 c) 100 M 48 iv DANH MỤC BẢNG Bảng Năm peptide Tryptophyllin L dẫn xuất tổng hợp nghiên cứu Bảng Các Tryptophyllin L peptide phân lập từ loài ếch Litoria rubella [16, 18] Bảng Dữ liệu tập huấn mơ hình thử nghiệm mơ hình 22 Bảng Các thơng số thống kê mơ hình Trường lực (4 biến số chính) mơ hình Gaussian (5 biến số chính) 27 Bảng Đóng góp trường vào mơ hình Trường lực (4 biến số chính) mơ hình Gaussian (5 biến số chính) 28 Bảng Các giá trị TEAC dự đốn từ mơ hình Trường lực mơ hình Gaussian 31 Bảng Bảng phân tích phổ khối HPLC peptide tổng hợp 31 v DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục Thiết bị thủy tinh dùng tổng hợp peptide 54 Phụ lục Điều kiện thời gian lưu HPLC sản phẩm tổng hợp PWY 55 Phụ lục Điều kiện thời gian lưu HPLC sản phẩm tổng hợp PWY(NH2) 56 Phụ lục Điều kiện thời gian lưu HPLC sản phẩm tổng hợp PYW 57 Phụ lục Điều kiện thời gian lưu HPLC sản phẩm tổng hợp PYW(NH2) 58 Phụ lục Điều kiện thời gian lưu HPLC sản phẩm tổng hợp LPWY (NH2) 59 vi DANH MỤC VIẾT TẮT 3D-QSAR: three dimensional quantitative structure activity relationship- mơ hình chiều định lượng quan hệ cấu trúc hoạt tính sinh học ABTS: 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid Boc: t-butoxycarbonyl Bzl: benzyl BHA: butylhydroxyanisole BHT: butylated hydroxytoluene COMFA: Comparative molecular field analysis COMSIA: Comparative Molecular Similarity Indices Analysis CNN: convolutional neural networks- mạng thần kinh nơ-ron tích tụ DCM: dichloromethane DMF: dimethylformamide DPPH: 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate FRAP: ferric reducing antioxidant power- khả chống oxi hóa thể qua khả khử sắt Fmoc: fluorenylmethyloxycarbonyl HATU: 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate, Hexafluorophosphate Azabenzotriazole Tetramethyl Uronium HBTU: 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, Hexafluorophosphate Benzotriazole Tetramethyl Uronium HPLC: high performance liquid chromatography- sắc ký lỏng hiệu cao IC50: half maximal inhibitory concentration- nồng độ ức chế tối đa 50% trình sinh học MLR: multiple linear regression- hồi quy tuyến tính đa biến PLS: partial least square- bình phương tối thiểu phần PyBroP RF: random forest- rừng ngẫu nhiên SPPS: Solid phase peptide synthesis- tổng hợp peptide pha rắn SVM: support vector machine- máy vectơ hỗ trợ tBu: tert-bytyl TEAC: trolox equivalent antioxidant capacity TFA: trifluoroacetic acid TPTZ: 2,4,6-tripyridyl-s-triazine vii LỜI CÁM ƠN Chúng xin chân thành cảm ơn Quỹ nghiên cứu khoa học IUH, Ban lãnh đạo IUH, Lãnh đạo khoa Cơng nghệ Hóa học, Phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ Hóa học, thành viên đề tài giúp tơi hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học Cảm ơn thành viên nhóm nghiên cứu: TS Trần Thị Diệu Thuần, TS Trần Đình Phiên thuộc Trung tâm nhiệt đới Việt Nga GS TS John Hamilton Bowie thuộc Trường Đại học Adelaide, đóng góp ý kiến ủng hộ tinh thần để tơi để hồn thành cơng trình nghiên cứu PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Tổng hợp xác định hoạt tính chống oxy hóa Tryptophyllin L peptide phương pháp mơ hình thống kê định lượng 3D-QSAR kết hợp với thực nghiệm in vitro 1.2 Mã số: 21/1H03 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài Họ tên TT Đơn vị cơng tác (học hàm, học vị) Vai trị thực đề tài TS Trần Thị Thanh Nhã Khoa Cơng nghệ hóa học Chủ nhiệm TS Trần Thị Diệu Thuần Khoa Cơng nghệ hóa học Thành viên 1.4 Đơn vị chủ trì: Khoa Cơng nghệ Hóa học, Đại học Công nghiệp Tp.HCM 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 03 năm 2021 đến tháng 02 năm 2022 1.5.2 Gia hạn (nếu có): Khơng 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 03 năm 2020 đến tháng 11 năm 2020 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 55 triệu đồng II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Vai trò peptide ngày trở nên quan trong ngành cơng nghiệp nghiên cứu hóa dược, hóa mỹ phẩm gần cơng nghệ thực phẩm [1-4] Các cơng trình nghiên cứu cho thấy, peptide phân lập từ tự nhiên thể đa dạng hoạt tính sinh học bao gồm khả chống oxy hóa, chống tăng huyết áp, kháng vi sinh…[5, 6] Peptide chống oxy hóa đặc biệt ý chúng góp phần quan trọng vào việc ngăn ngừa chữa trị bệnh tim mạch, tiểu đường, ung thư viêm khớp [7-9] Việc khảo sát hoạt tính chống oxy hóa peptide tách chiết từ tự nhiên với việc nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố cấu trúc đến khả chống oxy hóa chúng góp phần mở rộng ngân hàng peptide thuộc nhóm này, đồng thời làm sở cho việc dự đoán thiết kế peptide ứng dụng ngành công nghệ thực phẩm dược phẩm [10, 11] Chính mục đích mà nghiên cứu này, nhóm tiến hành sàng lọc tất peptide tryptophyllin L phân lập từ lồi ếch Litoria rubella sử dụng mơ hình ba chiều định lượng mối quan hệ hoạt tính cấu trúc (3D-QSAR: three dimensional quantitative structure activity relationship) dựa phương pháp CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis) CoMSIA (Comparative Molecular Similarity Indices Analysis) Các peptide với dự đốn có giá trị bắt gốc tương đương trolox (trolox equivalent antioxidant capacity: TEAC) lớn tổng hợp pha rắn phương pháp Fmoc xác định hoạt tính chống oxy hóa thực nghiệm in vitro Mục tiêu 2.1 Mục tiêu tổng quát: Sử dụng phương pháp thống kê định lượng 3D-QSAR nhằm dự đoán sàng lọc peptide Tryptophyllin L dẫn xuất có hoạt tính chống oxi hóa cao Tổng hợp peptide sử dụng phương pháp tổng hợp pha rắn thử nghiệm đối chiếu hoạt tính sử dụng thí nghiệm bắt gốc tự Từ đó, đề xuất đặc điểm cấu trúc ảnh hưởng tích đến hoạt tính chống oxi hóa peptide này, đồng thời đề xuất cấu trúc tiến hành nghiên cứu ứng dụng xa công nghiệp thực phẩm dược phẩm 2.2 Mục tiêu cụ thể: Xây dựng mơ hình 3D-QSAR CoMSIA hoạt tính chống oxi hóa hệ data tripeptide Sử dụng mơ hình để dự đốn phân tích mối liên hệ cấu trúc hoạt tính chống oxi hóa Tryptophyllin L tripeptide dẫn xuất Tổng hợp pha rắn Tryptophyllin peptide dẫn xuất sử dụng kỹ thuật tổng hợp Fmoc Tinh chế petide phương pháp sắc ký lỏng pha đảo, xác minh cấu trúc chúng phổ khối (MS) nuclear magnetic resornance (NMR) ... quát 1.1 Tên đề tài: Tổng hợp xác định hoạt tính chống oxy hóa Tryptophyllin L peptide phương pháp mơ hình thống kê định l? ?ợng 3D-QSAR kết hợp với thực nghiệm in vitro 1.2 Mã số: 21/1H03 1.3 Danh... Bảng Năm peptide Tryptophyllin L dẫn xuất tổng hợp nghiên cứu Bảng Các Tryptophyllin L peptide phân l? ??p từ loài ếch Litoria rubella [16, 18] Bảng Dữ liệu tập huấn mơ hình thử nghiệm mơ hình ... oxy hóa thực nghiệm in vitro Mục tiêu 2.1 Mục tiêu tổng quát: Sử dụng phương pháp thống kê định l? ?ợng 3D-QSAR nhằm dự đoán sàng l? ??c peptide Tryptophyllin L dẫn xuất có hoạt tính chống oxi hóa