2.6 Kiểm tra xác định cấu trúc
2.6.1 Phương pháp FT-IR
Phƣơng pháp xác định phổ FT-IR đƣợc kiểm tra trên máy The Bruker Tensor 37 FT-IR, trực thuộc khoa Cơng nghệ hóa học, Đại học Cơng nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
2.6.2 Phương pháp phổ NMR
Phƣơng pháp xác định phổ NMR đƣợc kiểm tra trên máy NMR: Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, phịng NMR, viện Hóa học, viện Hàn Lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, số 18, Hồng QuốcViệt, Cầu Gi y, Hà Nội.
2.6.3 Phương pháp phổ MS
Kiểm tra phổ khối lƣợng (MS) đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp phun mù điện, trên thiết ị ESI-MS: microOTOF-Q II 10187 tại phịng phân tích, trực thuộc Viện hóa học - Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, số 01 Mạc Đ nh Chi, phƣờng Bến Nghé, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh.
2.7 Thử nghiệm hoạt tính sinh học
Các hợp ch t trung gian (4) và hợp ch t sản phẩm (5a-e) đƣợc kiểm tra hoạt tính
55
học Y dƣợc TP. Hồ Chí Minh, số 41 Đinh Tiên Hồng - phƣờng Bến Nghé - quận 1 - Tp. Hồ Chí Minh.
2.7.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư 83-85
2.7.1.1 Khảo sát độc tế bào in vitro theo phương pháp MTT
Tiến hành: Dung dịch các hợp ch t đƣợc pha trong DMSO ở nồng khác nhau, các ch t tinh khiết tổng hợp ở nồng độ 10 mM. Dung dịch tổng hợp đƣợc ảo quản ở nhiệt độ -20oC, rã đông và pha lỗng trong mơi trƣờng để đạt các nồng độ khảo sát, vô trùng ằng cách chiếu UV 60 phút trƣớc khi dùng.
Tế ào ung thƣ vú MDA-MB-231 đƣợc nuôi trong môi trƣờng EMEM, ổ sung 10% FCS, L-glutamin 2 mM, penicilin 100 mL, streptomycin 100 µg/mL. Tế ào đƣợc ni trong ình ni c y 75 cm2, ủ ở 37oC, 5% CO2. Khi tế ào đạt trạng thái đông tụ (độ phủ 70-80%), thu tế ào và chia vào đ a nuôi c y 96 giếng ở mật độ 4 x 104 tế ào/cm2. Ủ ở 37 o
C, 5% CO2 qua đêm để tế ào ám lên ề mặt đ a nuôi c y và phát triển ổn định. Xử lý tế ào với mẫu thử ở nồng độ khác nhau. Mẫu pha trong DMSO với nồng độ tƣơng đƣơng với nồng độ cuối cùng trong môi trƣờng (1%, 0,5%) và paclitaxel 10 µM (đối với ch t phân lập) đƣợc tiến hành song song. Những mẫu có nồng độ DMSO dƣới 0,25% (v/v) khơng ảnh hƣởng đến tỷ lệ sống của tế ào nên sử dụng số liệu của mẫu môi trƣờng không xử lý. Thực hiện 3 hoặc 6 mẫu cho 1 điều kiện nuôi c y. Sau thời gian xử lý, xác định tỷ lệ tế ào sống ằng phƣơng pháp MTT.
2.7.1.2 Khảo sát tỷ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT
Nguyên tắc: Tỷ lệ tế ào sống đƣợc xác định nhờ hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) của ty thể chỉ có trong tế ào sống. SDH chuyển MTT [3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium romid)] thành tinh thể formazan tan trong isopropanol acid hóa tạo dung dịch màu tím, đo OD ở 570 nm. Giá trị OD phản ánh số lƣợng tế ào sống trong mẫu ni c y.
56
CO2 trong thờigian thích hợp (tùy theo thí nghiệm). Loại ỏ mơi trƣờng ni c y, ổ sung mơi trƣờng khơng có FCS chứa 0.05 mg/mL MTT, ủ ở 37 °C, 5% CO2 trong 3 giờ. Bỏ mơi trƣờng có MTT, hòa tinh thể formazan tạo thành trong isopropanol acid hóa. Lắc rung 10 phút ở nhiệt độ phòng. Đo OD ở 570 nm trên máy đọc microplate MultiskanTM.
2.7.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, nấm
Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, n m đƣợc thực hiện tại phịng Cơng nghệ sinh học trực thuộc trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, theo phƣơng pháp Kirby Bauer [86].
2.7.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn
Các vi khuẩn thử nghiệm đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB Broth cho đến khi đạt đƣợc độ đục 0.5 theo tiêu chuẩn McFarland. Dịch vi khuẩn này sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của hợp ch t 4 và 5a-e. Dịch vi khuẩn 0.1mL đƣợc trãi trên đ a petri chứa môi trƣờng LB Agar theo phƣơng pháp trãi đ a. Các đ a gi y th m vô trùng chứa 20 ul các dung dịch đƣợc đặt lên bề mặt đ a petri đã dàn đều vi khuẩn.
Bảng 2.12 Môi trƣờng LB (Luria Bertani Medium)
STT Tác chất Nồng độ 1 Tryptone 10 g/L 2 Yeast extract 5 g/L 3 NaCl 10 g/L 4 Agar 15-20 g/L 5 Nƣớc c t 1 L
Tiếp theo, các đ a petri đƣợc để yên trong 4 oC cho dung dịch th m vào môi trƣờng thạch trong 2 giờ và sau đó đƣợc đem ủ ở 37 oC trong 16-18 giờ. Đ a kháng sinh Gentamycin (Công ty Alpha Chem, Việt Nam) đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng cho các thí nghiệm. Đối chứng âm đƣợc thực hiện bằng dung môi DMSO. Khả n ng kháng khuần của các dung dịch B1/B3/MM đối với các chủng vi khuẩn đƣợc đo bằng đƣờng kính vịng vơ khuẩn sau 16-18 giờ ni ủ.
57
Bảng 2.13 Các loại vi khuẩn dùng để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn
STT Tên vi khuẩn Gram
1 Bacillus cereus (+) 2 Bacillus subtilis (+) 3 Escherichia coli (-) 4 Salmonella enterica (-) 5 Staphylococcus aureus (+) 6 Pseudomonas aeruginosa (+) 2.7.2.2 Hoạt tính kháng nấm
Trƣờng hợp n m men Candida albicans đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ kiểm tra vi khuẩn với môi trƣờng dinh dƣỡng là môi trƣờng Hansen (Bảng 2.14). Đ a kháng sinh Ketoconazole (Công ty Alpha Chem, Việt Nam) đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng cho các thí nghiệm. Đối chứng âm đƣợc thực hiện bằng dung môi DMSO.
Bảng 2.14 Môi trƣờng Hansen STT Tác chất Nồng độ STT Tác chất Nồng độ 1 Glucose 50.0 g/L 2 Peptone 10.0 g/L 3 K2HPO4 3.0 g/L 4 MgSO4.7H2O 2.0 - 5.0 g/L 5 Agar 20.0 g/L 6 Nƣớc c t 1 L
Trƣờng hợp n m mốc Fusarium sp. và Colletotrichum sp. đƣợc thực hiện với môi trƣờng dinh dƣỡng là môi trƣờng PGA (Bảng 2.15) và c y điểm tại tâm petri. Các dung dich hóa ch t đƣợc kiểm tra tƣơng tự nhƣ trong kiểm tra vi khuẩn. Đ a kháng sinh Ketoconazole đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng cho các thí nghiệm. Đối chứng âm đƣợc thực hiện bằng dung môi DMSO.
Bảng 2.15 Môi trƣờng PGA (Potato Glucose Agar)
STT Tác chất Nồng độ
1 Khoai tây 200 g/L
2 Glucose 20 g/L
3 Agar 20 g/L
58
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Hiệu xuất phản ứng
3.1.1 Phản ứng ethyl hóa phenothiazine
Khối lƣợng tính theo lý thuyết là : 0.076 x 227.0769 = 17.2578 g. Khối lƣợng ch t rắn thu đƣợc thực tế qua q trình ethyl hóa là 15.17 g.
Vậy hiệu xu t của quá trình này là : h% = 15,17
17,2578 .100% = 87,9%.
3.1.2 Phản ứng ethyl phenothiazine carbonyl
Khối lƣợng theo lý thuyết là : 0.044 x 255.072 = 11.223 g.
Khối lƣợng ch t rắn thu đƣợc thực tế qua q trình carbonyl hóa là 8.87 g.
Vậy hiệu xu t của quá trình này là : h% = 8.87
11.223 .100% = 79.03%.
3.1.3 Phản ứng Bromethyl phenothiazine carbonyl
Khối lƣợng theo lý thuyết là : 0.0235 x 332.98 = 7.825 g.