Nghiên cứu bào chế viên nén chứa cao lá đắng (vernonia amygdalina del ) định hướng điều trị bệnh tăng huyết áp

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Lá đắng, được thu hái vào tháng 3 năm 2022 tại xã Ân Hảo Đông, huyện Hoài Ân, tỉnh Bình Định, thuộc loài Vernonia amygdalina Delile của họ Cúc (Asteraceae), đã được tác giả Trương Thị Đẹp định danh Sau khi rửa sạch, lá được thái nhỏ, phơi khô trong nắng râm, sau đó xay và rây thành bột với kích thước 1400 mm để phục vụ cho quá trình chiết xuất.

NGUYÊN VẬT LIỆU – TRANG THIẾT BỊ

Bảng 3.1 Danh sách tá dƣợc đƣợc sử dụng

STT Tên nguyên liệu Xuất xứ Tiêu chuẩn chất lƣợng

1 Cellulose vi tinh thể (Avicel) Ấn độ USP38

2 Sodium croscarmellose (SCC) Trung Quốc DĐVN V

3 Polyvinyl Pyrrolidone K30 (PVP K30) Trung Quốc DĐVN V

6 Magie stearate Trung Quốc DĐVN V

Bảng 3.2 Danh sách hóa chất và thuốc thử dƣợc sử dụng

STT Tên hóa chất Xuất xứ

Bảng 3.3 Danh sách trang thiết bị

STT Tên thiết bị Model Xuất xứ

1 Bếp điện Gali GL-2018 Nhật Bản

2 Cân phân tích Sartorius 4 số lẻ PRACTUM 224-1S Đức

3 Cân kỹ thuật Sartorius 2 số lẻ TE412 Đức

4 Cân sấy ẩm Ohaus MB-27 Mỹ

5 Máy đo độ cứng Pharma Test PT B311-E Đức

6 Máy đo độ mài mòn Pharma Test PT F20ER Đức

7 Máy đo độ rã Pharma Test DIST-3 Đức

8 Máy đo tỷ trọng hạt AS 200 Digit PT TD 020 Đức

9 Máy sàng rây AS 200 AS 200 BASIC Đức

10 Máy trộn siêu tốc GHL-10 - Trung Quốc

11 Máy trộn hoàn tất LHU-Pharma Lab - Việt Nam

12 Máy trộn đa năng LHU-TYPE 1 - Việt Nam

13 Máy trộn đa năng LHU-TYPE 4 - Việt Nam

14 Máy dập viên xoay tròn Shree

15 Máy khuấy đũa Velp ES Ý

16 Máy siêu âm ELMA S100H Elmasonic S 100 H Đức

17 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

18 Nồi nấu cao 300 lít LHU - Việt Nam

19 Tủ sấy đối lưu MEMMERT UNB500 Đức

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao Lá đắng

3.3.1.1 Chiết cao Lá đắng ở lô 500 g

Tóm tắt chất lƣợng mục tiêu của cao khô Lá đắng:

Bảng 3.4 Đặc điểm chất lƣợng mong muốn của cao Lá đắng

Cảm quan Cao khô, màu nâu đồng nhất, tơi, mịn, mùi thơm đặc trƣng, vị đắng Độ ẩm ≤ 5%

Hiệu suất chiết ≥ 15,0% Định tính Các vết trong mẫu thử có R f tương ứng với các vết mẫu chuẩn Định lƣợng luteolin (%) ≥ 0,005% luteolin

Chiết xuất cao đặc Lá đắng

Nghiên cứu của Nguyễn Lê Hoài Tâm (2019) cho thấy cao nước chiết nóng từ lá đắng có hiệu quả trong việc hạ huyết áp ở chuột Do đó, đề tài sẽ tiếp tục sử dụng nước cất làm dung môi chiết và thực hiện chiết theo phương pháp chiết nóng.

Bảng 3.5 Quy trình chiết xuất dƣợc liệu Lá đắng

Dung môi Phương pháp Nguyên liệu Thời gian, nhiệt độ

Nước cất được sử dụng để chiết nóng bột lá cây Lá đắng với quy trình thực hiện 3 lần, mỗi lần 5000 ml dung môi ở nhiệt độ 100 ºC trong 30 phút Sau khi chiết, dịch chiết được lọc qua vải và cô trực tiếp trên bếp điện ở nhiệt độ 70 – 90 ºC với sự hỗ trợ của máy khuấy 300 vòng/phút, cho đến khi thu được cao có độ ẩm khoảng 15%.

3.3.1.2 Khảo sát tá dƣợc điều chế cao khô Lá đắng Để rút ngắn thời gian cô cao, cải thiện tính chất và lưu tính của cao khô cần bổ sung loại và lƣợng tá dƣợc thích hợp Tá dƣợc đƣợc lựa chọn khảo sát là lactose DC, aerosil, avicel PH 102 Cho một lượng cao đặc tương được 50 g dược liệu vào 9 chén sứ, trộn đều với các tá dƣợc lần lƣợt theo tỷ lệ dƣợc liệu khô : tá dƣợc là 5:1, 10:1, 15:1 Sấy trong tủ sấy 80 °C trong 48 giờ Nghiền mịn, rây qua rây 0,5 mm

Bảng 3.6 Khảo sát tỷ lệ dƣợc liệu : tá dƣợc điều chế cao Lá đắng

Lactose Aerosil Avicel Khối lƣợng tá dƣợc

Mỗi mẫu tá dược được thực hiện ba lần để lấy kết quả trung bình Việc đánh giá thời gian cô, độ ẩm cao, tính chất và lưu tính cao là cần thiết để lựa chọn loại và lượng tá dược phù hợp.

3.3.1.3 Kiểm tra chất lƣợng cao khô Lá đắng lô 500 g

- Cảm quan: Bột có màu nâu, đồng nhất, mùi đặt trƣng, vị đắng

Để xác định độ ẩm của cao, sử dụng cân sấy ẩm Ohaus, cho khoảng 600 mg cao vào đĩa cân, sau đó khởi động cân và ghi nhận độ ẩm sau khi hoàn tất quá trình đo Mỗi mẫu cần thực hiện ba lần để lấy kết quả trung bình, với yêu cầu độ ẩm không vượt quá 5%.

- Định tính: bằng phương pháp SKLM

+ Mẫu thử: lấy một lƣợng nhỏ cao khô Lá đắng hòa với 5 ml MeOH Lắc siêu âm đến tan Lọc qua màng lọc 0,45 μm

Để thực hiện mẫu đối chiếu cao toàn phần cho Lá đắng, cần cân 2,5 g dược liệu và cho vào bình nón 100ml Tiếp theo, thêm 50 ml nước cất và đun cách thủy trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ Sau đó, lọc dịch chiết qua bông và cô dịch lọc đến cắn, rồi hòa tan với 5 ml MeOH Cuối cùng, lọc dịch chiết MeOH qua màng lọc 0,45 μm.

+ Mẫu chuẩn luteolin: lấy một lƣợng nhỏ luteolin chuẩn hòa với 5 ml MeOH Lắc siêu âm đến tan Lọc qua màng lọc 0,45 μm

Tiến hành chấm lần lƣợt mẫu thử - mẫu đối chiếu cao toàn phần Lá đắng, mẫu thử - mẫu chuẩn luteolin

+ Bản sắc ký: bản silica gel F 254 (Merck)

+ Dung môi khai triển: EtOAc-Cloroform-MeOH-HCOOH (10:1:1:0,5)

+ Phát hiện bằng thuốc thử FeCl 3 1% trong cồn và thuốc thử VS 1%/H 2 SO 4

3.3.1.4 Chiết xuất cao Lá đắng ở lô 6500 g

- Nguyên liệu: 6500 g bột lá của Lá đắng

- Thiết bị: nồi nấu cao 300 Lít LHU

+ Chiết nóng 3 lần, mỗi lần chiết với khoảng 115 Lít nước cất Nhiệt độ: 100 0 C Thời gian: 2 giờ/lần Tốc độ vòng quay: 55 vòng/phút

+ Cô trực tiếp trên nồi nấu cao 300 Lít LHU ở 70 – 90 ºC Cô đến khi thu đƣợc cao có độ ẩm khoảng 15%

3.3.1.5 Điều chế cao khô Lá đắng lô 6500 g

- Sử dụng loại và lƣợng tá dƣợc điều chế cao khô đã lựa chọn ở mục 3.3.1.2

- Sấy trong tủ sấy 80 0 C/48 giờ

- Nghiền mịn và rây qua rây 0,5 mm

3.3.1.6 Kiểm tra chất lƣợng cao khô Lá đắng lô 6500 g

- Cảm quan: thực hiện theo mục 3.3.1.3

- Độ ẩm: thực hiện theo mục 3.3.1.3

- Định tính: thực hiện theo mục 3.3.1.3

- Định lượng: Phương pháp HPLC [11], [40], [64], sử dụng luteolin làm chất chỉ điểm cho cao Lá đắng

Để chuẩn bị dung dịch luteolin, hòa tan 10,0 mg luteolin chuẩn trong một bình định mức 50 ml với MeOH Tiếp theo, lấy 25 ml dung dịch đã pha loãng và thêm MeOH vào bình định mức 100 ml Dung dịch cuối cùng có nồng độ luteolin khoảng 50 μg/ml.

Hút chính xác 4 ml dung dịch chuẩn gốc và pha loãng với lượng MeOH vừa đủ trong bình định mức 25 ml Dung dịch thu được có nồng độ luteolin khoảng.

Để chuẩn bị mẫu thử, cân chính xác 1000 mg cao khô Lá đắng vào bình định mức 10 ml, sau đó thêm MeOH vừa đủ Tiến hành siêu âm ở nhiệt độ 30°C trong 15 phút, lắc đều và để lắng trong 10 phút Cuối cùng, lọc qua màng lọc 0,45 µm để thu được dung dịch cần thiết cho phân tích sắc ký.

+ Pha động: acetonitril (A) và acid phosphoric 0,2% (B) (4:6), thời gian chạy là 10 phút

+ Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C18 (5 mcg x 4,6 x 100 mm)

+ Đầu dò DAD, bước sóng phát hiện: 347 nm

+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút

+ Thể tớch tiờm mẫu: 25 àl

Hàm lƣợng (%) luteolin trong cao khô Lá đắng đƣợc tính theo công thức:

X: hàm lƣợng (%) luteolin có trong cao dƣợc liệu

S T : diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch thử

S C : diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch đối chiếu

D T : độ pha loãng mẫu thử

D C : độ pha loãng mẫu đối chiếu

H%: hàm lượng chất đối chiếu theo phương pháp quy về 100% diện tích pic m C : khối lƣợng đối chiếu (mg) m T : khối lƣợng cao để pha mẫu thử (mg)

3.3.1.7 Thẩm định quy trình định lƣợng luteolin trong cao khô Lá đắng bằng phương pháp HPLC a) Tính tương thích hệ thống

Cách tiến hành: chạy sắc ký 6 mẫu chuẩn 100% Ghi lại sắc ký đồ và xác định mức độ đáp ứng của các tiêu chỉ đánh giá

Sắc ký đồ 6 mẫu chạy lặp lại dung dịch chuẩn gốc:

- Giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu của 6 lần chạy < 2,0%

- Hệ đối xứng của pic luteolin 0,8 < As < 1,5 b) Độ đặc hiệu

- Mẫu chuẩn: sử dụng dung dịch tuyến tính mẫu 100%

Để thực hiện phân tích mẫu, cân chính xác 1000 mg cao khô lá đắng và thêm MeOH vừa đủ vào bình định mức 10 ml Tiến hành siêu âm ở 30 °C trong 15 phút, sau đó lắc đều và để lắng trong 10 phút Cuối cùng, lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiêm mẫu vào hệ thống HPLC để phân tích.

Triển khai sắc ký: chạy lần lƣợt mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn

Ghi nhận sắc ký đồ của các mẫu

Tính hệ số tương đồng giữa pic luteolin của mẫu thử và mẫu chuẩn

Hệ số tương đồng ( ) T th

Trong đó: T thử ,T chuẩn lần lượt là thời gian lưu của pic mẫu thử và mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn: thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử phải tương đương với mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ mẫu trắng không có pic trùng với pic của hoạt chất

Khi bổ sung một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, diện tích pic của hoạt chất sẽ tăng lên so với trước khi thêm chất đối chiếu Điều này cho thấy tính tuyến tính của phương pháp phân tích, với một khoảng tuyến tính rõ ràng.

Để chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn với 5 nồng độ luteolin, cần pha dung dịch chuẩn bằng cách lấy chính xác thể tích dung dịch chuẩn gốc theo Bảng 3.7, cho vào bình định mức 25 ml và thêm MeOH đến vạch Sau đó, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm để thu được các nồng độ luteolin tuyến tính.

Bảng 3.7 Pha các dung dịch chuẩn

Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml) Độ pha loãng (ml)

- Chạy mỗi mẫu dung dịch trên vào hệ thống sắc ký HPLC và ghi lại sắc ký đồ

- Xác định hệ số tương quan, biện luận giá trị b của phương trình hồi quy

Xử lý kết quả bằng phần mềm MS-Excel cho phép lập phương trình đường thẳng thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic Để thiết lập mối tương quan tuyến tính, cần xác định phương trình ŷ = ax + b và tính toán hệ số tương quan.

Sử dụng công cụ phân tích hồi quy trong MS-Excel giúp kiểm tra tính tuyến tính của phương trình hồi quy và đánh giá ý nghĩa của các hệ số trong phương trình với mức độ tin cậy 95%.

Yêu cầu: hệ số tương quan R 2 ≥ 0,9990 d) Độ lặp lại

- Độ lặp lại đƣợc thực hiện bằng cách định lƣợng ít nhất 6 mẫu thử khác nhau

- Xác định độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng mẫu thử

Mẫu thử được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 1000 mg cao khô Lá đắng, sau đó thêm MeOH vừa đủ vào bình định mức 10 ml Tiến hành siêu âm ở 30 °C trong 15 phút, lắc đều và để lắng trong 10 phút, rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu thử sau đó được tiêm vào hệ thống HPLC và thực hiện 6 mẫu thử lặp lại để tính toán % RSD của 6 mẫu.

Yêu cầu : Giá trị RSD (%) giữa các kết quả định lƣợng phải ≤ 2,0% [38] e) Độ chính ác trung gian

Tiến hành tương tự như độ lặp lại nhưng thực hiện ngày khác và khác kiểm nghiệm viên

Tính giá trị RSD (%) của các kiểm nghiệm viên

Thống kê so sánh giá trị trung bình giữa 2 kiểm nghiệm viên

- Giá trị RSD (%) của 6 mẫu định lƣợng riêng biệt với mỗi kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%

- Giá trị RSD (%) của 12 mẫu định lƣợng riêng biệt với mỗi kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

KẾT QUẢ

4.1.1 Chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao Lá đắng

4.1.1.1 Chiết cao Lá đắng ở lô 500 g

Thực hiện theo mục 3.3.1.1 thu đƣợc khoảng 380 ml cao đặc Lá đắng (độ ẩm 9,74% < 15%)

4.1.1.2 Khảo sát tá dƣợc điều chế cao khô Lá đắng

Nghiên cứu phối hợp cao chiết với ba loại tá dược lactose DC, Aerosil và Avicel PH 102 nhằm điều chế cao khô Lá đắng theo các tỷ lệ (dược liệu - tá dược) 5:1, 10:1 và 15:1 đã cho ra kết quả đáng chú ý.

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát tá dƣợc điều chế cao khô

Mẫu Tá dƣợc Thể chất cao Độ ẩm Lactose DC Aerosil Avicel

Hình 4.1 Thể chất cao khô sau khi phối hợp với các tá dƣợc tỷ lệ khác nhau

Khi thêm lactose DC, Aerosil và Avicel vào cao đặc để làm khô, quá trình sấy ở nhiệt độ 80°C trong 24 giờ tạo ra sự khác biệt rõ rệt về thể chất của cao.

- Cao đặc + lactose DC: cả 3 mẫu vẫn ẩm và dẻo, không thể nghiền thành bột

Cao đặc kết hợp với Aerosil cho ra hai mẫu 4 và 5 với tiêu chuẩn độ ẩm dưới 5% Mẫu 4 chứa lượng Aerosil lớn, dẫn đến cao khô sau khi chế biến có thể tích lớn và tỷ trọng thấp, không đảm bảo lưu tính cao Trong khi đó, mẫu 5 dễ nghiền nhưng trong quá trình nghiền, bột cao dễ bay ra khỏi cối, gây hao hụt khối lượng thu được.

- Cao đặc + Avicel: có mẫu 7 và 8 đạt tiêu chuẩn độ ẩm < 5%, trong đó mẫu 7 dễ nghiền mịn hơn mẫu 8

- Lactose DC tạo thể chất cao ẩm, dẻo, không thể nghiền thành bột mịn

Aerosil tạo ra thể chất cao khô cứng và dễ nghiền, nhưng do tỷ trọng rất thấp, bột cao dễ bay ra khỏi cối khi nghiền, dẫn đến hao hụt Kết quả là thể tích cao sau điều chế quá lớn, không đáp ứng yêu cầu lưu tính.

Avicel tạo ra thể chất khô và cứng với độ ẩm cao, dễ dàng nghiền thành bột mịn Sản phẩm này có tỷ trọng cao, giúp tối ưu hóa khối lượng mà không bị hao hụt.

Chọn Avicel PH 102 làm tá dược cho quá trình điều chế cao khô với tỷ lệ 5:1 giúp đạt độ ẩm dưới 5%, đồng thời dễ dàng nghiền mịn và hạn chế tá dược độn, từ đó tăng hàm lượng hoạt chất trong sản phẩm viên bào chế.

4.1.1.3 Kiểm tra chất lƣợng cao khô Lá đắng lô 500 g

- Cảm quan: Cao khô, màu nâu đồng nhất, tơi, mịn, mùi thơm đặc trƣng, vị đắng

Sắc ký lớp mỏng cao khô Lá đắng sau điều chế:

UV 254 nm Thuốc thử FeCl 3 Thuốc thử VS

Hình 4.2 Kết quả sắc ký lớp mỏng cao khô Lá đắng sau điều chế

T1: cao toàn phần Lá đắng

Nhận ét: cao khô Lá đắng sau điều chế cho các vết trùng Rf và màu sắc với cao toàn phần Lá đắng

Sắc ký lớp mỏng định tính luteolin trong cao khô Lá đắng

UV 254 nm Thuốc thử FeCl3

Hình 4.3 Kết quả định tính luteolin trong cao khô bằng SKLM

Nhận xét: cao khô Lá đắng có chứa luteolin vì có vết trùng Rf (R f = 0,71) và màu sắc với luteolin chuẩn

4.1.1.4 Chiết xuất cao Lá đắng ở lô 6500 g

Theo mục 3.3.1.4, khoảng 345 lít dịch chiết đã được thu được và cô đặc trực tiếp trên nồi nấu cao 300 lít LHU trong 45 giờ, thu được khoảng 5 lít cao đặc với độ ẩm đạt 8,72% (< 15%).

4.1.1.5 Điều chế cao khô Lá đắng lô 6500 g

- Sử dụng Avicel PH 102 (1300 g) làm tá dƣợc điều chế cao khô

- Thực hiện theo mục 3.3.1.5 thu đƣợc 2,8 kg cao khô Lá đắng, hiệu suất 22,33%, độ ẩm 3,22%

4.1.1.6 Kiểm tra chất lƣợng cao khô Lá đắng lô 6500 g

Kết quả trình bày ở bảng 4.2 (kết quả sắc ký đồ đƣợc trích dẫn ở PL18)

Bảng 4.2 Kết quả kiểm nghiệm cao khô Lá đắng chiết từ 6500 g dƣợc liệu

Chỉ tiêu QTPP Kết quả lô

Cảm quan Cao khô, màu nâu đồng nhất, tơi, mịn, mùi thơm đặc trƣng, vị đắng Đạt Đạt Độ ẩm < 5% 3,48% 3,22%

Hiệu suất chiết ≥ 15,0% 22,2% 22,3% Định tính Các vết trong mẫu thử trùng với các vết mẫu chuẩn Đúng Đúng Định lƣợng luteolin (%) ≥ 0,005% luteolin - Đạt

(0,0075%) 4.1.1.7 Kết quả thẩm định quy trình định lƣợng luteolin trong cao khô Lá đắng bằng phương pháp HPLC a) Tính tương thích hệ thống

Tiến hành theo mục 3.3.1.7, kết quả được trình bày dưới bảng 4.3 (kết quả sắc ký đồ đƣợc trích dẫn ở PL1 – PL3)

Bảng 4.3 Kết quả tính tương thích hệ thống

- % RSD thời gian lưu của luteolin là 0,05% < 2,0%

- % RSD diện tích pic của luteolin là 0,50% < 2,0%

- Hệ số đối xứng của pic luteolin: 0,8 < 0,869 < 1,5

Kết luận: quy trình đạt tính tương thích hệ thống b) Độ đặc hiệu

Kết quả khảo sát tính đặc hiệu đƣợc trình bày ở bảng 4.4 và hình 4.4

Bảng 4.4 Kết quả độ đặc hiệu – cao khô Lá đắng

Hình 4.4 Sắc ký đồ mẫu trắng – mẫu chuẩn – mẫu thử – mẫu thử thêm chuẩn của cao khô Lá đắng

Thời gian lưu (phút) Diện tích pic

Hình 4.5 Sắc ký đồ dung môi pha mẫu Nhận xét:

Thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử tương ứng với pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, với hệ số tương đồng đạt 100,02%.

- Mẫu trắng không có pic và thời gian lưu trùng với pic và thời gian lưu của luteolin nhƣ mẫu thử và mẫu chuẩn

Kết luận: quy trình thẩm định đạt chỉ tiêu độ đặc hiệu c) Tính tuyến tính – khoảng tuyến tính

Tiến hành theo mục 3.3.1.7, kết quả được trình bày dưới bảng 4.5 và hình 4.6 (kết quả sắc ký đồ đƣợc trích dẫn ở PL4 – PL5)

Bảng 4.5 Kết quả tính tuyến tính

(àg/ml) Diện tớch pic

Khảo sát tính tuyến tính của luteolin cho thấy mối liên hệ giữa diện tích pic và nồng độ phân tích Kết quả cho thấy độ dốc a = 92,1473 và tung độ gốc b = -5,7878.

- Xét khả năng tuyến tính của phương trình hồi quy

Vì: Significance F của phương trình = 2,18.10 -7 < α = 0,05

→ Phương trình hồi quy tuyến tính

- Xét ý nghĩa của hệ số a và b p-value (a) = 2,18.10 -7 < α = 0,05 nên hệ số a có ý nghĩa p-value (b) = 0,36 > α = 0,05 nên hệ số b không có ý nghĩa

Vậy phương trình hồi quy có dạng: ŷ = 92,1473x

Kết luận: do hệ số tương quan R 2 = 0,9999 > 0,9990 nên quy trình định lượng luteolin cú khoảng tuyến tớnh từ 4,0 – 20,0 àg/ml

Tính tuyến tính của luteolin ŷ = 92,1473x - 5,7878 R² = 0,9999 d) Độ lặp lại

Tiến hành theo mục 3.3.1.7, kết quả được trình bày dưới bảng 4.6 (kết quả sắc ký đồ đƣợc trích dẫn ở PL6 – PL8)

Bảng 4.6 Kết quả độ lặp lại – cao khô Lá đắng

STT Khối lƣợng cân (mg) Diện tích pic Hàm lƣợng (%)

Kết luận: quy trình đạt độ lặp lại e) Độ chính ác trung gian

Tiến hành theo mục 3.3.1.7, kết quả được trình bày dưới bảng 4.7 – 4.8 (kết quả sắc ký đồ đƣợc trích dẫn ở PL9 – PL12)

Bảng 4.7 Kết quả độ chính xác trung gian – cao khô Lá đắng

STT Khối lƣợng cân (mg) Diện tích pic Hàm lƣợng (%)

Nhận xét: % RSD của 6 mẫu riêng biệt 1,49% < 2%

Bảng 4.8 Kết quả thống kê giữa 2 kiểm nghiệm viên – cao khô Lá đắng

Kiểm nghiệm viên Trần Thị Thu Hiền Phạm Huỳnh Thanh Bảo Trung bình hàm lƣợng (%) 0,0072 0,0071

- Giá trị RSD (%) của 6 mẫu định lƣợng riêng biệt với mỗi kiểm nghiệm viên đều < 2,0%

- Giá trị RSD (%) của 12 mẫu định lƣợng: 1,41% < 2,0%

Kết luận: quy trình định lƣợng đạt yêu cầu về độ chính xác trung gian f) Độ đúng

Tiến hành theo mục 3.3.1.7, kết quả được trình bày dưới bảng 4.9 (kết quả sắc ký đồ đƣợc trích dẫn ở PL13 – PL16)

Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu độ đúng – cao khô Lá đắng

Nồng độ chuẩn thêm vào (μg/ml)

Nồng độ chuẩn tìm thấy

- Các nồng độ khảo sát đều có độ phục hồi luteolin nằm trong khoảng 80 – 110% và

%RSD ở 3 mẫu cùng nồng độ đều < 2,0%

Kết luận: quy trình thẩm định đạt chỉ tiêu độ đúng

Tổng kết kết quả thẩm định (Bảng 4.10)

Bảng 4.10 Kết quả thẩm định quy trình định lƣợng Luteolin trong cao khô Lá đắng bằng phương pháp HPLC

Tính phù hợp hệ thống

- Độ lệch chuẩn của thời gian lưu 0,05% ˂ 2,0%

- Độ lệch chuẩn của diện tích pic 0,5% ˂ 2,0% Độ đặc hiệu Đạt

Tính tuyến tính - Phương trình hồi quy: ŷ = 92,1473x

Hệ số R² đạt 0,9999 cho thấy độ lặp lại cao, với độ lệch chuẩn của hàm lượng luteolin chỉ 1,48%, nhỏ hơn 2,0% Độ chính xác trung gian cũng được xác nhận với độ lệch chuẩn 1,41%, vẫn dưới ngưỡng 2,0% Tỷ lệ phục hồi của quy trình nằm trong khoảng 80 – 110%, đảm bảo độ đúng của kết quả.

%RSD ở 3 mẫu cùng nồng độ đều < 2,0%

Kết luận: Quy trình đạt yêu cầu

4.1.2 Nghiên cứu công thức bào chế viên nén chứa cao Lá đắng ở quy mô phòng thí nghiệm

Bảng 4.11 Kết quả thực nghiệm thực nghiệm thăm dò các biến độc lập

Avicel (%) Độ cứng (N) Độ rã (giây) Độ ĐĐKL (%RSD)

Dựa trên kết quả thực nghiệm, công thức 6 cho thấy thời gian rã nhanh nhất và đạt tiêu chuẩn về độ cứng cũng như độ đồng đều khối lượng Trong khi đó, công thức 8 lại có độ cứng và thời gian rã cao nhất.

Tá dược SCC với tỷ lệ cao nhất 15% giúp viên thuốc rã tốt, trong khi PVP làm tăng độ cứng nhưng lại kéo dài thời gian rã Avicel với tỷ lệ 6% mang lại độ cứng và độ rã tối ưu, nhưng nếu tăng tỷ lệ Avicel, viên thuốc sẽ khó rã hơn.

Nhƣ vậy thành phần công thức tốt nhất trong các công thức khảo sát nhƣ trong bảng 4.12

Bảng 4.12 Thành phần công thức tốt nhất

Viên nén Lá đắng đƣợc bào chế theo quy trình ở mục 3.3.2.3 với công thức và cỡ lô theo bảng 4.12

4.1.2.3 Đánh giá các TCCL của viên nén Lá đắng

Bảng 4.13 Đánh giá bột viên sau giai đoạn trộn hoàn tất

Cảm quan Bột có màu nâu, tơi, mịn, đồng nhất, không bị tách lớp Độ ẩm (2 – 4%) Đạt (3,25%)

Góc nghỉ (độ trơn chảy) Tốt (32 o )

Phân bố kích thước hạt

Bột có kích thước phân bố chủ yếu từ 0 đến 355 µm, với tỷ lệ lớn là bột mịn Đánh giá viên nén lá đắng được thực hiện sau giai đoạn dập viên.

Bảng 4.14 Đánh giá viên nén Lá đắng sau giai đoạn dập viên

Chỉ tiêu Tiêu chuẩn chấp nhận Lô labo

Viên nén màu nâu hình caplet có hai mặt lồi, với bề mặt nhẵn và cạnh viên hoàn hảo Viên nén đạt độ đồng đều khối lượng ± 5% so với khối lượng trung bình, độ rã dưới 900 giây (585 giây), độ cứng tối thiểu 80 N (211,2 N), và độ mài mòn dưới 1% (0,006%) Định lượng Luteolin trong viên nén đạt ≥ 50 μg (54,341 μg).

4.1.2.5 Thực nghiệm kiểm chứng công thức đã chọn

Thực hiện theo mục 3.3.2.6, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.15 (kết quả sắc ký đồ đƣợc trích dẫn ở PL29 – PL31)

Bảng 4.15 Kết quả 3 lô lặp lại công thức đã chọn

Tính chất sản phẩm Lô 1 Lô 2 Lô 3 TB

Thời gian rã (giây) 592 607 585 595 Độ cứng (N) 208 215 202 208 Độ đồng đều khối lƣợng Đạt Đạt Đạt Đạt Độ mài mòn < 1% < 1% < 1% < 1% Định lƣợng luteolin (μg) 58,908 58,026 59,506 58,813

Nhận xét cho thấy tính chất của ba lô sản phẩm về thời gian rã, độ cứng và độ đồng đều khối lượng trong công thức là đồng nhất, do đó quyết định nâng kích thước lô lên 2000 viên Kết quả thẩm định quy trình định lượng luteolin trong viên nén Lá đắng bằng phương pháp HPLC cho thấy tính tương thích của hệ thống.

Tiến hành theo mục 3.3.1.7, kết quả đƣợc trình bày ở mục 4.1.2.2 b) Độ đặc hiệu

Kết quả khảo sát tính đặc hiệu đƣợc trình bày ở bảng 4.16 và hình 4.7

Bảng 4.16 Kết quả độ đặc hiệu – viên nén Lá đắng

Thời gian lưu (phút) Diện tích pic

Hình 4.7 Sắc ký đồ mẫu placebo – mẫu chuẩn – mẫu thử – mẫu placebo thêm chuẩn của viên nén Lá đắng

Hình 4.8 Sắc ký đồ placebo – viên nén Lá đắng

BÀN LUẬN

Lá đắng là một loại dược liệu có nhiều tác dụng chữa bệnh như hạ đường huyết, trị lỵ amip, chống ký sinh trùng, chống ung thư, kháng viêm, tăng cường chức năng sinh dục và hạ huyết áp Việc trồng và sử dụng lá đắng ở Việt Nam rất phổ biến, giúp điều trị các bệnh như cao huyết áp, đái tháo đường và rối loạn lipid máu Tuy nhiên, việc sử dụng lá đắng cũng tiềm ẩn nhiều nguy cơ do người dân thường dựa vào kinh nghiệm và truyền miệng, sử dụng lá tươi hoặc nấu uống như trà mà không đảm bảo an toàn và hiệu quả.

Chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao Lá đắng:

Chiết xuất cao Lá đắng bằng phương pháp chiết nóng sử dụng nước cất làm dung môi, thân thiện với môi trường và giảm chi phí Cao đặc được trộn với tá dược avicel PH 102, giúp thu được cao khô mịn, tơi, và có tính lưu tốt, phù hợp cho phương pháp dập thẳng Việc trộn tá dược còn giúp rút ngắn thời gian cô cao và giảm khả năng hút ẩm của cao khi pha chế.

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao khô Lá đắng cần tuân thủ các chỉ tiêu theo Dược điển Việt Nam V, bao gồm cảm quan, định tính, độ ẩm, hiệu suất chiết và định lượng để đánh giá chất lượng sản phẩm Theo tài liệu tham khảo, lá của cây Lá đắng chứa nhiều flavonoid, trong đó luteolin đã được phân lập nhưng số lượng còn hạn chế Luteolin có nhiều tác dụng dược lý như chống oxy hóa, chống ung thư, chống kết tập tiểu cầu và chống viêm, đặc biệt là cải thiện tình trạng bệnh tim mạch Tuy nhiên, do kết quả định lượng luteolin trong cao Lá đắng thấp, nên đề xuất sử dụng cynarosid làm chất đánh dấu thay thế.

Bào chế viên nén chứa cao Lá đắng:

Tại Việt Nam, chưa có chế phẩm viên nén từ cao Lá đắng, việc bào chế viên nén từ loại lá này là một nghiên cứu mới Chế phẩm này được coi là thực phẩm bảo vệ sức khỏe trong điều trị bệnh tăng huyết áp, vì vậy cần theo dõi độ ổn định và độ rã của viên nén.

Bào chế viên nén bằng phương pháp dập thẳng là quy trình đơn giản hơn so với các phương pháp xát hạt, với thành phần chính bao gồm natri croscarmellose, aerosil, magnesi stearat và avicel PH 102 Tuy nhiên, viên nén trần không thể che giấu vị đắng của dược liệu, do đó, sau khi nén, viên cần được bao đường hoặc bao phim, điều này yêu cầu kỹ thuật và thiết bị phức tạp.

Cao dược liệu có tính bám dính cao, do đó, trong công thức viên nén, việc sử dụng các tá dược siêu rã như natri croscarmellose với hàm lượng cao là rất cần thiết Việc này giúp cải thiện rõ rệt độ rã của viên nén so với khi sử dụng hàm lượng thấp.

Sử dụng tá dược dập thẳng Avicel PH 102 giúp cải thiện độ chảy và khả năng chịu nén của bột thuốc, đồng thời cần lựa chọn công thức với phân bố kích thước hạt phù hợp Bên cạnh đó, Aerosil là tá dược trơn bóng thân nước, góp phần nâng cao hiệu quả đỗ rã của viên thuốc.

Viên nén Lá đắng sau khi bào chế có thời gian rã trung bình là 9,52 phút, thấp hơn tiêu chuẩn độ tan rã của viên nén theo DĐVN V, không vượt quá 15 phút.

Tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên nén chứa cao Lá đắng được xây dựng dựa trên tiêu chuẩn kiểm nghiệm thuốc viên nén theo DĐVN V, bao gồm các chỉ tiêu như hình thức cảm quan, độ đồng đều khối lượng, độ rã, định tính, định lượng, và bổ sung thêm độ cứng, độ mài mòn để nâng cao đánh giá chất lượng sản phẩm Viên nén Lá đắng sau bào chế đã đạt các chỉ tiêu này Quy trình bào chế được lặp lại trên ba lô với quy mô 2000 viên, cho kết quả đánh giá giữa các lô tương đồng, chứng minh quy trình đạt độ lặp lại Tuy nhiên, cần bổ sung chỉ tiêu độ nhiễm khuẩn và độc tính bất thường để đảm bảo an toàn trong quá trình bào chế, ngăn chặn sự phát sinh độc tính và xâm nhập của vi khuẩn, nấm mốc gây bệnh.

Kết quả trên cho thấy quy trình có tính khả thi để ứng dụng trong sản xuất viên nén từ dược liệu nói chung và viên nén chứa cao Lá đắng nói riêng, giúp mở rộng khả năng ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất dược phẩm.