định mức 25 ml thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Ta đƣợc các nồng độ luteolin tuyến tính.
Bảng 3.7. Pha các dung dịch chuẩn Thể tích dung dịch Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml) Độ pha loãng (ml) Nồng độ luteolin (ppm) Nồng độ luteolin (%) 2 25 4 50 4 25 8 100 6 25 12 150 8 25 16 200 10 25 20 250
- Chạy mỗi mẫu dung dịch trên vào hệ thống sắc ký HPLC và ghi lại sắc ký đồ. - Xác định hệ số tƣơng quan, biện luận giá trị b của phƣơng trình hồi quy.
- Xử lý kết quả bằng phần mềm MS-Excel, lập phƣơng trình đƣờng thẳng biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic. Mối tƣơng quan tuyến tính đƣợc thiết lập bằng cách xác định phƣơng trình ŷ = ax + b, tính hệ số tƣơng quan R2. Sử dụng cơng cụ phân tích hồi quy (Regression) trong phần mềm MS-Excel để kiểm tra tính tuyến tính của phƣơng trình hồi quy và ý nghĩa của các hệ số trong phƣơng trình với khoảng tin cậy là 95%.
Yêu cầu: hệ số tƣơng quan R2 ≥ 0,9990.
d) Độ lặp lại
- Độ lặp lại đƣợc thực hiện bằng cách định lƣợng ít nhất 6 mẫu thử khác nhau. - Xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối của hàm lƣợng mẫu thử.
Mẫu thử: cân chính xác 1000 mg cao khơ Lá đắng, thêm MeOH vừa đủ trong bình định mức 10 ml, siêu âm 30 0C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu thử đƣợc tiêm vào hệ thống HPLC. Thực hiện 6 mẫu thử lặp lại. Tính % RSD của 6 mẫu.
Yêu cầu: Giá trị RSD (%) giữa các kết quả định lƣợng phải ≤ 2,0% [38].
e) Độ chính ác trung gian
Tiến hành tƣơng tự nhƣ độ lặp lại nhƣng thực hiện ngày khác và khác kiểm nghiệm viên.
Tính giá trị RSD (%) của các kiểm nghiệm viên
Thống kê so sánh giá trị trung bình giữa 2 kiểm nghiệm viên
Yêu cầu [38]:
- Giá trị RSD (%) của 6 mẫu định lƣợng riêng biệt với mỗi kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%
- Giá trị RSD (%) của 12 mẫu định lƣợng riêng biệt với mỗi kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%
- 2 kiểm nghiệm viên đồng nhất thống kê
f) Độ đúng
Độ đúng biểu thị bằng giá trị tỷ lệ phục hồi % của giá trị tìm thấy chất chuẩn thêm vào mẫu thử ở 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi mức nồng độ thực hiện 3 lần.
Pha các dung dịch độ đúng: cân chính xác khoảng 1000 mg cao khơ Lá đắng cho
vào bình định mức 10 ml, thêm chính xác thể tích dung dịch gốc độ đúng ở tỷ lệ tƣơng ứng Bảng 3.8 bên dƣới. Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, siêu âm 30 0C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 10 phút. Lọc qua màng 0,45 µm. Mỗi nồng độ thực hiện 3 mẫu, tính tỷ lệ phục hồi của từng mẫu và tính giá trị RSD (%) của 3 mẫu trong cùng nồng độ.