Chƣơng 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. NGUYÊN VẬT LIỆU – TRANG THIẾT BỊ
3.3.2. Nghiên cứu công thức bào chế viên nén chứa cao Lá đắng ở quy mơ phịng
phịng thí nghiệm.
Tóm tắt chất lƣợng mục tiêu của viên nén chứa cao Lá đắng
Bảng 3.9. Đặc điểm chất lƣợng mong muốn của viên nén Lá đắng
Chỉ tiêu CQA
Cảm quan Viên màu nâu, hình caplet, hai mặt lồi, mặt viên nhẵn, cạnh và thành viên lành lặn
Độ cứng ≥ 80 N
Độ rã ≤ 15 phút (900 giây)
Độ đồng đều khối lƣợng ± 5% so với khối lƣợng trung bình
Độ mài mịn ≤ 1%
Định lƣợng Luteolin (μg) ≥ 50 μg
3.3.2.1. Thiết kế thực nghiệm
Dựa vào liều cao tồn phần có tác dụng hạ huyết áp trên chuột đã đƣợc chứng minh là 1000 mg/kg [15]. Dựa vào bảng ngoại suy liều tƣơng đƣơng giữa các lồi [13], ta tính liều cao dùng cho ngƣời khoảng 60 kg là
Liều dùng cho ngƣời = liều có tác dụng trên chuột * hệ số quy đổi * 60 = 1000 * 0,085 * 60 = 5110 mg
Bảng 3.10. Đề nghị công thức cơ bản viên nén Lá đắng Thành phần Khối lƣợng Thành phần Khối lƣợng (mg/viên) Tỷ lệ (%) Khối lƣợng lô 300 viên (g) Cao Lá đắng 750 75 225
Natri croscarmellose Thăm dò
PVP K30 Thăm dò
Avicel PH-102 Vừa đủ 1000
Aerosil Thăm dò
Magnesium stearate 20 2 6
Tổng 1000 100 2000
Dự kiến thăm dị các thuộc tính thiết yếu sau:
- Độ rã: thăm dị lƣợng tá dƣợc natri crosscarmellose - Độ cứng: thăm dò lƣợng tá dƣợc dính PVP
- Đồng đều khối lƣợng: thăm dò lƣợng tá dƣợc aerosil
Biến độc lập:
- Lƣợng natri crosscarmellose (%) với 3 mức (5%, 10% và 15%) - Lƣợng tá dƣợc dính PVP K30 (%) với 2 mức (0% và 5%) - Lƣợng tá dƣợc trơn aerosil (%) với 2 mức (1% và 2%)
Biến phụ thuộc (thuộc tính chất lượng thiết yếu):
- Thời gian rã (giây) - Độ cứng (N)
Đánh giá các biến phụ thuộc trong q trình xây dựng cơng thức
- Độ rã: lấy 6 viên nén bất kỳ, đo độ rã trên máy thử độ rã PHARMETEST TYPE PTZ S/DIST 3. Yêu cầu: không quá 15 phút (900 giây) tồn bộ 6 viên rã hết, khơng còn cắn trên mặt lƣới.
- Độ cứng: Lấy 10 viên nén bất kỳ, đo độ cứng từng viên trên máy đo độ cứng PHARMATEST TYPE PTB 331E. Yêu cầu: tồn bộ 10 viên đều có độ cứng ≥ 80 N
- Độ đồng đều khối lƣợng: cân riêng biệt 20 đơn vị lấy ngẫu nhiên, tính khối lƣợng trung bình. u cầu: Khơng đƣợc có q hai đơn vị có khối lƣợng nằm ngồi chênh lệch ± 5% khối lƣợng trung bình và khơng có đơn vị nào vƣợt gấp đơi giới hạn đó.
Tiêu chí lựa chọn cơng thức viên nén tốt nhất trong các công thức khảo sát thực nghiệm:
- Thời gian rã (giây): ≤ 900 giây
- Độ cứng: ≥ 80 N
- Viên có thời gian rã nhanh, độ cứng cao sẽ đƣợc ƣu tiên chọn.
Sử dụng phần mềm Design Expert 12.0 để thiết kế thực nghiệm với mơ hình thiết kế là D-optimal. Các cơng thức thực nghiệm đƣợc trình bày trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Công thức thực nghiệm lô labo (300 viên) Công thức Thành phần SCC (%) PVP K30 (%) Aerosil (%) CT 1 5 0 1 CT 2 5 0 2 CT 3 10 0 1 CT 4 10 0 2 CT 5 15 0 1 CT 6 15 0 2 CT 7 5 5 1 CT 8 5 5 2 CT 9 10 5 1 CT10 10 5 2 CT11 15 5 1 CT12 15 5 2
3.3.2.2. Quy trình bào chế
Bào chế mỗi cơng thức thực nghiệm lô 300 viên:
Bảng 3.12. Khối lƣợng thực tế của 12 công thức ở lô 300 viên
Công thức Thành phần Cao Lá đắng (g) PVP K30 (g) SCC (g) Aerosil (g) Magie stearate (g) Avicel PH 102 (g) CT1 225 0 15 3 6 51 CT2 225 0 15 6 6 48 CT3 225 0 3 3 6 63 CT4 225 0 3 6 6 60 CT5 225 0 45 3 6 21 CT6 225 0 45 6 6 18 CT7 225 15 15 3 6 36 CT8 225 15 15 6 6 33 CT9 225 15 3 3 6 48 CT10 225 15 3 6 6 45 CT11 225 15 45 3 6 6 CT12 225 15 45 6 6 3
- Cân đong nguyên liệu: cao khô Lá đắng, tá dƣợc rã, tá dƣợc dính, avicel PH-102,
magie stearate, aerosil (rây qua rây 355) bằng cân kỹ thuật.
- Trộn ban đầu: gồm cao Lá đắng, tá dƣợc rã, tá dƣợc dính, avicel PH-102 bằng
máy trộn đa năng LHU TYPE 01, trộn đều với tốc độ 250 vịng/phút trong 1 phút. Sau đó lấy bột ra và đƣa đi trộn hoàn tất.
- Trộn hoàn tất: cho aerosil, magie stearate vào khối bột đã trộn ban đầu, trộn với
tốc độ 100 vòng/phút trong 3 phút trên máy trộn lập phƣơng LHU TYPE 04.
- Dập viên: máy dập viên xoay tròn Shree Bhagwati với 6 chày, tốc độ quay mâm
20 vòng/phút, tốc độ quay của bàn phân phối ở mức 2 – 3. Bộ cối chày loại viên nén caplet.
Hình 3.1. Sơ đồ các giai đoạn bào chế viên nén Lá đắng.
3.3.2.3. Đánh giá các TCCL của cốm bán thành phẩm
Cốm sau khi trộn hoàn tất đƣợc kiểm tra các chỉ tiêu sau:
a) Cảm quan cốm
Yêu cầu: Bột có màu nâu, tơi, mịn, đồng nhất, không bị tách lớp.
b) Độ ẩm cốm
Xác định bằng cân sấy ẩm Ohaus, cho khoảng 600 mg bột viên vào đĩa cân sấy ẩm, bấm cho cân chạy, ghi nhận độ ẩm của cao sau khi cân đo xong.
Yêu cầu: 2 – 4 %
c) Tỷ trọng gõ
Cân 100 g bột cốm cho vào ống đong 250 ml, đọc thể tích biểu kiến ban đầu Vbđ. Tiến hành khảo sát số lần gõ 10, 500 và 1250 trên cùng một bột viên và đọc thể tích
Cân nguyên liệu
Trộn ban đầu
Máy trộn đa năng LHU TYPE 01 250 vòng/phút trong 1 phút (cao Lá đắng, tá dƣợc rã, tá dƣợc dính,
avicel PH-102)
Trộn hồn tất
Máy trộn lập phƣơng LHU TYPE 4 100 vòng/phút trong 3 phút Aerosil,
magie stearate
Kiểm tra cảm quan, độ cứng,
độ đồng đều khối lƣợng, độ rã, định lƣợng
Dập viên
Máy dập viên xoay tròn 6 chày
Kiểm tra cốm bán thành phẩm
gõ tƣơng ứng V10, V500, V1250. Nếu sự khác nhau giữa V10 và V500 không quá 2 ml, chọn số lần gõ là 500. Ngƣợc lại nếu lớn hơn 2 ml thì ta so sánh sự khác nhau V500 với V1250, nếu khơng q 2 ml thì chọn số lần gõ là 1250 lần, ngƣợc lại thì tiếp tục gõ thêm 1250 lần và so sánh thể tích. Thực hiện đến khi nào sự chênh lệch thể tích giữa 2 lần liên tiếp khơng q 2 ml. Tính tỷ trọng gõ (dgõ) và tỷ trọng biểu kiến ban đầu (dbđ) theo công thức sau:
dgõ = mcân Vgõ (g/ml) dbđ = mcân Vbđ (g/ml) - Chỉ số Carr (CI) CI = dgõ - dbđ dgõ x 100 - Chỉ số Hausner (HR) HR = dgõ dbđ
Tiến hành đánh giá các chỉ số Carr và chỉ số Hausner theo bảng 3.13
Bảng 3.13. Đánh giá chỉ số Carr và chỉ số Hausner
Mức độ Chỉ số Carr Chỉ số Hausner Rất tốt 0 – 10 1,00 – 1,11 Tốt 11 – 15 1,12 – 1,18 Khá tốt 16 – 20 1,19 – 1,25 Đƣợc 21 – 25 1,26 – 1,34 Kém 26 – 31 1,35 – 1,45 Rất kém > 31 > 1,45 d) Góc nghỉ
Đặt phễu trên giá sao cho đáy phễu cách mặt phẳng phía dƣới trong khoảng từ 2 – 2,5 cm, sau đó cho bột viên vào phễu cho đến khi đỉnh của bột viên chám đáy phễu thì ngƣng. Đo chiều cao của khối chóp và đƣờng kính của đáy khối chóp, từ đó tính
góc chảy của bột viên. Đánh giá độ chảy của bột viên theo góc nghỉ dựa theo bảng 3.14
Bảng 3.14. Đánh giá độ trơn chảy bột viên theo góc nghỉ
Góc nghỉ Đánh giá độ trơn chảy
25 – 30 Chảy rất tốt
31 – 35 Chảy tốt
36 – 40 Chảy khá tốt
40 – 45 Chảy đƣợc
46 – 55 Chảy kém
> 55 Rất kém hoặc không chảy
e) Phân bố kích thước hạt
Cân 50 g bột viên. Dùng các số rây 0, 125, 250, 355, 500 μm. Cài đặt mức độ rung 60, rung liên tục, thời gian 10 phút. Sau đó cân khối lƣợng cốm và tính phần trăm trên từng số rây (Di) theo cơng thức sau:
Di= mi
∑mi x 100% với i = 0, 125, 250, 355, 500 Trong đó: mi là khối lƣợng của cốm tƣơng ứng với số rây thứ i.
3.3.2.4. Đánh giá các TCCL của viên nén Lá đắng
a) Cảm quan: viên màu nâu, hình caplet, hai mặt lồi, mặt viên nhẵn, cạnh và
thành viên lành lặn
b) Độ cứng
- Lấy 10 viên bất kì trong lơ thuốc.
- Thử độ cứng bằng máy đo độ cứng PHARMATEST TYPE PTB 331E.
Yêu cầu: độ cứng phải ≥ 80N
c) Độ rã
- Thử theo chuyên luận thử độ rã của viên nén và viên nang thông thƣờng nhƣ trong DĐVN V – Phụ lục 11.6;
- Lấy 6 viên bất kì trong lơ thuốc, mỗi viên cho vào một trong 6 ống của bộ cốc thử độ rã;
- Vận hành máy đo độ rã PHARMETEST TYPE PTZ S/DIST 3 với tần số 30 lần trên phút trong 15 phút (900 giây).
Yêu cầu: thời gian rã khơng q 900 giây, khơng cịn cắn thuốc nằm trên mặt lƣới
d) Độ đồng đều khối lượng
Phƣơng pháp: phụ lục 11.3 – DĐVN V
Yêu cầu: ± 5% khối lƣợng trung bình viên, khơng q 2 viên nằm ngoài giới hạn và
khơng có viên nào nằm ngồi khoảng gấp đơi giới hạn.
e) Độ mài mòn
- Cân 10 viên bất kì bằng cân phân tích (mtrƣớc) cho vào trống đo độ mài mòn của máy đo độ mài mòn PHARMATEST PTF E/ER
- Vận hành máy với tốc độ 25 vịng/phút trong 4 phút
- Sau đó lấy viên ra phủi bụi và cân lại các viên một lần nữa bằng cân phân tích (msau).
- Tính phần trăm độ mài mịn theo cơng thức sau:
Độ mài m n mtrƣớc msau
mtrƣớc 100
Yêu cầu: độ mài mòn < 1%
f) Định lượng
- Định lƣợng: Phƣơng pháp HPLC [11], [40], [64], sử dụng luteolin làm chất chỉ
điểm cho viên nén Lá đắng.
Chuẩn bị mẫu
+ Mẫu chuẩn gốc: cân chính xác 10 mg luteolin chuẩn hòa tan với lƣợng vừa đủ MeOH trong bình định mức 50 ml. Hút chính xác 25 ml dung dịch vừa pha pha loãng với lƣợng vừa đủ MeOH trong bình định mức 100 ml. Dung dịch thu đƣợc có nồng độ luteolin khoảng 50 μg/ml.
+ Mẫu chuẩn: hút chính xác 4 ml dung dịch chuẩn gốc pha lỗng với lƣợng vừa đủ MeOH trong bình định mức 25 ml. Dung dịch thu đƣợc có nồng độ luteolin khoảng 8 μg/ml.
+ Mẫu thử: cân chính xác 1250 mg bột viên nén Lá đắng, thêm MeOH vừa đủ trong bình định mức 10 ml, siêu âm 30 0
C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu thử đƣợc tiêm vào hệ thống HPLC.
Điều kiện sắc ký:
+ Pha động: acetonitril (A) và acid phosphoric 0,2% (B) (4:6), thời gian chạy là 10 phút
+ Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C18 (5 mcg x 4,6 x 100 mm) + Đầu dị DAD, bƣớc sóng phát hiện: 347 nm
+ Tốc độ dịng: 1 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 25 µl + Nhiệt độ cột: 30 ± 1 oC
Hàm lƣợng (μg) luteolin trong 1 viên nén Lá đắng 1 g là:
luteolin ( g) ST SC mC H DC mTB DT mc n 1000 1 1,25
Xluteolin (µg): hàm lƣợng luteolin trong viên nén Lá đắng ST: diện tích pic của mẫu thử
SC: diện tích pic của mẫu chuẩn mC: khối lƣợng cân chất chuẩn (mg) H%: hàm lƣợng chất chuẩn luteolin (%)
mcân: khối lƣợng bột thuốc cân định lƣợng (mg) mTB: khối lƣợng trung bình viên (mg)
DC: độ pha lỗng mẫu chuẩn DT: độ pha loãng mẫu thử Yêu cầu: ≥ 50 μg
3.3.2.5. Thực nghiệm kiểm chứng công thức đƣợc lựa chọn
Bào chế 3 lô theo công thức đƣợc chọn và quy trình lơ labo, kiểm tra các tiêu chuẩn chất lƣợng để kiểm chứng tính lặp lại của các TCCL của công thức đƣợc chọn.
3.3.2.6. Thẩm định quy trình định lƣợng luteolin trong viên nén Lá đắng bằng phƣơng pháp HPLC
Quy trình định lƣợng [11], [40], [64]
Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác 10 mg luteolin chuẩn hòa tan với lƣợng vừa đủ MeOH trong bình định mức 50 ml. Hút chính xác 25 ml dung dịch vừa pha pha lỗng với lƣợng vừa đủ MeOH trong bình định mức 100 ml. Dung dịch thu đƣợc có nồng độ luteolin khoảng 50 μg/ml.
Điều kiện sắc ký
+ Pha động: acetonitril (A) và acid phosphoric 0,2% (B) (4:6), thời gian chạy là 10 phút
+ Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C18 (5 mcg x 4,6 x 100 mm) + Đầu dị DAD, bƣớc sóng phát hiện: 347 nm
+ Tốc độ dịng: 1 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 25 µl + Nhiệt độ cột: 30 ± 1 oC a) Tính tƣơng thích hệ thống Thực hiện theo mục 3.3.1.6 b) Độ đặc hiệu
- Mẫu placebo: cân chính xác khoảng 625 mg placebo cho vào bình định mức 10 ml, thêm 10 ml methanol, siêu âm trong 15 phút, thêm methanol đến vạch, lọc qua màng 0,45 µm.
- Mẫu chuẩn: sử dụng dung dịch tuyến tính mẫu 100%
- Mẫu thử: cân chính xác 1250 mg bột viên, thêm MeOH vừa đủ trong bình định mức 10 ml, siêu âm 30 0C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu thử đƣợc tiêm vào hệ thống HPLC.
Triển khai sắc ký: chạy lần lƣợt mẫu placebo, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và placebo thêm chuẩn.
Ghi nhận sắc ký đồ của các mẫu.
Hệ số tƣơng đồng ( ) Tth Tchuẩn
Trong đó: Tthử,Tchuẩn lần lƣợt là thời gian lƣu của pic mẫu thử và mẫu chuẩn.
Yêu cầu:
- Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn: thời gian lƣu của pic chính trong mẫu thử phải tƣơng đƣơng với mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ mẫu placebo khơng có pic trùng với pic của hoạt chất.
- Khi thêm một lƣợng chất chuẩn vào một placebo, diện tích pic của placebo phải tăng lên so với trƣớc khi thêm chất đối chiếu.
c) Tính tuyến tính – khoảng tuyến tính
Thực hiện theo mục 3.3.1.6
d) Độ lặp lại
- Độ lặp lại đƣợc thực hiện bằng cách định lƣợng ít nhất 6 mẫu thử khác nhau. - Xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối của hàm lƣợng mẫu thử.
Mẫu thử: cân chính xác 1250 mg bột viên, thêm MeOH vừa đủ trong bình định mức 10 ml, siêu âm 30 0C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu thử đƣợc tiêm vào hệ thống HPLC. Thực hiện 6 mẫu thử lặp lại. Tính % RSD của 6 mẫu.
Yêu cầu: Giá trị RSD (%) giữa các kết quả định lƣợng phải ≤ 2,0% [38].
e) Độ chính ác trung gian
Tiến hành tƣơng tự nhƣ độ lặp lại nhƣng thực hiện ngày khác và khác kiểm nghiệm viên.
Tính giá trị RSD (%) của các kiểm nghiệm viên
Thống kê so sánh giá trị trung bình giữa 2 kiểm nghiệm viên
Yêu cầu [38]:
- Giá trị RSD (%) của 6 mẫu định lƣợng riêng biệt với mỗi kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%
- Giá trị RSD (%) của 12 mẫu định lƣợng riêng biệt với mỗi kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%
- 2 kiểm nghiệm viên đồng nhất thống kê
f) Độ đúng
Pha dung dịch placebo đậm đặc: cân chính xác khoảng 7,5 g placebo cho vào bình
định mức 200 ml, thêm MeOH vừa đủ trong bình định mức 200 ml, siêu âm 30 0C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 20 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Pha các dung dịch độ đúng: Hút chính xác 5 ml dung dịch Placebo đậm đặc cho
vào bình định mức 10 ml, thêm chính xác thể tích dung dịch chuẩn gốc độ đúng ở tỷ lệ tƣơng ứng Bảng 3.15 bên dƣới. Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, siêu âm 30 0C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 10 phút. Lọc qua màng 0,45 µm. Mỗi nồng độ thực hiện 3 mẫu, tính tỷ lệ phục hồi của từng mẫu và tính giá trị RSD (%) của 3 mẫu trong cùng nồng độ.
Bảng 3.15. Pha các dung dịch độ đúng
Tỷ lệ (%) 75 100 125
Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml) 1,2 1,6 2,0
Tƣơng ứng lƣợng luteolin chuẩn thêm vào 5,7474 7,6632 9,579
Yêu cầu:
- Tỷ lệ hồi phục: 80 – 110% [47] - Giá trị RSD ≤ 2% [38]