Chƣơng 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. NGUYÊN VẬT LIỆU – TRANG THIẾT BỊ
3.3.1. Chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao Lá đắng
3.3.1.1. Chiết cao Lá đắng ở lơ 500 g
Tóm tắt chất lƣợng mục tiêu của cao khô Lá đắng:
Bảng 3.4. Đặc điểm chất lƣợng mong muốn của cao Lá đắng
Chỉ tiêu CQA
Cảm quan Cao khô, màu nâu đồng nhất, tơi, mịn, mùi thơm đặc trƣng, vị đắng
Độ ẩm ≤ 5%
Hiệu suất chiết ≥ 15,0%
Định tính Các vết trong mẫu thử có Rf tƣơng ứng với các vết mẫu chuẩn
Định lƣợng luteolin (%) ≥ 0,005% luteolin Chiết xuất cao đặc Lá đắng
Nguyễn Lê Hoài Tâm (2019), cao nƣớc chiết nóng từ Lá đắng có hiệu quả trong tác dụng hạ huyết áp ở chuột [15], nên đề tài tiếp tục sử dụng nƣớc cất làm dung môi chiết và thực hiện chiết theo phƣơng pháp chiết nóng.
Bảng 3.5. Quy trình chiết xuất dƣợc liệu Lá đắng
Dung môi Phƣơng pháp Nguyên liệu Thời gian,
nhiệt độ 500 g bột lá
Nƣớc cất Chiết nóng 5000 ml x 3 lần 100 ºC, 30 phút Bột lá của cây Lá đắng đƣợc chiết nóng với dung mơi nƣớc cất ở nhiệt độ 100 ºC/30 phút/lần, thực hiện chiết 3 lần mỗi lần với 5000 ml dung môi (Bảng 3.5), lọc qua vải. Gom dịch chiết, cô trực tiếp trên bếp điện ở 70 – 90 ºC có hỗ trợ máy khuấy đũa 300 vịng/phút. Cơ đến khi thu đƣợc cao có độ ẩm khoảng 15% .
3.3.1.2. Khảo sát tá dƣợc điều chế cao khô Lá đắng
Để rút ngắn thời gian cơ cao, cải thiện tính chất và lƣu tính của cao khơ cần bổ sung loại và lƣợng tá dƣợc thích hợp. Tá dƣợc đƣợc lựa chọn khảo sát là lactose DC, aerosil, avicel PH 102. Cho một lƣợng cao đặc tƣơng đƣợc 50 g dƣợc liệu vào 9
chén sứ, trộn đều với các tá dƣợc lần lƣợt theo tỷ lệ dƣợc liệu khô : tá dƣợc là 5:1, 10:1, 15:1. Sấy trong tủ sấy 80 °C trong 48 giờ. Nghiền mịn, rây qua rây 0,5 mm.
Bảng 3.6. Khảo sát tỷ lệ dƣợc liệu : tá dƣợc điều chế cao Lá đắng
Lactose Aerosil Avicel Khối lƣợng tá dƣợc
Mẫu 1 5:1 10 g Mẫu 2 10:1 5 g Mẫu 3 15:1 3,33 g Mẫu 4 5:1 10 g Mẫu 5 10:1 5 g Mẫu 6 15:1 3,33 g Mẫu 7 5:1 10 g Mẫu 8 10:1 5 g Mẫu 9 15:1 3,33 g
Mỗi mẫu tá dƣợc thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình. Đánh giá thời gian cơ, độ ẩm cao, tính chất, lƣu tính cao để chọn loại và lƣợng tá dƣợc phù hợp.
3.3.1.3. Kiểm tra chất lƣợng cao khô Lá đắng lô 500 g
- Cảm quan: Bột có màu nâu, đồng nhất, mùi đặt trƣng, vị đắng.
- Độ ẩm: xác định bằng cân sấy ẩm Ohaus, cho khoảng 600 mg cao vào đĩa cân sấy ẩm, bấm cho cân chạy, ghi nhận độ ẩm của cao sau khi cân đo xong. Mỗi mẫu thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình. Yêu cầu: ≤ 5%
- Định tính: bằng phƣơng pháp SKLM
+ Mẫu thử: lấy một lƣợng nhỏ cao khơ Lá đắng hịa với 5 ml MeOH. Lắc siêu âm
đến tan. Lọc qua màng lọc 0,45 μm
+ Mẫu đối chiếu cao toàn phần Lá đắng: cân 2,5 g dƣợc liệu Lá đắng cho vào bình nón 100ml, thêm 50 ml nƣớc cất và đun trên bếp cách thủy 10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Lọc dịch chiết qua bông, cô dịch lọc đến cắn rồi hòa tan với 5 ml MeOH. Lọc dịch chiết MeOH qua màng lọc 0,45 μm.
+ Mẫu chuẩn luteolin: lấy một lƣợng nhỏ luteolin chuẩn hòa với 5 ml MeOH. Lắc siêu âm đến tan. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Tiến hành chấm lần lƣợt mẫu thử - mẫu đối chiếu cao toàn phần Lá đắng, mẫu thử - mẫu chuẩn luteolin
+ Bản sắc ký: bản silica gel F254 (Merck)
+ Dung môi khai triển: EtOAc-Cloroform-MeOH-HCOOH (10:1:1:0,5). + Phát hiện bằng thuốc thử FeCl3 1% trong cồn và thuốc thử VS 1%/H2SO4.
3.3.1.4. Chiết xuất cao Lá đắng ở lô 6500 g
- Nguyên liệu: 6500 g bột lá của Lá đắng - Thiết bị: nồi nấu cao 300 Lít LHU
+ Chiết nóng 3 lần, mỗi lần chiết với khoảng 115 Lít nƣớc cất. Nhiệt độ: 100 0C. Thời gian: 2 giờ/lần. Tốc độ vòng quay: 55 vịng/phút
+ Cơ trực tiếp trên nồi nấu cao 300 Lít LHU ở 70 – 90 ºC. Cơ đến khi thu đƣợc cao có độ ẩm khoảng 15%
3.3.1.5. Điều chế cao khô Lá đắng lô 6500 g
- Sử dụng loại và lƣợng tá dƣợc điều chế cao khô đã lựa chọn ở mục 3.3.1.2 - Sấy trong tủ sấy 80 0C/48 giờ
- Nghiền mịn và rây qua rây 0,5 mm
3.3.1.6. Kiểm tra chất lƣợng cao khô Lá đắng lô 6500 g
- Cảm quan: thực hiện theo mục 3.3.1.3 - Độ ẩm: thực hiện theo mục 3.3.1.3 - Định tính: thực hiện theo mục 3.3.1.3
- Định lƣợng: Phƣơng pháp HPLC [11], [40], [64], sử dụng luteolin làm chất chỉ
điểm cho cao Lá đắng.
Chuẩn bị mẫu
+ Mẫu chuẩn gốc: cân chính xác 10,0 mg luteolin chuẩn hòa tan với lƣợng vừa đủ MeOH trong bình định mức 50 ml. Hút chính xác 25 ml dung dịch vừa pha, pha lỗng trong bình định mức 100 ml bằng MeOH. Dung dịch thu đƣợc có nồng độ luteolin khoảng 50 μg/ml
+ Mẫu chuẩn: hút chính xác 4 ml dung dịch chuẩn gốc pha loãng với lƣợng vừa đủ MeOH trong bình định mức 25 ml. Dung dịch thu đƣợc có nồng độ luteolin khoảng 8 μg/ml.
+ Mẫu thử: cân chính xác 1000 mg cao khơ Lá đắng vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH vừa đủ, siêu âm 30 0C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Điều kiện sắc ký:
+ Pha động: acetonitril (A) và acid phosphoric 0,2% (B) (4:6), thời gian chạy là 10 phút
+ Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C18 (5 mcg x 4,6 x 100 mm) + Đầu dị DAD, bƣớc sóng phát hiện: 347 nm
+ Tốc độ dịng: 1 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 25 µl + Nhiệt độ cột: 30 ± 1 oC
Hàm lƣợng (%) luteolin trong cao khơ Lá đắng đƣợc tính theo cơng thức:
ST SC mC H DC DT mT 100 Trong đó:
X: hàm lƣợng (%) luteolin có trong cao dƣợc liệu. ST: diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch thử. SC: diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch đối chiếu. DT: độ pha loãng mẫu thử.
DC: độ pha loãng mẫu đối chiếu.
H%: hàm lƣợng chất đối chiếu theo phƣơng pháp quy về 100% diện tích pic. mC: khối lƣợng đối chiếu (mg).
3.3.1.7. Thẩm định quy trình định lƣợng luteolin trong cao khô Lá đắng bằng phƣơng pháp HPLC
a) Tính tƣơng thích hệ thống
Mẫu: chuẩn 100%
Cách tiến hành: chạy sắc ký 6 mẫu chuẩn 100%. Ghi lại sắc ký đồ và xác định mức độ đáp ứng của các tiêu chỉ đánh giá.
Yêu cầu:
Sắc ký đồ 6 mẫu chạy lặp lại dung dịch chuẩn gốc:
- Giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lƣu của 6 lần chạy < 2,0% - Hệ đối xứng của pic luteolin 0,8 < As < 1,5
b) Độ đặc hiệu
- Mẫu chuẩn: sử dụng dung dịch tuyến tính mẫu 100%
- Mẫu thử: cân chính xác 1000 mg cao khơ Lá đắng, thêm MeOH vừa đủ trong bình định mức 10 ml, siêu âm 30 0C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu thử đƣợc tiêm vào hệ thống HPLC.
Triển khai sắc ký: chạy lần lƣợt mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn.
Ghi nhận sắc ký đồ của các mẫu.
Tính hệ số tƣơng đồng giữa pic luteolin của mẫu thử và mẫu chuẩn.
Hệ số tƣơng đồng ( ) Tth Tchuẩn
Trong đó: Tthử,Tchuẩn lần lƣợt là thời gian lƣu của pic mẫu thử và mẫu chuẩn.
Yêu cầu:
- Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn: thời gian lƣu của pic chính trong mẫu thử phải tƣơng đƣơng với mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ mẫu trắng khơng có pic trùng với pic của hoạt chất.
- Khi thêm một lƣợng chất chuẩn vào một mẫu thử, diện tích pic của hoạt chất phải tăng lên so với trƣớc khi thêm chất đối chiếu.
c) Tính tuyến tính – khoảng tuyến tính
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn với 5 nồng độ: Pha dãy dung dịch chuẩn: lấy chính xác thể tích dung dịch chuẩn gốc tuyến tính tƣơng ứng với Bảng 3.7, cho vào bình định mức 25 ml thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Ta đƣợc các nồng độ luteolin tuyến tính.
Bảng 3.7. Pha các dung dịch chuẩn Thể tích dung dịch Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml) Độ pha loãng (ml) Nồng độ luteolin (ppm) Nồng độ luteolin (%) 2 25 4 50 4 25 8 100 6 25 12 150 8 25 16 200 10 25 20 250
- Chạy mỗi mẫu dung dịch trên vào hệ thống sắc ký HPLC và ghi lại sắc ký đồ. - Xác định hệ số tƣơng quan, biện luận giá trị b của phƣơng trình hồi quy.
- Xử lý kết quả bằng phần mềm MS-Excel, lập phƣơng trình đƣờng thẳng biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic. Mối tƣơng quan tuyến tính đƣợc thiết lập bằng cách xác định phƣơng trình ŷ = ax + b, tính hệ số tƣơng quan R2. Sử dụng cơng cụ phân tích hồi quy (Regression) trong phần mềm MS-Excel để kiểm tra tính tuyến tính của phƣơng trình hồi quy và ý nghĩa của các hệ số trong phƣơng trình với khoảng tin cậy là 95%.
Yêu cầu: hệ số tƣơng quan R2 ≥ 0,9990.
d) Độ lặp lại
- Độ lặp lại đƣợc thực hiện bằng cách định lƣợng ít nhất 6 mẫu thử khác nhau. - Xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối của hàm lƣợng mẫu thử.
Mẫu thử: cân chính xác 1000 mg cao khơ Lá đắng, thêm MeOH vừa đủ trong bình định mức 10 ml, siêu âm 30 0C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu thử đƣợc tiêm vào hệ thống HPLC. Thực hiện 6 mẫu thử lặp lại. Tính % RSD của 6 mẫu.
Yêu cầu: Giá trị RSD (%) giữa các kết quả định lƣợng phải ≤ 2,0% [38].
e) Độ chính ác trung gian
Tiến hành tƣơng tự nhƣ độ lặp lại nhƣng thực hiện ngày khác và khác kiểm nghiệm viên.
Tính giá trị RSD (%) của các kiểm nghiệm viên
Thống kê so sánh giá trị trung bình giữa 2 kiểm nghiệm viên
Yêu cầu [38]:
- Giá trị RSD (%) của 6 mẫu định lƣợng riêng biệt với mỗi kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%
- Giá trị RSD (%) của 12 mẫu định lƣợng riêng biệt với mỗi kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%
- 2 kiểm nghiệm viên đồng nhất thống kê
f) Độ đúng
Độ đúng biểu thị bằng giá trị tỷ lệ phục hồi % của giá trị tìm thấy chất chuẩn thêm vào mẫu thử ở 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi mức nồng độ thực hiện 3 lần.
Pha các dung dịch độ đúng: cân chính xác khoảng 1000 mg cao khơ Lá đắng cho
vào bình định mức 10 ml, thêm chính xác thể tích dung dịch gốc độ đúng ở tỷ lệ tƣơng ứng Bảng 3.8 bên dƣới. Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, siêu âm 30 0C trong 15 phút, lắc đều, để lắng 10 phút. Lọc qua màng 0,45 µm. Mỗi nồng độ thực hiện 3 mẫu, tính tỷ lệ phục hồi của từng mẫu và tính giá trị RSD (%) của 3 mẫu trong cùng nồng độ.
Bảng 3.8. Pha các dung dịch độ đúng – cao khô Lá đắng
Tỷ lệ (%) 75 100 125
Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml) 1,2 1,6 2,0
Tƣơng ứng lƣợng luteolin chuẩn thêm vào 5,7474 7,6632 9,579
Yêu cầu:
- Tỷ lệ hồi phục: 80 – 110% [47] - Giá trị RSD ≤ 2% [38]