Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số hợp chất từ cây ráng đại (acrostichum aureum l ) ở việt nam

TỔNG QUAN

Tổng quan về thực vật

1.1.1 Thực vật họ Ráng sẹo gà (Pteridaceae)

Họ Ráng sẹo gà, với tên khoa học là Pteridaceae, thuộc bộ Polypodiales (bộ Dương xỉ) và bao gồm khoảng 50 chi cùng hơn 1000 loài Các loài trong họ Pteridaceae chủ yếu phân bố ở các vùng nhiệt đới và ôn đới, thể hiện sự đa dạng sinh thái phong phú, từ thực vật thủy sinh đến các loài sống ở vùng sa mạc và những nơi khô cằn theo mùa.

Thực vật họ Pteridaceae được nhận diện qua các cấu trúc sản sinh bào tử nằm dọc theo gân lá ở mặt dưới hoặc tại đầu gân lá Vách túi bào tử có một vòng cơ màng tế bào dày, giúp đẩy bào tử bay xa khi túi bào tử chín Bào tử thường có hình cầu, mặc dù một số ít có dạng tứ diện Lá của cây thường có hình dạng lá lược, và cây có thể là dạng thân leo hoặc thân thẳng đứng.

Dựa vào đặc điểm hình thái và khu vực sinh sống trên thế giới, các nhà khoa học đã chia họ Pteridaceae thành 4 nhóm chi chính, bao gồm [5]:

Andiantoid là một nhóm thực vật gồm từ 6 đến 12 chi và khoảng 300 loài, nổi bật với các túi bào tử nhỏ nằm dọc theo mép lá Các loài trong nhóm này chủ yếu phân bố ở khu vực rừng nhiệt đới phía đông Bắc Mỹ và các quốc gia Đông Á.

Cheilanthoid là một nhóm thực vật bao gồm 20 chi và khoảng 400 loài, thường sống trong môi trường đất đá khô cằn và khí hậu khắc nghiệt Các loài này có đặc điểm nổi bật với lớp lá dày như sáp, có lông và vảy dày Khi thời tiết khô hạn, lá của chúng thường cuộn tròn lại, trong khi khi có mưa, lá sẽ mở rộng ra.

Pteridoid là một nhóm thực vật bao gồm từ 14 đến 17 chi với khoảng 400 loài, chủ yếu phân bố ở các vùng ôn đới và nhiệt đới ấm Các loài trong nhóm này thường sống biểu sinh trong môi trường ẩm ướt Lá của chúng thường không có vảy hoặc có hình tam giác nổi bật, thường mang hình dạng lông chim và có các túi bào tử ở rìa lá.

 Hemionitidoid: Chi này bao gồm các loài sống thượng sinh hay biểu sinh trong môi trường ẩm ướt hoặc nửa khô

Họ Ráng sẹo gà có sự đa dạng về hình thái và sinh thái, dẫn đến sự phong phú về thành phần cấu tạo và hoạt tính sinh học của các loài cây trong họ này Các hợp chất tự nhiên được phân lập chủ yếu thuộc nhóm flavonoid và terpenoid, trong đó một số hợp chất đã được ghi nhận có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn, gây độc tế bào ung thư, và ức chế enzyme liên quan đến bệnh Alzheimer và tiểu đường Tại Việt Nam, một số loài thuộc họ Pteridaceae được sử dụng trong y học cổ truyền, nhưng nghiên cứu về thành phần hóa học của chúng vẫn còn hạn chế.

1.1.2 Thực vật chi Dương xỉ (Acrostichum)

Chi Dương xỉ, hay còn gọi là Ráng đại, thuộc chi Acrostichum với 363 loài, là thực vật đặc trưng cho các khu vực đầm lầy và rừng ngập mặn Các loài này có lá màu đỏ, thường mọc thành cụm và phân bố rộng rãi Chúng phát triển tốt trong đất hữu cơ và đất sét có độ mặn cao, từ axit đến trung tính, và cũng có khả năng sinh trưởng trong môi trường nước ngọt Với khả năng thích nghi cao ở nhiều dạng địa hình, Dương xỉ có thể trở thành mối đe dọa cho các loài thực vật rừng khác Đặc biệt, các loài thuộc chi Acrostichum ưa nắng và phát triển mạnh ở độ cao 1158m tại Wau, Morobe, New Guinea.

Chi Acrostichum bao gồm 3 loài chính đặc trưng là: A aureum, A speciosum và

A.danaeifolium Trong số đó, loài A speciosum chỉ được tìm thấy ở khu vực Ấn Độ

Dương-Tây Thái Bình Dương, A.danaeifolium phân bố ở Đại Tây Dương và Đông

Thái Bình Dương và trong khi đó loài A aureum xuất hiện ở cả hai miền trên

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Acrostichum cho thấy dịch chiết Ethylacetate từ rễ A speciosum có khả năng kháng khuẩn mạnh đối với B cereus Gram dương và E Coli Gram âm Đồng thời, dịch chiết Ethanol từ thân và rễ loài này cũng cho thấy hiệu quả trong việc chữa lành và phục hồi vết thương Hơn nữa, các hợp chất từ A aureum đã được ghi nhận với hoạt tính cao, bao gồm khả năng chống virus cúm A, kháng nấm và kháng khuẩn Dịch chiết Ethanol từ lá A aureum còn cho thấy khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ và hiệu quả giảm đau.

Trang 3 dân gian còn sử dụng các loài từ chi này trong các phương thuốc cổ truyền như cầm máu, đau dạ dày, hen suyễn,…

1.1.3 Thực vật cây Ráng đại (Acrostichum aureum L.)

Cây Ráng đại hay còn có tên là Ráng biển, có tên khoa học là Acrostichum aureum

L., thuộc chi Acrostichum, họ Pteridaceae

Cây Ráng đại là một loài cây thuộc hệ sinh thái rừng ngập mặn, thường phát triển ở những vùng ẩm lầy, nước lợ và ưa ánh sáng Loài cây này có thể mọc dưới tán cây hoặc ở những khu vực trống trải Ráng đại phân bố rộng rãi ở nhiều nơi như phía Nam Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Ấn Độ, Sri Lanka, Bangladesh và đặc biệt là ở một số vùng rừng ngập mặn tại Việt Nam Tại Việt Nam, cây này chủ yếu xuất hiện ở các cửa sông và vùng nước mặn, tập trung nhiều tại Thái Bình, Thanh Hóa và các tỉnh Nam-Nam Trung Bộ như Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa.

Hình 1 Cây Ráng đại (Acrostichum aureum L.)

Cây Ráng đại thường phát triển thành bụi cao từ 2-4 m, với thân ngắn, to và thẳng đứng, nhiều lá chồi cùng lớp vảy bao phủ Rễ cây thuộc loại rễ chùm, ăn sâu vào lòng đất và có cấu trúc vững chắc, giúp thảm thực vật Ráng đại có khả năng chống sóng hiệu quả.

Cây Ráng đại là một loại thực vật không có hoa, reproducing through spores located on the underside of its reproductive leaves Lá cây thuộc loại lá kép lông chim một lần, với mỗi lá có khoảng 30 lá chét mọc trên gân chính Kích thước lá chét dao động từ 20-40 cm chiều dài và 3-10 cm chiều rộng, có đặc điểm dày và chắc chắn.

Trang4 không lông và có gân phụ hình mạng Lá Ráng đại có hai loại: loại thường có màu xanh bóng ở mặt trên và màu nhạt ở mặt dưới; loại sinh sản có mặt trên màu xanh nhưng mặt dưới nhám, sần sùi với màu đỏ nâu.

Cây Ráng đại thường sinh trưởng ở những khu vực ẩm ướt, ngập mặn và nước lợ, thích hợp với ánh sáng Loại cây này có khả năng phát triển tốt cả dưới tán cây rừng ngập mặn lẫn ở những vùng trống không có cây cối.

1.1.4 Công dụng của cây Ráng đại

Cây Ráng đại, từ xa xưa, đã được biết đến với nhiều công dụng chữa bệnh hữu ích Tại Việt Nam, người dân thường sử dụng đọt non của cây để chế biến món ăn, trong khi lá cây được áp dụng làm thuốc sát trùng, tẩy giun sán và cầm máu Ở Malaysia, bột từ thân và rễ cây cũng được sử dụng trong các bài thuốc truyền thống.

A aureum để chữa lành các vết thương, lá cây được biết đến với khả năng cầm máu hiệu quả Theo y học cổ truyền Ấn Độ, lá cây còn được sử dụng để chữa vết thương do rắn cắn, lá non và rễ được dùng để chữa viêm loét dạ dày Ở Fiji, A aureum được sử dụng để chữa viêm họng, đau ngực, hen suyễn, viêm tấy và sốt Trong khi đó, người dân ở Quatar sử dụng thân và rễ của cây để điều trị hen suyễn, táo bón, bệnh chân voi, đau ngực và được dùng làm thuốc hạ sốt Ở Bangladesh, các chế phẩm từ thân và lá A aureum được dùng để điều trị vết thương, loét dạ dày và mụn nhọt [16]

Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của loài A aureum

Loài A aureum đã được nghiên cứu từ năm 1981 với mục tiêu chính là ứng dụng trong y học Qua nhiều năm, các nghiên cứu đã chỉ ra thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này.

Các nghiên cứu hóa học tập trung vào định tính các lớp chất có trong loài

A aureum Kết quả sàng lọc hóa học cho thấy sự hiện diện của các lớp chất như tannin, alkaloid, flavonoid, glycoside tim, saponin và anthraquinon trong các dịch chiết của loài cây này Trong đó, hàm lượng các glycoside tim cao nhất trong chiết xuất methanol, saponin tập trung chủ yếu ở chiết xuất ethanol và các hợp chất tannin có tổng hàm lượng cao nhất ở dịch chiết acetone [19] Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của loài A aureum về hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa hiệu quả

Nghiên cứu cho thấy cây Ráng đại chứa nhiều lớp chất đa dạng, với khoảng 29 hợp chất được phân lập, bao gồm flavonoid, flavonoid glycoside và các hợp chất phenolic, đóng vai trò quan trọng trong thành phần hóa học của cây Bên cạnh đó, một số hợp chất thuộc lớp steroid và terpenoid cũng đã được xác định từ loài cây này.

Dưới đây trình bày tổng quan về thành phần hóa học của loài A aureum

1.2.1 Các flavonoid và các hợp chất phenolic khác

Flavonoid là nhóm hợp chất phổ biến trong thực vật, và trong loài A aureum, đã phân lập được 6 hợp chất flavonoid và flavonoid glycoside, bao gồm quercetin, kaempferol, và các dẫn xuất của quercetin như quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-7-O-β-D-glucoside, quercetin-3-O-α-L-rhamnoside, quercetin-3-O-β-D-glucosyl-(6→1)-α-L-rhamnoside, và quercetin-3-O-β-D-glucoside Dưới đây là cấu trúc của các hợp chất flavonoid đã được phân lập.

Hợp chất (4) và (6) được phân lập từ cao chiết EtOAc của loài A aureum tại Việt Nam Hợp chất (4) có khả năng ức chế virus cúm A bằng cách giảm ảnh hưởng của virus đối với các cytokin, từ đó làm giảm quá trình viêm và tăng nồng độ cytokin chống viêm Trong khi đó, hợp chất (6) cho thấy hoạt tính chống độc tế bào và khả năng bảo vệ tế bào PC12 khỏi mất cân bằng oxi hóa do H2O2 gây ra.

Ngoài axit gallic và 4-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-butanon, một hợp chất phenolic mới là isotachioside đã được phân lập từ loài này vào năm 2020 tại Việt Nam Isotachioside có hoạt tính ức chế tyrosinase, giúp ngăn ngừa sự hình thành melanin, và được ứng dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm.

Từ các phân đoạn chiết khác nhau của loài A aureum, người ta đã phân lập được

8 hợp chất steroid, bao gồm: ponasterone A (9), pterosterone (10), daucosterol (11), campesterol (12), stigmasterol (13), γ-sitosterol (14), cycloartenol (15), 24-methylen cycloartenol (16) [22] [24] Dưới đây là cấu trúc của các steroid phân lập được

Các pterosin sesquiterpen đã được tìm thấy ở một số loài thực vật thuộc chi

Từ loài A aureum, đã phân lập được 4 hợp chất pterosin sesquiterpen, bao gồm các pretosin chứa nhóm hydroxyl như (2S,3S)-pterosin C và (2R)-pterosin P Ngoài ra, các sulfate pterosin như (2R,3S)-sulfated pterosin C và (2S,3S)-sulfated pterosin C cũng được tìm thấy từ loài cây này.

Ba hợp chất triterpen cũng đã được phân lập được từ loài A aureum, đó là friedelin

Additionally, several saturated hydrocarbon compounds and long-chain fatty acids have been identified, including heptacosane, hexacosane, tetracosane, and etracosanoic acid, along with other compounds such as patriscabratin and 2’’-(methoxycarbonyl)-5’’-methylpentyl 2’-methylhexyl phthalate, which are found in the species A aureum.

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài A aureum

Từ lâu, chiết xuất từ loài A.aureum đã được sử dụng trong y học dân gian cổ truyền để điều trị nhiều bệnh tật Nghiên cứu cho thấy nhiều hợp chất trong A.aureum có hoạt tính chống oxy hóa, độc tế bào, cũng như khả năng kháng khuẩn và kháng virus qua các thử nghiệm in vitro và in vivo.

Loài A aureum chứa nhiều hợp chất quan trọng như tannin, flavonoid, glycoside tim, saponin và anthraquinon Tannin có tác dụng chống vi rút, kháng khuẩn, chống khối u và lợi tiểu Flavonoid nổi bật với khả năng chống oxy hóa, hỗ trợ sức khỏe tim mạch, ngăn ngừa ung thư và sự hình thành gốc tự do Glycoside tim được sử dụng trong điều trị các bệnh tim mạch và nhồi máu cơ tim, giúp củng cố hệ tim mạch Saponin có tác dụng điều trị tăng đường huyết, chống oxy hóa, ngăn ngừa ung thư và kháng viêm Cuối cùng, anthraquinon không chỉ được dùng làm thuốc nhuộm mà còn có đặc tính kháng khuẩn.

1.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Tại Ấn Độ, nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phytosterol từ dịch chiết methanol của lá cây A aureum đã được thực hiện bằng các phương pháp khoa học.

CLC-Pred cho thấy các hợp chất có khả năng ức chế mạnh mẽ trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô dạ dày MKN-7 và MKN-74 Ngoài ra, một số hợp chất cũng thể hiện hoạt động đáng kể chống lại tế bào ung thư biểu mô phổi DMS-114.

Trong thử nghiệm gây độc tế bào, bẳng phương pháp thử nghiệm MTT, người ta đã chứng minh được một pretosin sesquiterpen mới là (2S,3S)-sulfated pterosin C

Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết methanol từ lá và thân cây Ráng đại có khả năng gây độc tế bào đối với nhiều dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư dạ dày (AGS), ung thư đại tràng (HT-29), ung thư vú (MCF-7 và MDA-MB-231) và ung thư tuyến tiền liệt (NIH3T3), với giá trị IC50 dao động từ 23.9 đến 68.8 µg/ml.

[25] Hoạt động gây độc tế bào này được cho là do sự hiện diện của nhóm sunfate ở C-14 và cấu hình ở C-2

Hai hợp chất patriscabratine (28) và tetracosane (26) cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư, trong đó patriscabratine ức chế tế bào ung thư dạ dày (dòng AGS) và tế bào ung thư vú (dòng MDA-MB-231 và MCF-7), trong khi tetracosane có tác dụng ức chế tế bào ung thư ruột kết (dòng HT-29) và ung thư vú (dòng HT-29).

Nghiên cứu về khả năng gây độc tế bào của các hợp chất chiết xuất từ loài A aureum đã chỉ ra tiềm năng mạnh mẽ và ứng dụng vượt trội của loài này trong y học trong tương lai.

1.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa Để nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của loài A.aureum, người ta sử dụng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH Kết quả sàng lọc cho thấy dịch chiết ethanol từ lá loài A aureum cho khả năng chống oxy hóa tốt với giá trị IC50 là 41.96 μg/ml trong khi chất đối chứng dương là Acid Ascorbic có giá trị IC50 là 16.36 μg/ml [11]

Additionally, various extracts from this species, including petroleum ether, benzene, ethyl acetate, and methanol extracts, have demonstrated antioxidant properties.

[29] Trong báo cáo này cho rằng, các hợp chất flavonoid và phenolic đóng vai trò chính trong việc hình thành nên hoạt tính chống oxy hóa của loài A aureum

1.3.1 Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn và kháng virus

Dịch chiết từ loài A aureum đã được chứng minh có hoạt tính kháng viêm và kháng khuẩn hiệu quả Cụ thể, dịch chiết ethanol từ rễ cây Ráng đại cho thấy khả năng kháng viêm vượt trội, với tỷ lệ giảm khối viêm đạt 65.90%, gần tương đương với 66.66% của indomethacin trong 24 giờ Ngoài ra, dịch chiết acetone từ lá A aureum cũng cho thấy khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.

Trang 11 Đáng chú ý, năm 2013 một nhóm nghiên cứu đã phân lập ra 1 este của acid phtalic

Có hoạt tính chống virus sốt xuất huyết (virus parainfluenza) ở người, đặc biệt là đối với virus HPIV3, với giá trị EC50 là 29.4 μM, cho thấy tác động mạnh mẽ của nó trong việc điều trị các bệnh viêm phế quản và viêm phổi ở người.

Năm 2018, nghiên cứu của Xue Wu và cộng sự đã chỉ ra rằng dịch chiết nước từ loài này có khả năng giảm thiểu đáng kể viêm loét dạ dày và tổn thương niêm mạc dạ dày do rượu gây ra.

Loài Acrostichum aureum L đã được nghiên cứu với nhiều hoạt tính sinh học nổi bật, bao gồm khả năng chống ký sinh trùng và giảm đau tiêu sưng, cho thấy kết quả khả quan Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Ráng đại, một loài thuộc hệ sinh thái rừng ngập mặn, đã chỉ ra tiềm năng trong việc phát hiện các hợp chất mới có tác dụng kháng viêm và chống ung thư Từ năm 2019, nghiên cứu về cây A aureum tại Việt Nam đã mang lại những kết quả thú vị, và luận văn này sẽ tiếp tục khám phá thành phần hóa học cũng như thử nghiệm hoạt tính chống ung thư của các chất phân lập từ loài này.

Tìm hiểu về các hợp chất Lignan

1.4.1 Khái niệm và sinh tổng hợp các hợp chất Lignan

Lignan là một nhóm hợp chất phenolic có mặt trong nhiều loại thực vật giàu chất xơ, bao gồm ngũ cốc như lúa mì, lúa mạch và yến mạch, cũng như các loại đậu như đậu lăng và đậu nành Ngoài ra, chúng còn xuất hiện trong các loại rau như tỏi, măng tây, bông cải xanh và cà rốt Lignan được cấu thành từ hai hoặc nhiều đơn vị phenylpropanoid.

C6-C3, từ acid cinnamic, liên kết tại vị trí C-8 và C-8’ (8-8’ hoặc β-β’)

Các lignan khác nhau chủ yếu ở mức độ oxy hóa, nhóm thế và cấu trúc hóa học của khung carbon cơ bản, tạo ra sự đa dạng về cấu trúc nhờ vào nhiều cách kết hợp của các gốc phenoxy Chúng được phân loại thành ba khung chính: lignan, neolignan và norlignan, dựa vào bản chất liên kết của các phenylpropanoid Đơn vị C6-C3 được gọi là propylbenzen, được đánh số từ 1-6 trong vòng, bắt đầu từ nhóm propyl, trong khi nhóm propyl được đánh số từ 7-9 từ vòng benzen Khi hai đơn vị liên kết tại các vị trí 8 và 8’, hợp chất hình thành được gọi là lignin; nếu không có liên kết C8-C8’, chất dime từ liên kết 3-3’ được gọi là neolignan Norlignan là nhóm hợp chất tự nhiên có cấu trúc lõi từ C16-C17, được hình thành từ hai đơn vị arylpropan qua quá trình khử carbon, dẫn đến sự mất mát một hoặc hai nguyên tử carbon.

Hình 2: Bộ khung cơ bản Lignan, Neolignan và Norlignan Trong đó, bộ khung lignan bao gồm các phân nhóm chính như sau:

Trang 13 Hình 3 Các phân nhóm chính của Lignan Dưới đây là sơ đồ sinh tổng hợp các hợp chất Lignan trong thực vật:

Sơ đồ 1 Con đường sinh tổng hợp các hợp chất lignan [32]

1.4.2 Hoạt tính sinh học của các hợp chất Lignan

Lignan là hợp chất được phát hiện trong hơn 70 họ thực vật, chủ yếu tập trung ở rễ, thân, vỏ, quả và hạt của cây Từ lâu, các loại thực vật giàu lignan đã được sử dụng trong y học dân gian để điều trị nhiều loại bệnh, thể hiện vai trò quan trọng trong nền y học cổ truyền.

Nghiên cứu cho thấy, lignan secoisolariciresinol, được coi là phytoestrogen, có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư thông qua việc vi khuẩn đường ruột chuyển hóa thành enterolactone và enterodiol, giúp giảm tác động của estrogen trong cơ thể, đặc biệt là ung thư vú Nhiều lignan cũng thể hiện hoạt động sinh lý như podophylllotoxin trong việc ức chế khối u, đồng thời một số lignan có khả năng ức chế hệ thống thần kinh trung ương và chu kỳ AMP phospho-diesterase Các nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa cho thấy lignan có khả năng ổn định các gốc tự do nhờ vào sự hiện diện của phenol, làm cho chúng trở thành chất chống oxy hóa hiệu quả Thêm vào đó, nhiều hợp chất lignan trong thực vật còn có hoạt tính kháng khuẩn cao, thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong lĩnh vực y học.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật sau khi thu hái sẽ được cắt nhỏ, phơi và sấy khô ở nhiệt độ 30-40 ºC, sau đó xay nhỏ Bột lá cây (3.2 kg) sẽ được ngâm chiết 3 lần bằng methanol với sự hỗ trợ của sóng siêu âm ở 45 độ.

Ở nhiệt độ 50 ºC, dịch chiết MeOH được cất để loại bỏ dung môi, sau đó thêm nước và tiến hành chiết xuất lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexane và EtOAc Quá trình cất bằng máy cô quay giảm áp giúp thu được các cao chiết tương ứng.

2.1.2 Phương pháp sắc ký để phân lập chất

Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết bằng các phương pháp sắc ký cột (CC) kết hợp với sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký cột (CC) là phương pháp phân tách sử dụng các chất hấp phụ như diaion, silica gel, sephadex LH-20 và RP-18, kết hợp với các hệ dung môi thích hợp để giải hấp Ngoài ra, trong một số trường hợp, phương pháp kết tinh cũng được áp dụng để tinh chế chất hiệu quả.

2.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được

Cấu trúc của các chất phân lập được xác định thông qua sự kết hợp của nhiều phương pháp phổ khác nhau, bao gồm khối phổ phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) như 1H-NMR và 13C-NMR, cũng như phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR) như HSQC, HMBC, 1H-1H-COSY, NOESY Ngoài ra, quang phổ hồng ngoại (IR) và phổ lưỡng sắc tròn (CD) cũng được sử dụng để hỗ trợ trong việc xác định cấu trúc.

2.1.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) công nhận là tiêu chuẩn trong việc sàng lọc và phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển hoặc gây chết tế bào ung thư trong điều kiện in vitro.

Phép thử xác định hàm lượng protein tổng số trong tế bào dựa trên mật độ quang học (OD) được đo khi protein trong tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB).

Giá trị OD của máy đo tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn vào phân tử protein, vì vậy khi số lượng tế bào và lượng protein tăng lên, giá trị OD cũng sẽ tăng theo.

Thực nghiệm

Mẫu lá cây Ráng đại (Acrostichum aureum) được thu thập tại vùng ngập mặn ven biển huyện Tiền Hải, tỉnh Thái Bình Cây này đã được PGS.TS Trần Huy Thái, từ Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (VAST), xác định với tên khoa học là Acrostichum aureum L.

1 Xây dựng quy trình chiết mẫu lá cây Ráng đại trong các dung môi có độ phân cực tăng dần

2 Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất từ phân đoạn chiết nước của lá cây Ráng đại

3 Thử nghiệm hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ lá cây Ráng đại

2.2.2 Dụng cụ thiết bị và hóa chất

Sắc ký cột thường (CC) sử dụng các cột thủy tinh với kích thước khác nhau và các chất hấp phụ đa dạng, bao gồm silica gel cỡ hạt 0.040 – 0.063 mm (Merck, Đức), hạt diaion HP-20 (Mitsubishi, Nhật), RP C18 silica gel cỡ hạt 150 μm (YMC), và Sephadex LH-20 cỡ hạt 25 – 100 μm (Sigma-Aldrich).

Sắc ký bản mỏng (TLC) sử dụng bản nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 với độ dày 0.2 mm từ Merck, cùng với pha đảo RP 18 – 60 F254S cũng có độ dày 0.2 mm Phương pháp phát hiện thuốc trên bản mỏng sử dụng vanillin kết hợp với H2SO4 và chiếu đèn UV ở bước sóng λ = 254-366nm.

Góc quay cực được ghi trên máy JASCO P-2000 Polarimeter (Hachioji, Tokyo, Japan)

Phổ lưỡng sắc tròn (CD) được ghi trên máy quang phổ Chirascan (Applied Photophysics, UK)

Phổ HR-QTOF-MS được ghi trên máy Agilent 6530 Accurate-Mass (CA, USA) Phổ FT-IR được ghi trên máy FTIR Affinity-1S (Shimazu, Japan)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi nhận trên máy Bruker Avance-500, sử dụng tetramethylsilane (TMS) làm chất nội chuẩn, với độ chuyển dịch hóa học δ được biểu thị bằng ppm Dung môi sử dụng trong quá trình đo là CD3OD và DMSO-d6.

Tất cả các phổ đều được đo tại Viện Hóa - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST)

Các thiết bị sử dụng: máy cô quay giảm áp, bể chiết siêu âm, bộ chưng cất dung môi,

Các thiết bị thử nghiệm hoạt tính sinh học: đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pipette (Eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Biotek)

Trong nghiên cứu hóa học, các hóa chất như n-hexane, ethyl acetate, methanol, dichloromethane, ethanol, acetone, acetic acid, H2SO4 và vanillin thường được sử dụng Trước khi tiến hành sắc ký, tất cả các dung môi cần được cất giữ cẩn thận để đảm bảo chất lượng và độ chính xác của kết quả nghiên cứu.

The chemicals utilized in biological activity testing include reference substances such as Ellipticine, TCA (Sigma), and SRB (Sigma) The cell lines used in these experiments were provided by Professor J M Pezzuto from Long Island University in the United States and Professor Jeanette Maier from the University of Milan, Italy.

Mẫu lá Ráng đại sau khi thu hái được cắt nhỏ, phơi trong bóng râm và sấy khô ở 40-50 °C sau đó được nghiền thành bột

3.2 kg bột khô của lá cây Ráng đại được ngâm, chiết siêu âm 3 lần với methanol ở nhiệt độ 45 – 50 °C Dịch chiết tổng được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 1.5 lít dịch tổng MeOH Dịch chiết MeOH được chiết phân bố với các dung môi là n-hexan, phần chiết tổng n-hexan được cô quay áp suất giảm thu được 87.2 g cao chiết n-hexan Dịch MeOH sau khi đã chiết n-hexan được cô quay thành dạng cao sệt và tiếp tục pha loãng trong 1.5 l H2O rồi chiết phân bố với EtOAc bão hòa Dịch chiết tổng EtOAc được cô quay áp suất giảm thu được 61.0 g cao chiết EtOAc Dịch nước còn lại cô quay giảm áp thu được 135.8 g cao chiết phân đoạn nước

Sơ đồ 2: Sơ đồ chiết mẫu lá Ráng đại

2.2.4 Phân lập các chất từ phân đoạn nước của lá cây Ráng đại

Sắc ký cột sử dụng cột thủy tinh có đường kính 3 cm, dài 80 cm với chất hấp phụ là Diaion HP-20

Hòa tan 135.8 g cao chiết phân đoạn nước trong lượng nước cất tối thiểu và đưa vào cột Diaion HP20 Cột được rửa giải bằng nước cất để loại bỏ muối và đường tự do, sau đó tiếp tục rửa giải bằng hệ dung môi W/M với nồng độ MeOH tăng dần từ 20%, 40%, 80% đến 100%, thu được 4 phân đoạn ký hiệu từ W1 đến W4.

Phân đoạn W1 được thu nhận từ quá trình rửa giải bằng dung môi MeOH 20% (21.6 g) và tiếp tục được phân tách qua sắc ký cột silica gel với các hệ dung môi D/M theo tỷ lệ 10/1, 5/1, 2.5/1 và 1/1 Quá trình rửa giải được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với các hệ dung môi phù hợp Các ống nghiệm có vết giống nhau trên TLC được gộp lại thành một phân đoạn lớn, sau đó cô quay loại dung môi thu được 5 phân đoạn tập hợp từ F1 đến F5.

3.2 kg bột lá Ráng đại

- Ngâm chiết siêu âm 5 lần trong MeOH

- Cô quay giảm áp 1.5 lít dịch chiết MeOH

Tại hệ dung môi rửa giải D/M = 10/1, phân đoạn F2 được thu nhận Sau khi cô quay loại dung môi, phân đoạn F2 được tách ra bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi MeOH, cho ba phân đoạn nhỏ F2.1, F2.2 và F2.3 Tiến hành tinh chế phân đoạn F2.2 bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi W/A = 3/1, thu được hợp chất ký hiệu WA18 (2.1 mg) Phân đoạn F2.3 cũng được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi W/M.

= 2.5/1 thu được lần lượt ba hợp chất ký hiệu là WA2 (33.2 mg), WA3 (41.1 mg) và

Tại hệ dung môi rửa giải D/M = 5/1, phân đoạn F3 được thu nhận Sau đó, dung môi được cô quay và phân đoạn F3 được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải W/M = 3/1, thu được hợp chất ký hiệu WA6 (26.5 mg) Sơ đồ phân lập chất từ cao chiết nước lá cây Ráng đại được trình bày dưới đây.

Trang 21 a Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất WA2: 4-(3ʹ -O-sulfate-4ʹ - hydroxyphenyl)-2-butanone (chất mới)

Hợp chất WA2 thu được từ phân đoạn chiết nước của lá cây Ráng đại ở dạng bột, màu trắng

Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS: m/z = 259.0291 [M-H] - (khối lượng tính toán 259.0282, C10H11O6S)

Phổ hồng ngoại IR (KBr): max 3388, 2914, 2848, 1728, 1658, 1467, 1178, 1024,

WA2 (33.2 mg) WA3 (41.1 mg) WA4 (67.6 mg)

135.8 g phân đoạn nước lá AA

Sơ đồ 3 Sơ đồ phân lập chất từ cao chiết nước cây Ráng đại

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δH (ppm): 8.67 (1H, s, 4’- OH), 6.92 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2’), 6.77 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6’), 6.70

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C NMR (125MHz, DMSO-d 6 ) δC (ppm): 207.7 (C-

2), 147.2 (C-4’), 140.5 (C-3’), 132.1 (C1’), 124.5 (C-6’), 122.8 (C-2’), 117.0 (C-5’), 44.3 (C-3), 29.1 (C-1), 28.1 (C-4), b Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất WA3: 4-(3ʹ - O -sulfate-4ʹ - hydroxyphenyl)- 2(R)-butanol (chất mới)

Hợp chất WA3 thu được ở dạng bột, màu trắng

Góc quay cực riêng [𝛼] 𝐷 25 = -28.6 (c, 0.1, MeOH)

Phổ hồng ngoại IR (KBr): max 3383, 2914, 2848, 1643, 1512, 1269, 1024, 993,

Khổi phổ phân giải cao HR-ESI-MS: m/z = 261.0446 [M-H] - (khối lượng tính toán 261.0448, C10H13O6S)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δH (ppm): 8.61 (1H, s, 4’- OH), 6.91 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2’), 6.76 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6’), 6.70

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C NMR (125MHz, DMSO-d 6 ) δC (ppm): 146.9 (C- 4’), 140.5 (C-3’), 133.4 (C-1’), 124.5 (C-6’), 122.8 (C-2’), 116.9 (C-5’), 65.2 (C-2), 41.0 (C-3), 30.6 (C-4), 23.5 (C-1) c Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất WA6: dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9-O-sulfate (chất mới)

Hợp chất WA6 thu được ở dạng bột, màu trắng

Góc quay cực riêng [𝛼] 𝐷 25 = 0 (c, 0.1, MeOH)

Phổ hồng ngoại IR (KBr): max 3358, 2939, 2839, 1604, 1531, 1492, 1384, 1249,

Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS: m/z C9.1074 [M-H] - (khối lượng tính toán 439.1068, C20H23O9S)

Phổ CD (MeOH, c 3.8 × 10 -4 M) mdeg (λmax): +0.92 (204 nm), +0.55 (224 nm),

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H NMR (500MHz, CD3OD) δH (ppm): 7.03 (1H, d,

J = 2.0, H-2), 6.89 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.79 (1H, s, H-6’), 6.77 (1H, d, J 8.0 Hz, H-5), 6.75 (1H, s, H-2’), 5.60 (1H, d, J = 6 Hz, H-7), 4.30 (1H, dd, J = 6.0, 10.5,

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C NMR (125MHz, CD3OD) δC (ppm): 149.0 (C-3),

62.2 (C-9’), 56.8 (3’-OCH3), 56.4 (3-OCH3), 52.8 (C-8), 35.7 (C-8’), 32.8 (C-7’) d Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất WA18: dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O - glucoside

Hợp chất WA6 thu được ở dạng bột, màu trắng

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H NMR (500MHz, CD3OD) δH (ppm): 7.17 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 7.05 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.96 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C NMR (125MHz, CD3OD) δC (ppm): 151.0 (C-3),

62.2 (C-9’), 56.8 (3-OCH3), 56.7 (3’-OCH3), 55.6 (C-8), 35.8 (C-8’), 32.9 (C-7’) e Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất WA4: (+)-pinoresinol-4-O-sulfate

Hợp chất WA4 thu được ở dạng bột, màu trắng

Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS: m/z = 438.1027 [M-H] - (C20H22O9S)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δH (ppm): 8.87 (1H, s, 4-OH), 7.40 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.92 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-2), 6.89 (1H, d, J

= 1.5 Hz, H-2ʹ), 6.82 (1H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-6), 6.76 (1H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C NMR (125MHz, DMSO-d 6 ) δC (ppm): 150.4 (C-3), 147.5 (C-3’), 145.8 (C-4’), 141.9 (C-4), 136.5 (C-1), 132.1 (C-1’), 120.7 (C-

2.2.5 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được

Năm hợp chất được phân lập từ loài A aureum đã được đánh giá về hoạt tính gây độc tế bào ung thư ở người thông qua phương pháp thử nghiệm SRB (sulforhodamine B) [35].

Các dòng tế bào được sử dụng cho nghiên cứu:

SK-LU-1(human lung carcinoma): Tế bào ung thư phổi

MCF7 (human breast carcinoma): Tế bào ung thư vú

HepG2 (human heptatocellular carcinoma): Tế bào ung thư gan a Chuẩn bị mẫu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 5 mẫu pha trong DMSO 100% với nồng độ stock 20 mg/mL, nhằm đạt được nồng độ cuối cùng cho tế bào là 100, 20, 4 và 0.8 µg/mL Bên cạnh đó, chúng tôi tiến hành xác định tính độc tế bào thông qua phương pháp assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp.

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

Viện Ung thư Quốc gia (NCI) đã xác nhận rằng phép thử độ độc tế bào chuẩn là công cụ hữu hiệu để sàng lọc và phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt tế bào ung thư trong điều kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp đã được nêu trong tài liệu [36], và quy trình bao gồm việc xác định hàm lượng protein tổng số tế bào dựa trên mật độ quang học.

Độ đục quang (OD) được đo bằng cách nhuộm protein tế bào với Sulforhodamine B (SRB), với giá trị OD tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn kết với protein Khi số lượng tế bào tăng lên, đồng nghĩa với việc lượng protein cũng tăng, dẫn đến giá trị OD cao hơn Phép thử này được thực hiện trong các điều kiện cụ thể.

+ Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm