Trong quá trình tìm kiếm các thực vật tự nhiên để hỗ trợ điều trị ung thư, nhóm tác giả đã phát hiện ra dịch chiết cồn của Vối thuốc Schima wallichii họ Chè Theacea ở Quảng Trị có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của các dòng tế bào ung thư. Bài viết trình bày hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu của dịch chiết cây vối thuốc Schima wallichii thu hái ở Quảng Trị.
ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 20, NO 11.1, 2022 57 HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ MÁU CỦA DỊCH CHIẾT CÂY VỐI THUỐC SCHIMA WALLICHII THU HÁI Ở QUẢNG TRỊ CYTOTOXIC ACTIVITY OF SCHIMA WALLICHII EXTRACTS COLLECTED IN QUANG TRI ON HUMAN ACUTE MYELOID LEUKEMIA CANCER CELLS Nguyễn Yến Nhi1,2, Trần Thị Thùy Linh3, Lê Tuấn Anh4, Võ Thị Lệ Mỹ5, Trần Thị Phước May5, Phạm Trần Vĩnh Phú6, Huỳnh Lời5, Văn Phạm Kim Thương5, Trần Mạnh Hùng5* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Y Dược Huế Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung (MISR) Khoa Y Dược - Đại học Đà Nẵng Khoa Y, Đại học Đông Á *Tác giả liên hệ: tmhung@smp.udn.vn (Nhận bài: 12/7/2022; Chấp nhận đăng: 26/9/2022) Tóm tắt - Trong trình tìm kiếm thực vật tự nhiên để hỗ trợ điều trị ung thư, nhóm tác giả phát dịch chiết cồn Vối thuốc Schima wallichii họ Chè Theacea Quảng Trị có khả ức chế sinh trưởng phát triển dịng tế bào ung thư Kết thí nghiệm cho thấy, phân đoạn phân cực ethyl acetate nước cành Vối thuốc có khả gây độc lên nhiều dòng tế bào ung thư đặc biệt dòng ung thư máu HL-60 KG Hai phân đoạn tác động lên PARP protein, kích hoạt hệ enzyme caspase bao gồm hai loại cysteine-aspartic acid protease caspase-3 caspase-9 thông qua trình biểu protein phương pháp Western Blot Như vậy, nhận định hai phân đoạn chứa hoạt chất tương tác vào DNA tế bào ung thư máu thông qua đường tác động lên enzyme caspase PARP Điều làm định hướng nghiên cứu từ Vối thuốc theo hoạt tính dẫn đường để tìm kiếm hoạt chất chống ung thư Abstract - During the anti-cancer screening program from nature, we discovered that the alcohol extract of Schima wallichii (Theacea) in Quang Tri can inhibit the growth and development of cancer cell lines Experimental results showed that the polar fractions such as ethyl acetate and water of the leaves and branches of the S wallichii were capable of causing toxicity to many cancer cells, especially HL-60 and KG human leukemia cancer cell lines These two fractions react on the PARP protein, and activate the caspase enzyme system consisting of two types of cysteine-aspartic acid proteases, caspase-3, and caspase-9 through protein expression in HL-60 Based on the results, it is noted that both two sub-fractions contain active substances that can interact with the DNA of leukemia cancer cells through the action of caspases and PARP The results can help to search for anti-cancer active substances from S wallichii in the future Từ khóa - Schima wallichii; Vối thuốc; gây độc tế bào; ung thư máu; HL-60 Key words - Schima wallichii; cytotoxic; acute myeloid leukemia; HL-60 Giới thiệu Bệnh bạch cầu loại bệnh ung thư máu, tế bào bạch cầu bất thường hình thành tủy xương xâm lấn vào tế bào khỏe mạnh qua đường máu [1, 2] Y học đại có tiến điều trị bệnh bạch cầu, nhiên tái phát bệnh kháng thuốc thử thách lớn, đòi hỏi phải có nhiều phương pháp điều trị hiệu [3, 4] Các chất chống ung thư sử dụng có chế chủ yếu gây trình chết theo lập trình tế bào (apoptosis) [5] Trong trình apoptosis, tác nhân gây chết tế bào ung thư gây độc tế bào thường [6, 7] Do đó, việc tìm hợp chất khác có khả điều trị ung thư tác dụng phụ đồng thời phải chống lại kháng thuốc [7, 8] Necrosis, đường tự hủy tế bào theo chương trình khác biệt so với apoptosis, kích hoạt số loại tế bào ung thư định trình sử dụng liệu pháp hóa trị đảo ngược kháng apoptosis tế bào ung thư [9-11] Trong năm gần đây, xu hướng sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên để phịng chữa bệnh trở nên phổ biến [12] Tìm kiếm loại thuốc có khả tiêu diệt nhiều dịng tế bào ung thư khác nhau, đồng thời giảm thiểu tác dụng phụ thuốc yêu cầu cấp thiết Có nhiều hướng để tìm kiếm thuốc điều trị ung thư hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên nguồn quan trọng [13, 14] Trong q trình điều tra thực vật, nhóm tác giả phát dịch chiết Vối thuốc Schima wallichii thuộc họ Chè Theacea Quảng Trị có khả ức chế sinh trưởng phát triển dòng tế bào bạch cầu Vối VNUHCM - University of Science (Nguyen Yen Nhi) Viet Nam National University Ho Chi Minh City (Nguyen Yen Nhi) Hue University of Medicine and Pharmacy (Tran Thi Thuy Linh) Mientrung Institute of Scientific Research (Le Tuan Anh) The University of Danang – School of Medicine and Pharmacy (Vo Thi Le My, Tran Thi Phuoc May, Huynh Loi, Van Pham Kim Thuong, Tran Manh Hung) Faculty of Medicine - Dong A University (Pham Tran Vinh Phu) 58 N Y Nhi,, T T T Linh, L T Anh, V T L Mỹ, T T P May, P T V Phú, H Lời, V P K Thương, T M Hùng thuốc (cịn gọi Kháo cài, Thù lụ) có tên khoa học khác Gordonia wallichii DC [15, 16] Trong y học cổ truyền, non có vị chát, dùng cho diệt giun, sát trùng, tiêu thũng huyết sinh cơ, vỏ Vối thuốc dùng để trị ăn uống không tiêu, bệnh giun đũa, viêm ruột vết thương côn trùng rắn cắn [15-17] Tổng quan tài liệu cho thấy, S wallichii có tác dụng chống oxi hóa mạnh [18] Theo điều tra sơ bộ, dịch chiết cồn nước có khả gây độc lên nhiều dòng tế bào ung thư, có hai dịng tế bào ung thư máu HL-60 KG Do đó, báo cơng bố hoạt tính chống tăng sinh tế bào ung thư máu dịch chiết Vối thuốc Schima wallichii Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Thu hái mẫu thực vật Mẫu cành Vối thuốc thu hái vào tháng 10/2020 khu vực miền núi Huyện Lao Bảo, tỉnh Quảng Trị ThS Lê Tuấn Anh, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mẫu tiêu lưu trữ Phịng thí nghiệm Bộ môn Dược liệu Kiểm nghiệm, Khoa Y Dược - Đại học Đà Nẵng 2.2 Chiết xuất dược liệu Lá cành Vối thuốc (LVT CVT) thu hái phơi khơ bóng râm (2 kg), xay nhỏ chiết nóng hồi lưu với ethanol 70% (3L × lần) Dung dịch chiết sau cất loại dung mơi áp suất giảm thu cặn chiết cồn 70% Cặn chiết hòa tan với nước (3L) chiết phân đoạn với n-hexane, methylene dichloride, ethyl acetate thu cặn chiết n-hexane (Hx), methylene dichloride (MD), ethyl acetate (EtOAc) phần nước lại (W) Theo mẫu LVT thu phân đoạn theo độ phân cực LVTHx, LVT-MD, LVT-EtOAc LVT-W Tương tự, mẫu CVT thu phân đoạn CVT-Hx, CVT-MD, CVT-EtOAc CVT-W Các mẫu phân đoạn bảo quản 4oC tủ lạnh trước đem sử dụng 2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống tăng sinh tế bào Hoạt tính gây độc tế bào xác định dòng tế bào ung thư máu HL-60 KG, dòng ung thư khác tụy (MIA PACA-2, PANC-1), phổi (A549), ung thư buồng trứng (OVCAR8, Hela) cách sử dụng kit Dojindo cải tiến, dựa phương pháp MTT trước [24, 25] Phương pháp thử hoạt tính chống tăng sinh tế bào Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ xác nhận phép thử nhằm sàng lọc, phát chất có khả kìm hãm phát triển tiêu diệt tế bào ung thư điều kiện in vitro Trong mơi trường ni cấy có dinh dưỡng (DMEM) hay khơng có dinh dưỡng (NDM), tế bào ung thư sống cung cấp điện tử trung gian làm chuyển hóa muối tetrazolium thành formazan Formazan (có màu) đo độ hấp thu cực đại bước sóng thích hợp Các mẫu thử cho vào dung dịch làm giảm số lượng tế bào ung thư, hàm lượng formazan giảm làm giảm cường độ màu dung dịch Dựa vào cường độ màu dung dịch có khơng có mẫu thử, ta tính khả gây độc tế bào ung thư mẫu thử Các tế bào sống nuôi cấy phiến 96 giếng với điều kiện 37°C, 5% CO2 Dịch chiết cành Vối thuốc pha loãng DMSO với nồng độ khác Nồng độ DMSO cuối điều chỉnh nhỏ 0,1% để ngăn ngừa q trình biệt hố Sau 24 giờ, mẫu thử thêm vào giếng, thêm đồng lượng môi trường với DMSO 0,1% vào giếng đối chứng trắng (khơng có mẫu thử) Sau ủ 48 giờ, thuốc thử Dojindo cho vào giếng sau đó, mang phiến đo mật độ quang (OD) 450 nm thiết bị đọc vi phiến (Molecular Devices, Mỹ) Lượng tế bào sống sót tính theo cơng thức: % sống sót = [ OD (mẫu thử) – OD (chứng trắng) OD (chứng âm) – OD (chứng trắng) × 100] % ức chế = 100% - % sống sót Các phép thử lặp lại lần để đảm bảo tính xác Camptothecin (Merck) sử dụng làm chất đối chứng dương DMSO đối chứng âm Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% phát triển) xác định nhờ vào phần mềm TableCurve 2Dv5.01 2.4 Phương pháp đánh giá khả kích hoạt caspase-3 Caspase-3 enzyme thuộc họ caspase (enzyme protease dạng cystein-aspartic) thường tồn dạng tiền chất không hoạt động tế bào Khi enzyme bị hoạt hố, khởi động q trình apoptosis việc phân cắt protein (chất nền) mà mục tiêu cụ thể chuỗi amino DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) Ac-DEVD-AFC chất có gắn chất phát quang, vào tế bào bị caspase-3 cắt đứt liên kết với AFC (7-amino-4-trifluoromethylcoumarin) giải phóng phần phát quang AFC định lượng máy đo quang phổ huỳnh quang [26] Tế bào ung thư xử lý với dịch chiết cồn cành Vối thuốc nồng độ khác nhau, sau ủ 12, 24, 48 giờ, tế bào thu gom rửa PBS lạnh mang dung giải dung dịch đệm ly giải nhiệt độ phòng 10 phút, sau làm lạnh thêm vào dung dịch đệm thử nghiệm vào giếng, ủ 37oC Cường độ huỳnh quang đo kích thích 370 nm phát xạ 505 nm máy Twinkle LB970 (Berthold Technologies, Đức) Mẫu chứa tế bào ung thư, khơng có chất thử dùng làm nhóm đối chứng Mức độ cảm ứng enzyme caspase-3 xác định thông qua tỷ lệ cường độ huỳnh quang mẫu thử so với mẫu chứng Kết xử lý phần mềm GraphPad Prism 3.03 2.5 Phương pháp Western Blot Kỹ thuật lai protein với protein (giữa kháng nguyên với kháng thể) protein kháng nguyên phát qua phản ứng tạo màu phát huỳnh quang Trong Western Blot, hỗn hợp protein phân tách điện di SDS-PAGE Các vạch protein chuyển lên màng lai vạch protein phát cách ngâm màng với kháng thể sơ cấp thứ cấp có gắn enzyme đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm Nếu protein quan tâm kết hợp kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trí điểm phát cách chụp màng lên film X-quang Tế bào ủ với dịch chiết cồn cành Vối thuốc 24 37oC Các mảnh vỡ tế bào ngâm dung dịch đệm ly giải, có chứa hỗn hợp chất ức chế protease, ly tâm để loại bỏ kết tủa Phần dịch protein mang phân tách điện di SDS-PAGE, sau chuyển lên màng lai PVDF (Bio-Rad, Mỹ) Đặt màng vào 5% sữa bột không béo dung dịch đệm Tris chứa 0,1% Tween- ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 20, NO 11.1, 2022 20 (TBS-T) C qua đêm ủ với kháng thể sơ cấp nhiệt độ phòng Các màng rửa lần với TBS-T thấm kháng thể thứ cấp có gắn enzym HRP (Horseradish peroxidase), ủ nhiệt độ phòng 1,5 giờ, rửa lại lần với TBS-T, sau hiển thị protein miễn dịch chụp X-quang Protein bình thường hố cách đẩy lại màng với việc phát kháng thể kháng β-actin, màng sử dụng ngâm dung dịch đệm loại bỏ nhiệt độ phòng 20 phút [27,28] o Kết thảo luận 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Có mẫu dược liệu phân đoạn dịch chiết từ cành Vối thuốc bao gồm phân đoạn n-hexane, methylene dichloride, ethyl acetate pha nước lại sau chiết xuất (LVT-Hx, LVT-MD, LVT-EtOAC, LVT-W, CVT-Hx, CVT-MD, CVT-EtOAC, CVT-W, Bảng 1) Các phân đoạn pha loãng thành nồng độ từ thấp đến cao (5-500 μg/mL), đưa vào giếng nuôi cấy tế bào ung thư Như kết trình bày Bảng 1, mẫu dịch chiết LVT-MD từ có khả diệt tế bào ung thư tuỵ PANC-1 với IC50 = 256,8 ± 10,4 μg/mL, kết yếu, phân đoạn khả ức chế sinh trưởng tế bào tất dòng khác Tương tự, mẫu LVT-Hx hoạt tính gây độc tất dịng tế bào với giá trị IC50 > 300 μg/mL Tuy nhiên, với mẫu Vối thuốc, hai mẫu dịch chiết lại LVT-EtOAc LVT-W có khả gây độc tế bào ung thư tuỵ (MIA PACA2, PANC-1), ung thư phổi (A549), ung thư tử cung (Hela) với giá trị IC50 < 200 μg/mL Đối với dòng tế bào ung thư máu HL-60 KG, phân đoạn cho giá trị IC50 khoảng 70-86 μg/mL Điều cho thấy, hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư tập trung phân đoạn có độ phân cực cao hơn, phân đoạn nước, nơi tập trung nhiều flavonoid chứa nhóm đường Đặc biệt, phân đoạn nước Vối thuốc cho thấy khả diệt tế bào KG mạnh với giá trị IC50 72,2 ± 5,0 μg/mL (Bảng 1) 59 Camptothecin làm chất đối chứng dương, chất coi hoạt chất thường dùng để thử nghiệm tiêu diệt tế bào ung thư Camptothecin ức chế tăng sinh tế bào HL-60 với giá trị IC50 1,8 ± 0,3 µM với tế bào KG 0,5 ± 0,1 µM [29] Bảng Hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn Vối thuốc Dịch chiết, phân đoạn LVT-Hx LVT-MD LVT-EtOAc LVT-W CVT-Hx Các dòng tế bào ung thư, IC50 μg/mLa MIA PANC-1 A549 PACA2 > 300 > 500 - Hela HL-60 KG HEK293 > 300 > 300 > 300 256,8 ± > 300 > 300 > 300 10,4 215,5 ± 218,3 ± 130,5 > 300 6,6 10,2 ± 6,8 167,8 ± 90,6 ± 190,6 80,4 ± 10,3 12,7 ± 5,6 4,3 > 300 > 300 146,0 ± 8,5 85,8 ± 4,5 86,6 ± 6,0 > 300 80,5 ± 4,1 72,2 ± 5,0 > 300 > 300 > 300 > 300 257,2 ± 108,7 CVT-MD > 300 6,0 ± 8,0 196,1 ± 231,0 ± 112,0 CVT-EtOAc 12,0 6,5 ± 10,2 117,8 ± 72,5 ± 86,2 ± CVT-W 11,0 2,8 10,5 3,0 ± 2,0 ± Camptothecinb 6,4 ± 0,8 0,7 0,2 > 300 181,5 ± 9,2 67,0 ± 3,8 0,5 ± 0,1 72,5 ± 4,6 46,4 ± 2,5 50,2 ± 2,4 1,8 ± 0,3 > 300 65,2 ± 3,2 50,5 ± 3,2 0,5 ± 0,1 > 300 > 300 > 500 > 500 a) Giá trị IC50 tính dựa theo độ lặp lại lần thử nghiệm, đơn vị đo μg/mL; b) Camptothecin dùng để làm chất đối chứng dương, IC50 đo đơn vị μM Giá trị ± SD chấp thuận mức độ cho phép (-): Hoạt tính yếu khơng có hoạt tính 3.2 Hoạt tính kích hoạt enzyme caspase-3 Các mẫu phân đoạn từ cành Vối thuốc có kết tương tự Tuy nhiên, mẫu cành, phân đoạn CVTMD cho kết khả quan với giá trị IC50 72,5 ± 4,6 μg/mL dòng HL-60 Mẫu phân đoạn CVT-Hx thể hoạt tính yếu, điều phù hợp với mẫu Tuy nhiên, CVT-EtOAc CVT-W lại cho kết tiềm Mẫu CVT-EtOAc ức chế sinh trưởng tất dịng tế bào ung thư, dịng HL-60 KG bị ức chế mạnh với giá trị IC50 46,4 ± 2,5 65,2 ± 3,2 μg/mL Mẫu CVT-W cho thấy, khả diệt tế bào ung thư tốt, IC50 = 72,5 ± 2,8 μg/mL (PANC-1), IC50 = 50,2 ± 2,4 (HL-60) IC50 = 50,5 ± 3,2 μg/mL (KG) Dòng tế bào thận HEK293 (immortalized human embryonic kidney cells) đưa vào thử nghiệm, dòng tế bào thường, sinh trưởng tốt không bị ảnh hưởng dịch chiết phân đoạn từ cành Vối thuốc Điều cho thấy, dịch chiết với nồng độ 500 μg/mL không gây độc cho tế bào bình thường Tuy chưa có thử nghiệm độc tính cấp độc tính bán trường diễn, nghiên cứu góp phần cho thấy phân đoạn dịch chiết từ Vối khơng gây độc Hình Ảnh hưởng CVT-EtOAc (A) CVT-W (B) đến hoạt hóa caspase-3 tế bào HL-60 Theo kết độc tính tế bào, phân đoạn từ cành Vối thuốc CVT-EtOAc CVT-W lựa chọn để thử 60 N Y Nhi,, T T T Linh, L T Anh, V T L Mỹ, T T P May, P T V Phú, H Lời, V P K Thương, T M Hùng nghiệm mơ hình kích hoạt caspase-3 thẩm tách miễn dịch Western Blot dòng tế bào HL-60 Caspase-3 enzyme họ cysteine-aspartic acid protease Caspase tồn dạng proenzyme khơng hoạt động có nhiệm vụ phân giải protein gốc aspartic để biểu tiểu đơn vị lớn nhỏ tế bào Các tiểu đơn vị bị kích hoạt tạo thành dimer hóa, dạng enzyme hoạt động Tế bào HL-60 (1×106/giếng) ủ với CVT-EtOAc CVT-W (10–100 μg/mL) 37°C với chất caspase3 (Ac-DEVD-AFC) Cường độ huỳnh quang chất ly giải tế bào đo để xác định hoạt tính caspase-3 Mẫu đối chứng âm chứa DMSO 0,1% Dữ liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± SD kết từ ba thí nghiệm độc lập (* p