Bài báo này trình bày một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của lá cây dứa dại Pandanus tectorius Parkins. ex J.P. du Roi., thu hái tại Thừa Thiên - Huế. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE Interdisciplinary Sci., 2014, Vol 59, No 1A, pp 174-181 This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ CÂY DỨA DẠI (PANDANUS TECTORIUS PARKINS EX J.P DU ROI Ở THỪA THIÊN - HUẾ Lương Thị Cúc Hoa, Lâm Thị Hải Yến, Đặng Ngọc Quang, Phạm Hữu Điển Khoa Hóa học, Đại học Sư phạm Hà Nội Tóm tắt Cao chiết n-hexan etyl axetat dứa dại (Pandanus tectorius Parkins ex J.P du Roi, thu hái xã Lộc Bình, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên - Huế 10/2012) có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mơ (KB) mức trung bình (IC50 tương ứng 48,00 37,05 µg/mL) Từ hai cao chiết này, sử dụng phương pháp sắc kí cột, sắc kí mỏng, phương pháp kết tinh phân lập bốn hợp chất 1-4 Bằng phương pháp phổ IR, MS, H NMR, 13 C NMR, HSQC, HMBC xác định cấu trúc bốn hợp chất β-sitosterol 1, stigmasta-5,22-dien-3β-ol 2, vitexin tricin Vitexin có hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB mức trung bình (IC50 = 25,28 µg/mL), khơng có khả kháng bốn chủng vi sinh vật chủng nấm kiểm định Từ khóa: Pandanus tectorius, dứa dại, tricin, vitexin, gây độc tế bào ung thư Mở đầu Cây dứa dại, gọi dứa gỗ, dứa gai có tên khoa học Pandanus tectorius Parkins.ex J.P du Roi., thuộc họ Dứa dại Pandanaceae Cây dứa dại phân bố rộng rãi bờ biển Ấn Độ, Xri Lanca, Mianma, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, Trung Quốc, Nam quần đảo Ryu Kyu, Malaixia, Micronesia, Phillipin bãi cỏ ẩm có cát, bụi ven biển dọc theo biển, rừng ngập mặn Theo kinh nghiệm dân gian phần mặt đất loài dứa dại sử dụng để chữa viêm họng, bị ngộ độc thức ăn, chữa đái dắt, đái buốt, trị viêm thận, thủy thũng, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm gan, xơ gan cổ trướng [1] Các nghiên cứu gần [2, 3] cho thấy thành phần hóa học dứa dại ancaloit, tecpenoit, axit hữu lignan Năm 1993 Liên hệ: Phạm Hữu Điển, e-mail: dienph@hnue.edu.vn 174 Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư PGS.TS Lê Thị Anh Đào (trường Đại học sư phạm Hà Nội, [4]) nghiên cứu thành phần hoá học tinh dầu hương nếp lấy từ dứa thơm Pananus amaryllia Roxd., phân lập 3-metyl-2(5H)-furanon, 2-axetyl-1-pyrolin chất có mùi hương nếp 2-axetyl-1-pyrolin Bài báo trình bày số kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư dứa dại Pandanus tectorius Parkins ex J.P du Roi., thu hái Thừa Thiên - Huế Nội dung nghiên cứu 2.1 Thực nghiệm Nguyên liệu: dứa dại (Pandanus tectorius Parkins ex J.P du Roi) thu hái xã Lộc Bình, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên - Huế 10/2012 Tên ThS Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm KH CN Việt Nam xác định Lá dứa dại sau thu hái rửa sạch, phơi khơ nơi thống mát sấy 50◦ C, sau xay thành bột mịn Thiết bị: Điểm nóng chảy đo thiết bị Gallen Kamp (CHLB Đức) Phổ H NMR, 13 C NMR, HSQC - máy Brucker Avance 500 MHz (chất nội chuẩn: TMS), phổ hồng ngoại - máy Shimadzu FTIR- 8101M (ép viên với KBr), phổ khối lượng thiết bị Engine 5989-HP Sắc kí lớp mỏng: sử dụng mỏng tráng sẵn silica gel đế nhôm (hãng Merck); phát chất đèn tử ngoại ba bước sóng 254, 302 365 nm dùng thuốc thử dung dịch axit H2 SO4 10% Sắc kí cột tiến hành với chất hấp phụ silica gel (hãng Merck), cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230-400 mesh) Máy đông cô chân không Labconco (Mĩ) dùng để đông cô mẫu trước đo phổ Chiết tách: Bột dứa dại khô (5,0 kg) đem chiết metanol nhiều lần đến nhạt màu, cất cô quay áp suất thấp, thu 320 gam cao tổng Sau đem chiết hệ dung môi pha (dung môi hữu cơ/nước): n-hexan/nước, etyl axetat/ nước, n-butanol/nước (tỉ lệ thể tích = 1:1); cất cô quay áp suất thấp pha dung môi hữu cơ, 54,16 gam; 63,39 gam 44,86 gam cao tương ứng; pha nước - 125,48 gam Lấy 54,16 gam cao chiết từ pha n-hexan đem chạy sắc kí cột silica gel, hệ dung mơi rửa giải n-hexan:etyl axetat (n-H:E) = từ 100: đến 0:100, phân đọan, kí hiệu LH1-LH6 Từ phân đoạn LH1 kết tinh hợp chất (20 mg); từ phân đoạn LH2 kết tinh hợp chất (15 mg) Lấy 63,39 gam cao chiết từ pha etyl axetat đem chạy cột sắc kí silica gel, hệ dung mơi rửa giải n-hexan: etyl axetat tỉ lệ từ 4:1 đến 0:100, 11 phân đoạn, kí hiệu LE1-LE11 Từ phân đoạn LE2 kết tinh hợp chất (20 mg), từ phân đoạn LE5 - kết tinh chất (2 mg) Nhận dạng chất β -Sitosterol (1): Tinh thể hình kim, khơng màu, Rf = 0.45 (hệ dung môi n-H : E= 4:1), tnc = 139-140◦ C, tan tốt CHCl3 , axeton, metanol IR (KBr, cm−1 ): 3440 (tù, m, 175 Lương Thị Cúc Hoa, Lâm Thị Hải Yến, Đặng Ngọc Quang, Phạm Hữu Điển νOH ), 2958 (νCH no ), 1654, 1459 (νC=C ), 1375, 1059, 965, 805, 601 H NMR (δ, ppm): 5,35 (1H, m, H-6), 3,53 (1H, m, H-3), 2,28 2,23 (2H, m, H-4), 0,68 (3H, s, H-18), 1,00 (3H, s, H-19), 0,92 (3H, d, J=5.5Hz, H-21), 0,83 (3H, d, J=7,1 Hz, H-26), 0,84 (3H, d, H-27), 0,86 (3H, t, H-29) Stigmasta-5,22-đien-3β-ol (2): Tinh thể hình kim, khơng màu, Rf = 0.55 (hệ dung môi n-hexan : etyl axetat = 4:1), t0nc = 139-140◦ C, dễ tan dung mơi phân cực, khó tan nước ESI-MS [M-H]- (m/z): 411.3 IR (KBr, cm−1 ): 3540 (tù, m, νOH ), 2860 (νCH no ), 1646, 1464 (νC=C ), 1080 H NMR (δ, ppm): 5.35 (1H, m, H-6), 3,59 (1H, m, H-3), 2,28 2,23 (2H, m, H-4), 0,68 (3H, s, H-18), 1,00 (3H, s, H-19), 0,92 (3H, d, J= 5.5 Hz, H-21), 0,83 (3H, d, J = 7,1 Hz, H-26), 0,84 (3H, d, H-27), 0,86 (3H, t, H-29) Vitexin (3): Kết tinh vơ định hình, màu vàng rơm, t0nc = 256-257◦ C, tan tốt DMSO ESI-MS positive [M+H]+ m/z 433,04, IR (KBr, cm−1 ): 3389, 3249 (tù, m, νOH ), 2919, (νCH no ), 1655, 1654 (nhọn, m, νC=O ),1612, 1564, 1506 (νC=C ) 1362, 1298, 1178, 1104, 1021, 832, 654 Phổ H 13 C NMR: trình bày Bảng Tricin (4): Kết tinh vơ định hình, màu vàng nhạt, t0nc = 186-187◦ C, tan tốt DMSO ESI-MS negative [M-H]− m/z 329.02, IR (KBr, cm−1 ): 3427 (tù, m, νOH ), 1654 (nhọn, tb, νC=O ), 1027, 1003, 828, 766, 609 Phổ H 13 C NMR: xem Bảng Thử hoạt tính sinh học Các cao chiết phân đoạn (từ pha n-hexan, etyl axetat, n-butanol, nước) hợp chất thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư dịng KB theo phương pháp ni cấy thạch [5] Ngồi ra, hợp chất cịn thử nghiệm hoạt tính kháng nấm, khuẩn theo phương pháp sàng lọc vi phiến 96 lỗ Các phép thử tiến hành Phịng hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.2 Kết thảo luận Hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB cao chiết phân đoạn Bảng Hoạt tính gây độc tế bào ung thư dịng KB cao chiết phân đoạn từ dứa dại Hoạt tính gây độc tế bào dịng KB (µg/mL) STT Tên mẫu % Ức chế nồng độ Giá trị IC50 128 32 0,5 LH 65 47 35 33 30 48,00 LE 86 48 33 29 27 37,05 LB 58 28 27 24 23 102,40 LN 43 30 27 25 25 >128 Elipticin 0,31 176 Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng KB bốn cao chiết phân đoạn n-hexan, etyl axetat, n-butanol, nước từ dứa dại P.tectorius Bảng Từ kết bảng cho thấy số cao chiết thử nghiệm, cao chiết từ n-hexan từ etyl axetat có hoạt tính gây độc tế bào ung thư dịng KB mức trung bình, với giá trị IC50 tương ứng 48,00 37,05 µg/mL Chúng tơi tập trung nghiên cứu thành phần hóa học hai cao chiết Phân lập, xác định cấu trúc hợp chất từ hai cao chiết có hoạt tính Hợp chất (β-Sitosterol): Phổ IR cho thấy vân hấp thụ cường độ lớn bước sóng 3440 cm−1 gán cho dao động hóa trị nhóm OH; hai vân hấp thụ khác, cường độ trung bình bước sóng 1654 1459 cm−1 gán cho dao động liên kết đôi C=C Phổ H NMR cho thấy hợp chất có 50 proton, cộng hưởng chủ yếu vùng trường cao (δH 0,68 - 2,34 ppm), đặc trưng cho sterol Ngồi ra, cịn có proton vùng trường trung bình: δH 5,35 ppm (1H, m), gán cho proton olefinic H-6; proton lại với δH 3,49 ppm (1H, m), gán cho proton cacbinol H-3 Từ chứng trên, xác định hợp chất β-sitosterol, C29 H50 O [6], sterol phổ biến hầu hết loài thực vật Hợp chất (Stigmasta-5,22-dien-3β-ol): Phổ ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M-H]− với số khối m/z=411,3 Kết hợp với phương pháp phổ khác cho phép xác định công thức phân tử C29 H48 O Phổ IR cho thấy vân hấp thụ cường độ lớn bước sóng 3450 cm−1 gán cho dao động hóa trị nhóm OH; hai vân hấp thụ khác, cường độ trung bình bước sóng 1646 1464 cm−1 gán cho dao động liên kết đôi C=C Phổ H NMR cho thấy hợp chất có tất 48 proton, cộng hưởng chủ yếu vùng trường cao (δH 0,68 – 2,32 ppm), đặc trưng cho sterol Ngồi ra, cịn có proton vùng trường trung bình: δH 5,32 ppm (1H, m), gán cho proton olefinic H-6; proton lại với δH 3,52 ppm (1H, m), gán cho proton cacbinol H-3 Khác với 1, hợp chất cịn có hai proton olifenic với δH 5,02 (1H, m) 5,14 (1H, m), chứng tỏ có thêm liên kết đơi so với Từ chứng trên, xác định hợp chất stigmasta-5,22-dien-3β-ol [6], số sterol phổ biến thực vật Hợp chất (Vitexin): Hợp chất kết tinh vô định hình, màu vàng rơm, khó tan 177 Lương Thị Cúc Hoa, Lâm Thị Hải Yến, Đặng Ngọc Quang, Phạm Hữu Điển dung môi thông thường, tan tốt dung môi DMSO Phổ LC-MS dương cho pic giả ion phân tử [M+H]+ với số khối m/z= 433,04 Kết hợp với giá trị phổ IR, H NMR, 13 C NMR (Bảng 2) suy công thức phân tử hợp chất C21 H20 O10 (M = 432) Phổ IR có vân hấp thụ tù, mạnh, nhiều đỉnh, tần số từ 3249 đến 3389 cm−1 gán cho dao động hóa trị nhiều nhóm OH; vân hấp phụ cường độ lớn tần số 1655 cm−1 gán cho dao động hóa trị nhóm cacbonyl Phổ H NMR có cấu trúc điển hình flavonon-glicozit với proton thơm, không no proton monosaccarit proton hiđroxyl Cụ thể: proton thơm doublet từ cặp tương đương với giá trị J (Hz) trùng nhau, có hiệu ứng mái nhà (2H, δH 6,90, d, J =8,5Hz 2H, δH 8,03, d, J =8,5Hz) gán cho proton thơm từ cặp vị trí liền kề (vị trí octo nhau) Một proton thơm singlet (1H, δH 6,28, s) gán cho proton lại vòng benzen thứ hai Bẩy proton cộng hưởng vùng trường trung bình với δH từ 3,53 đến 4,70 ppm gán cho proton từ α-D-glucopiranozơ Ngồi ra, phổ H NMR cịn proton singlet với giá trị δH 6,78 ppm gán cho proton liên kết với cacbon lai hóa sp2 Cacbon bị hút electron mạnh liên kết trực tiếp với C=O, C-O- Một proton khác, có tính axit, cộng hưởng vùng trường yếu (1H, δH 13,17, s) gán cho proton hiđroxyl tạo liên kết hiđro nội phân tử mạnh với nhóm C=O gần kề Phổ 13 C NMR có 19 pic với giá trị δC dao động từ 61,4 ppm đến 182,1 ppm, có cặp giá trị δC trùng (115,9 129,0) Điều chứng tỏ hợp chất có tất 21 cacbon, gồm vịng thơm benzen (trong có vịng benzen lần thế, đối xứng), cacbon từ α-D-glucopiranozơ cacbon khơng no (trong có cacbon cacbonyl với giá trị δC 182,1 ppm) So sánh giá trị phổ với Vitexin [7] thấy có trùng khớp tốt, kết luận hợp chất Vitexin, flavonon-glicozit phân lập từ cọ Hợp chất (Tricin): Hợp chất kết tinh vơ định hình, màu vàng nhạt, khó tan dung mơi thơng thường, tan tốt dung môi DMSO Phổ LC-MS âm cho pic giả ion phân tử [M-H]- với số khối m/z= 329,02 Kết hợp với giá trị phổ IR, H NMR, 13 C NMR (Bảng 2) suy công thức phân tử hợp chất C17 H14 O7 (M=330) Phổ IR có vân hấp thụ mạnh tần số 3427 cm−1 tương ứng với dao động hóa trị nhiều nhóm OH, vân hấp phụ cường độ trung bình tần số 1654 cm−1 gán cho dao động hóa trị nhóm cacbonyl bị yếu phần tạo liên kết hiđro nội phân tử với nhóm OH Phổ H NMR có cấu trúc điển hình hợp chất flavonoit với 12 proton thơm không no Cụ thể: proton từ nhóm metoxy tương đương (6H, δH 3,88 ppm, s) proton thơm singlet tương đương (2H, δH 7,22 ppm, s) gán cho proton vịng benzen có nhóm thế, đối xứng Hai proton thơm doublet (1H, δH 6,20, d, J=2,0Hz 1H, δH 6,56, d, J=2,0Hz) có số tách nhỏ, nhau, kèm hiệu ứng mái nhà - chứng tỏ chúng thuộc vòng benzen thứ hai vị trí octo Một proton singlet với giá trị δH 6,97 ppm gán cho proton liên kết với cacbon lai hóa sp2 Cacbon liên kết với nhóm hút electron mạnh C=O, C-O- Một proton có tính 178 Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư axit, cộng hưởng vùng trường yếu (1H, δH 12,95, s) gán cho proton hiđroxyl tạo liên kết hiđro nội phân tử mạnh với nhóm C=O gần kề Phổ 13 C NMR có 14 pic, δC dao động từ 56,9 ppm đến 182,0 ppm, có cặp tương đương (δC 56,9 OCH3, 104,89, 148,7 ppm) Điều chứng tỏ hợp chất có tất 17 cacbon, gồm 12 cacbon từ vòng thơm benzen (trong có vịng benzen lần thế, đối xứng) với cacbon liên kết trực tiếp với oxi (δC 140,4, 148,7, 148,7, 157,8, 161,9, 164,2, 164,6 ppm), cacbon cacbonyl (δC 182,3 ppm) So sánh giá trị phổ với Tricin [8] chúng tơi thấy có trùng khớp tốt, kết luận hợp chất Tricin, flavoinoit phân lập từ Qua lâu (Trichosanthes kirilowi Maxim.) Bảng Phổ H NMR, 13 C NMR (DMSO-d6) hợp chất 13 H NMR δH (ppm) C NMR δC (ppm) STT 4 164,0 164,6 6,78 s 6,97 s 102,5 104,1 182,1 182,3 161,2 157,8 6,28 s 6,20 d J=2,0Hz 98,2 99,3 162,7 164,2 6,56 d J=2,0Hz 104,6 94,7 156,0 161,9 10 104,1 104,2 1’ 121,6 120,9 2’ 8,03 d J=8,5Hz 7,32 s 129,0 104,9 3’ 6,90 d J=8,5Hz 115,9 148,7 4’ 160,4 140,4 5’ 6,90 d J=8,5Hz 115,9 148,7 6’ 8,03 d J=8,5Hz 7,32 s 129,0 104,9 1” 4,70 d J=10,0Hz 73,4 179 Lương Thị Cúc Hoa, Lâm Thị Hải Yến, Đặng Ngọc Quang, Phạm Hữu Điển 2” 3” 4” 5” 6” OCH3− 3’, 5’ OH-5 3,85 t J=9,5Hz 3,35 m 3,34 m 3,26 m 3,76 m; 3,53 m 70,9 78,7 70,6 82,0 61,4 - - 6H 3,88 s - 56,9 13,17 s 12,96 s - - Hoạt tính sinh học chất Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy: hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô (tế bào KB) mức độ trung bình (IC50 = 25,28 µg/mL, khơng có khả kháng chủng vi sinh vật kiểm định (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum, Salmonella enteric, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) chủng nấm kiểm định (Candida albican) Kết luận Cao chiết n-hexan etyl axetat dứa dại (Pandanus tectorius Parkins ex J.P du Roi, thu hái xã Lộc Bình, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên - Huế 10/2012) có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mơ (KB) mức trung bình (IC50 tương ứng 48,00 37,05 µg/mL) Từ hai cao chiết này, phân lập xác định cấu trúc hợp chất β-sitosterol 1, stigmasta-5,22-dien-3β-ol 2, vitexin tricin Vitexin có hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB mức trung bình (IC50 = 25,28 µg/mL) Lời cảm ơn: Cơng trình hồn thành tài trợ kinh phí đề tài cấp Bộ GD & ĐT, mã số B2013-17-37, tác giả xin trân trọng cám ơn TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Võ Văn Chi, 2001 Từ điển thuốc Việt Nam Nxb Y học, Hà Nội, tr 428 [2] Mario A., Hiromitsu T., Norio A., Mariko K., Scott G F., Maribel G N., 2008 Antitubercular triterpenes and phytosterols from Pandanus tectorius Soland var laevis J.of Nat.Medicines Vol 62, No 2, pp 232-235 [3] Tan M.A., Takayama H., Aimi N., Kitajima M., Franzblau S.G., Nonato M.G, 2008 Antitubercular triterpenes and phytosterols from Pandanus tectorius Soland.var.laevis J Nat Med Vol.62, pp 232-235 180 Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư [4] Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Liên, 1993 Nghiên cứu thành phần hoá học tinh dầu hương nếp từ dứa thơm Pandanus amaryliia Roxb-Việt Nam Tạp chí khoa học, trường ĐHSP Hà Nội, số 3, tr 184-187 [5] Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Kenneth D.P., Monks A., Tierney S., Nofziger T.H., Currens M.J., Seniff D., Boyd M.R., 1988 Evaluation of a soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines Cancer Reseach Vol 48, pp 4827-4833 [6] Goad L.J., Akihisha T., 1997 Analys of sterols Blackie acad & Profess Publ., pp.378, 380 [7] Omayma A.E et al, 2009 Potential antioxidant phenolic metabolites from doum palm leaves African J of Pharm and Pharm-logy, Vol.47 , No.4, pp.158-164 [8] Jing J.J., Yu Z., Chenmei L., Jie E.L., Xiao Q.W., Ying Z., 2007 Separation and purification of Tricin from a antioxidant product derived from Bamboo leaves J Agric Food Chem, Vol.56, No.25, pp.10086-10092 ABSTRACT Chemical constituents and cytotoxicity of Pandanus tectorius Parkins ex J.P du Roi leaves, collected in Thua Thien, Hue Province n-hexane and ethyl acetate extracts, made from Pandanus tectorius Parkins ex J.P du Roi leaves, collected in Thua Thien, Hue Province, have shown a remarkable cytotoxicity towards KB cell lines, with IC50 values of 48.00 and 37.05 µg/mL, respectively Four metabolites were isolated from these extracts using silica gel column chromatography and idenfied as β-sitosterol 1, stigmasta-5,22-dien-β-ol 2, vitexin and tricin using various spectroscopic methods (IR, MS, H NMR, 13 C NMR, HSQC, HMBC) Vitexin showed moderate cytotoxicity towards KB cell lines with the IC50 value of 25.28 µg/mL 181 ... 176 Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng KB bốn cao chiết phân đoạn n-hexan, etyl axetat, n-butanol, nước từ dứa dại. .. lập 3-metyl-2(5H)-furanon, 2-axetyl-1-pyrolin chất có mùi hương nếp 2-axetyl-1-pyrolin Bài báo trình bày số kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư dứa dại Pandanus tectorius. .. 2.2 Kết thảo luận Hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB cao chiết phân đoạn Bảng Hoạt tính gây độc tế bào ung thư dịng KB cao chiết phân đoạn từ dứa dại Hoạt tính gây độc tế bào dịng KB (µg/mL) STT