Bài viết trình bày định tính thành phần hóa học, định lượng flavonoid toàn phần và đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết cây Hạ khô thảo nam (Blumea lacera).
tạp chí y - dợc học quân số 8-2018 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA CỦA HẠ KHƠ THẢO NAM (Blumea lacera (Burn.F.) DC) Trịnh Khánh Linh1; Trần Văn Cường1; Nguyễn Văn Thư2 TĨM TẮT Mục tiêu: định tính thành phần hóa học, định lượng flavonoid toàn phần đánh giá tác dụng chống oxy hóa phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam (Blumea lacera) Đối tượng phương pháp: định tính phân đoạn dịch chiết từ phần mặt đất Hạ khô thảo nam qua số nhóm hợp chất hóa học phản ứng hóa học đặc trưng, định lượng flavonoid toàn phần phương pháp tạo màu với AlCl3 môi trường kiềm-trắc quang, đánh giá tác dụng chống oxy hóa thơng qua khả dọn gốc tự DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Kết kết luận: Hạ khơ thảo nam có chứa số nhóm hợp chất alcaloid, flavonoid, tanin, saponin, sterol, terpenoid, polysaccharid, carotenoid Hàm lượng flavonoid toàn phần đạt 13,08 mg/g Các phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam thể hoạt tính chống oxy hóa, phân đoạn BLE có tác dụng tốt * Từ khóa: Hạ khơ thảo nam; Dọn gốc tự do; Hóa thực vật; Chống oxy hóa Phytochemical Investigation and Antioxidant Activity of Blumea lacera (Burn.F.) DC Summary Objectives: To evaluate the phytochemical constituents and to investigate the antioxidant activity of extracts from aerial part of Blumea lacera Materials and methods: Crude ethanol extract from aerial part of B lacera and its derived fractions were assessed for phytochemical classes Total flavonoid content was determined by aluminium chloride colorimetric method Antioxidant activity was determined using 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenger methods Results and conclusion: B lacera is a source of various phytoconstituents such as alkaloids, flavonoids, tannins, saponin, sterol, carotenoid, polysaccharide and terpenoids Total flavonoids in the methanol extract were 13.08 ± 1.23 mg/g quercetin equivalents With regards to DPPH experiments, all of the fractions from ethanol extract showed DPPH free radical scavenging capacity The highest activity was obtained from the fraction ethyl acetate with the SC50 value of 18.56 mg/mL * Keywords: Blumea lacera; Free radical scavenging; Phytochemical; Antioxidant Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Thư (thu_vmmu@hotmail.com) Ngày nhận bài: 10/08/2018; Ngày phản biện đánh giá báo: 15/09/2018 Ngày báo ng: 26/09/2018 Tạp chí y - dợc học quân sù sè 8-2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Hạ khô thảo nam có tên khoa học Blumea lacera (Burn.f.) DC., thuộc họ Cúc (Asteraceae) Theo Đông y, Hạ khô thảo nam dùng làm thuốc trị tràng nhạc, nhọt lở, cầm máu vết thương, băng huyết, chảy máu cam, tức ngực, ho có đờm, táo bón, ngủ, đái vàng nóng [1] Hạ khơ thảo nam có nhiều tác dụng sinh học gây độc số dòng tế bào ung thư (dạ dày, ruột kết, ung thư vú), kháng bệnh bạch cầu in vitro, ức chế Herpes virut týp (HSV1 HSV2), kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, tiểu đường [3, 4, 5, 6, 7] Nhiều nghiên cứu trước cho thấy Hạ khơ thảo nam có chứa nhóm hoạt chất flavonoid, terpen glycosid, polyphenol, tinh dầu, terpenoid keton, sterol [8] Ở Việt Nam, nguồn nguyên liệu Hạ khô thảo nam dồi nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học dược liệu hạn chế Bài báo trình bày kết nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa số phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng, vật liệu nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: Phần mặt đất Hạ khô thảo nam thu hái năm 2018 Sa Pa (Lào Cai) Mẫu Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thẩm định tên khoa học * Hóa chất dung mơi: Chất chuẩn axít gallic (hàm lượng ≥ 98%) thuốc thử folin - ciocalteu (Hãng Sigma Aldrich) Chất chuẩn quercetin hàm lượng 90,87% (Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương) Các dung mơi, hóa chất phòng thí nghiệm: ethanol (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (DCM), n-hexan, natri carbonat, nhơm clorid, axít acetic, natri acetat (Hãng Merck); axít ascorbic, DPPH (Hãng Sigma)… đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích * Thiết bị: Máy đo hàm ẩm tự động ShimadzuMoc 63U (Nhật Bản); máy đo quang UV-Vis Biochrom Libra S70 PC (Anh); cân phân tích Mettler Toledo độ xác 0,1 mg (Trung Quốc); máy chiết siêu âm gia nhiệt Sineo Uwave - 1000 (Trung Quốc); pipet xác, bình định mức (loại A); cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm loại dụng cụ, thiết bị khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu * Chiết xuất phân đoạn dịch chiết: Cân 1,1 kg bột thô phần mặt đất Hạ khô thảo nam, chiết hồi lưu lần với EtOH 96%, để nguội, lọc, tập trung dịch lọc, bốc dung môi áp suất giảm thu cắn EtOH Sau đó, phân tán cắn EtOH nước nóng (70oC), lắc với dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat thu phân đoạn dịch chiết Các phân đoạn cất thu hồi dung môi áp suất giảm, thu cắn n-hexan (BLH; 5,2 g), cắn dicloromethan (BLD; 10,7 g), cắn ethyl acetat (BLE; 8,6 g) tạp chí y - dợc học quân sù sè 8-2018 Phần dịch nước lại áp suất giảm, sấy khô đến cắn (BLW; 17,9 g) * Định tính nhóm hợp chất hữu phản ứng hóa học đặc trưng: Tiến hành phản ứng hóa học đặc trưng theo quy trình phương pháp nghiên cứu thuốc [2] * Định lượng flavonoid toàn phần: Hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo cơng thức sau: X (mg/g) = At - b m.a.(100 - h) × 125 Trong đó: X (mg/g): hàm lượng flavonoid tồn phần phần mặt đất Hạ khơ thảo nam Định lượng flavonoid toàn phần theo phương pháp có biến đổi Meda CS [9] At: độ hấp thu bước sóng 425 nm mẫu thử Dung dịch quercetin chuẩn: pha quercetin chuẩn MeOH:H2O (1:1) có nồng độ mg/ml Từ chuẩn gốc pha thành dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 175, 150, 125, 100 75 µg/ml a, b: hệ số phương trình tuyến tính chất chuẩn y = ax + b Dung dịch thử: cân xác 10,0 g bột dược liệu cho vào bình nón 250 ml, thêm 150 ml dung dịch MeOH:H2O (1:1), chiết siêu âm 50oC 60 phút (150 ml/lần × lần), lọc thu dịch chiết Dịch chiết thu hồi dung mơi 1/5 thể tích, sau thủy phân dung dịch HCl 20% 85oC Dịch thủy phân để nguội, lắc với 15 ml ethylacetat (15 ml/lần × lần), gộp dịch chiết cho vào bình định mức 50 ml bổ sung dung môi đến vạch Phản ứng tạo màu: hút xác ml dung dịch phân tích (dung dịch chuẩn dung dịch thử) cho vào bình định mức 25 ml, thêm 0,5 ml dung dịch natri citrat 1% Thêm tiếp 2,0 ml dung dịch AlCl3 0,5% Sau đó, bổ sung dung dịch axít acetic 5% pha methanol đến vạch Lắc đều, để yên 45 phút, tiến hành đo quang bước sóng 425 nm m: khối lượng dược liệu (g) h: độ ẩm dược liệu * Đánh giá tác dụng chống oxy hóa số phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam thông qua khả loại gốc tự (GTD) DPPH: Tiến hành thực nghiệm theo phương pháp Yuvaraj CS (2013) [10] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Mẫu thử cắn phân đoạn dịch chiết pha DMSO thành dải nồng độ: 90, 45, 9, mg/ml DPPH pha methanol (100%) nồng độ 0,25 µM Hút ml mẫu nghiên cứu pha nồng độ vào ống thủy tinh Mỗi nồng độ thử chất lặp lại lần Thêm ml dung dịch DPPH chuẩn bị vào ống có sẵn mẫu nghiên cứu Ống khơng có mẫu thử, có ml nước ml DPPH làm đối chứng âm Ủ 37oC 30 phút Xác định độ hấp thụ dung dịch sau phản ứng bước sóng 517 nm máy đọc ELISA Khả trung hòa GTD (Scavenging Activities - SA) sinh từ DPPH mẫu thử tính theo cơng thức sau: T¹p chí y - dợc học quân số 8-2018 (ODi chứng - ODmẫu thử) % SA = ODđối chứng × 100 Trong đó: ODđối chứng: độ hấp thụ giếng không chứa chất thử ODmẫu chất thử thử: độ hấp thụ giếng chứa Lập phương trình biểu thị mối tương quan khả chống oxy hóa nồng độ chất thử, xác định nồng độ có khả chống oxy hóa 50% Điểm nồng độ SC50, giá trị SC50 xác định dựa vào phương trình y = ax + b, y khả loại bỏ GTD, a b hệ số phương trình y = ax + b KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Định tính nhóm hợp chất hữu phản ứng hóa học Bảng 1: Kết định tính nhóm chất hữu từ phần mặt đất Hạ khô thảo nam Thứ tự Nhóm chất Alcaloid Glycosid tim Anthranoid Flavonoid Coumarin Saponin Tanin Phản ứng định tính Kết Phản ứng với thuốc thử Mayer + Phản ứng với thuốc thử Bouchardat + Phản ứng với thuốc thử Dragendorff + Phản ứng Liebermann - Burchard - Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - Phản ứng Keller - Kiliani - Phản ứng Borntrager - Phản ứng Cyanidin ++ Phản ứng với kiềm ++ Phản ứng với FeCl3 5% +++ Phản ứng đóng mở vòng lacton - Phản ứng diazo hóa - Phản ứng tạo bọt ++ Phản ứng với FeCl3 5% +++ Phản ứng với gelatin 1% ++ Phản ứng với chì acetat 10% ++ Kết luận Có Khơng Khơng Có Khơng Có Có Axit hữu Phản ứng với Na2CO3 ++ Có Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling ++ Có 10 Polysaccharid Phản ứng với thuốc thử Lugol ++ Có 11 Chất béo Tọa vết mờ giấy - Không 12 Sterol Phản ứng Liebermann - Burchard + Có 13 Carotenoid Phản ứng với H2SO4 đặc + Cú tạp chí y - dợc học quân sè 8-2018 Phần mặt đất Hạ khô thảo nam có chứa hợp chất thuộc nhóm alcaloid, flavonoid, tanin, saponin, sterol, axít hữu cơ, carotenoid, polysaccharid đường khử Kết nghiên cứu phù hợp với tác giả khác định tính nhóm hợp chất hữu Hạ khô thảo nam Ahmed CS (2014) nghiên cứu định tính nhóm hoạt chất cho thấy Hạ khơ thảo nam có chứa nhóm hợp chất carbohydrat, flavonoid, alcaloid, terpenoid steroids phân đoạn dịch chiết phân cực [11] Nghiên cứu Pattewar CS (2012) chứng minh có mặt tanin, alcaloid, saponin, anthraquinone glycosid, steroid, flavonoid, phenolic terpenoid từ dịch chiết nước Hạ khơ thảo nam [12] Ngồi ra, Tiwari CS (2012) báo cáo có mặt hợp chất steroid, terpenoid, alcaloid, saponin, khơng có mặt nhóm hợp chất tanin phenolic [13] Định lượng flavonoid toàn phần * Kết xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn quercetin (75 - 150 µg/ml) Thực phản ứng tạo màu với thuốc thử Sau ổn định màu, đo quang phổ UV-VIS bước sóng 425 nm, đánh giá phụ thuộc độ hấp thụ quang với nồng độ dung dịch Bảng 2: Sự phụ thuộc độ hấp thụ vào nồng độ dung dịch quercetin chuẩn Thứ tự Nồng độ (µg/ml) Độ hấp thụ 75 0,223 100 0,328 125 0,393 150 0,464 175 0,563 Đường chuẩn R Y = 0,0033X - 0,0138 0,9929 Hình 1: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ vào nồng độ dung dịch quercetin chun Tạp chí y - dợc học quân sè 8-2018 Có mối tương quan tuyến tính mật độ quang nồng độ quercetin bước sóng 425 nm theo phương trình y = 0,0033x - 0,0138 với hệ số tương quan r2 = 0,9929 Như vậy, sử dụng phương trình đường chuẩn để tính hàm lượng flavonoid tồn phần dịch chiết Hạ khơ thảo nam * Kết định lượng flavonoid toàn phần: Tiến hành định lượng flavonoid toàn phần mẫu Hạ khô thảo nam thu hái Sa Pa Bảng 3: Kết định lượng flavonoid toàn phần từ phần mặt đất Hạ khô thảo nam Mẫu Khối lượng (g) Hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo quercetin (mg/g) 10,00 12,54 10,10 14,76 10,05 13,87 10,02 12,57 10,00 11,64 X ± SD 10,03 ± 0,04 13,08 ± 1,23 Hàm lượng flavonoid toàn phần phần mặt đất Hạ khô thảo nam 13,08 ± 1,23 mg/g tính theo quercetin Chứng tỏ Hạ khơ thảo nam có chứa hàm lượng lớn flavonoid Đây nhóm hợp chất thể nhiều hoạt tính sinh học tốt Do đó, kết nghiên cứu định hướng nghiên cứu tác dụng sinh học chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, giải độc… Đánh giá tác dụng chống oxy hóa số phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam thông qua khả loại GTD DPPH Bảng 4: Hoạt tính loại GTD phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam 10 Nồng độ mẫu thử (mg/ml) BLH BLD BLE BLW 2,25 3,56 11,45 13,61 9,72 12,31 59,61 18,68 45 21,17 36,5 90,5 48,38 90 33,15 57,99 89,63 83,37 SC50 138,22 73,54 18,56 47,62 tạp chí y - dợc học quân số 8-2018 Hình 2: Hoạt tính dọn GTD phân đoạn dịch chiết Hạ khơ thảo nam Hoạt tính loại bỏ GTD có khác biệt phân đoạn dịch chiết nồng độ 1,0; 9; 45 90 mg/ml So sánh giá trị SC50 phân đoạn dịch chiết cho thấy Hạ khô thảo nam, phân đoạn dịch chiết có tác dụng dọn GTD theo thứ tự BLH < BLD < BLW < BLE Điều giải thích phân đoạn dịch chiết ethyl acetat có thành phần hóa học chủ yếu flavonoid phenolic, hợp chất có khả chống oxy hóa tốt, cơng thức cấu tạo hợp chất có nhiều nhóm hydroxyl (-OH) phenol Số lượng vị trí nhóm hydroxyl (hydroxyl vị trí ortho) đặc điểm cấu trúc quan trọng ảnh hưởng đến khả chống oxy hóa hợp chất phenolic Do vậy, hợp chất thuộc nhóm có khả nhường nguyên tử hydrogen từ gốc hydroxyl chúng cho GTD để hình thành gốc phenoxyl bền vững Thử nghiệm DPPH phương pháp thường sử dụng để đánh giá tác dụng chống oxy hóa có nhiều ưu điểm tiến hành nhanh, dễ thực hiện, có độ tin cậy cao khơng đòi hỏi thiết bị hóa chất đặc biệt Ngồi ra, DPPH có độ ổn định cao, tổng hợp GTD không bị phân hủy nước, methanol ethanol Khả dọn GTD phân đoạn dịch chiết phụ thuộc vào khả chống oxy hóa chất có thành phần dịch chiết làm hydrogen hình dạng cấu trúc thành phần KẾT LUẬN Đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa phân đoạn dịch chiết từ phần mặt đất Hạ khô thảo nam thông qua khả dọn GTD DPPH Kết cho thấy, phân đoạn dịch chiết ethyl acetat có thành phần chủ yếu hợp chất flavonoid phenolic có hoạt tính chống oxy hóa mạnh so với phân đoạn lại Nghiên cứu xác định Hạ khô thảo nam nguồn hợp chất chống oxy hóa tự nhiên tiềm với nhiều hợp chất tự nhiờn nh alcaloid, 11 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 8-2018 flavonoid, tanin, saponin, sterol, terpenoid, polysaccharid, carotenoid Đặc biệt, phận mặt đất Hạ khô thảo nam có hàm lượng flavonoid đạt 13,08 mg/g Akter R, Uddin S.J, Tiralongo J, Grice I.D, Tiralongo E A new cytotoxic steroidal glycoalkaloid from the methanol extract of Blumea lacera leaves Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences 2015, 18 (4), pp.616-633 TÀI LIỆU THAM KHẢO Meda A, Lamien C.E, Romito M, Millogo J, Nacoulma O.G Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity Food Chemistry 2005, 91 (3), pp.571-577 Võ Văn Chi Từ điển Cây thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học 1997, tr.170 Ngô Vân Thu, Trần Hùng Dược liệu học, tập Nhà xuất Y học Hà Nội 2013, tr.223-227 Uddin S.J, Grice I.D, Tiralongo Cytotoxic effects of Bangladeshi Medicinal Plant Extracts Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2011, pp.578-1092 Chiang L.C, Cheng H.Y, Chen C.C, Lin C.C In vitro anti-leukemic and antiviral activities of traditionally used medicinal plants in Taiwan American Journal of Chinese Medicine 2004, 32 (5), pp.695-704 Shahwar D, Ullah S, Ahmad N, Ullah S, Khan M.A Antibacterial and antioxidant activities of two Asteracious species growing in Pakistan Asian Journal of Chemistry 2010, 22 (4), pp.3246-3254 Shahwar D, Ullah S, Ahmad N, Ullah S, Ahmad N Anti-diabetic activity of the methanolic extract of Blumea lacera DC (Asteraceae) in alloxan-induced diabetic rats Asian Journal of Chemistry 2011, 23 (12), pp.5403-5406 Ragasa C.Y, Wong J, Rideout J.A Monoterpene glycoside and flavonoids from Blumea lacera Journal of Natural Medicines 2007, 61 (4), pp.474-475 12 10 Yuvaraj P, Subramoniam A, Louis T, Madhavachandran V, Narasu M.L Attenuation of expression of cytokines, oxidative stress and inflammation by hepatoprotective phenolic acids from Thespesia populnea Soland ex Correa stem bark Annals of Phytomedicine 2013, 2, pp.47-56 11 Ahmed F.A, Rahman A, Mubassara S Phytochemical composition, antioxidant activity and cytotoxicity of Blumea lacera Linn from two different habitats Jahangirnagar University Journal of Biological Sciences 2014, (1), pp.37-45 12 Pattewar A.M, Dawalbajea A.B, Gundalea D.M, Pawarb P.B, Kavtikwara P.G, Yerawara P.P, Pandharkara T.M, Patawara V.A Phytochemistryical & anthelmintic studies on Blumea lacera Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences 2012, (4), pp.390-396 13 Tiwari P, Saluja G, Pandey A.S, Sharma N Isolation and biological evaluation of some novel phytoconstituents from Blumea lacera (Burn F.) D.C International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 2012, (4), pp.148-150 ... Việt Nam, nguồn nguyên liệu Hạ khô thảo nam dồi nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học dược liệu hạn chế Bài báo trình bày kết nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa số... tốt Do đó, kết nghiên cứu định hướng nghiên cứu tác dụng sinh học chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, giải độc… Đánh giá tác dụng chống oxy hóa số phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam thông qua... số phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng, vật liệu nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: Phần mặt đất Hạ khô thảo nam thu hái năm 2018 Sa Pa