Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa cây kim thất láng (Gynura nitida DC., Asteraceae)

Kim thất láng là một loài thuộc chi Gynura, họ Cúc. Nhiều loài thuộc chi Gynura (G. procumbens, G. bicolor) được sử dụng để điều trị viêm tại chỗ, hạ huyết áp, cải thiện tuần hoàn máu, chứng thống kinh, ho ra máu và trị tiểu đường. Hiện nay, chưa có công bố nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Kim thất láng. Đề tài bước đầu tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxy hóa các cao chiết trên mô hình quét gốc tự do DPPH và nghiên cứu thành phần hóa học của cây Kim thất láng (Gynura nitida DC.) ở Việt Nam.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG CHỐNG OXY HÓA CÂY KIM THẤT LÁNG (GYNURA NITIDA DC., ASTERACEAE) Hồng Đức Thuận*, Bùi Mỹ Linh** TĨM TẮT Đặt vấn đề: Kim thất láng loài thuộc chi Gynura, họ Cúc Nhiều loài thuộc chi Gynura (G procumbens, G bicolor) sử dụng để điều trị viêm chỗ, hạ huyết áp, cải thiện tuần hoàn máu, chứng thống kinh, ho máu trị tiểu đường Hiện nay, chưa có cơng bố nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý Kim thất láng Đề tài bước đầu tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao chiết mơ hình qt gốc tự DPPH nghiên cứu thành phần hóa học Kim thất láng (Gynura nitida DC.) Việt Nam Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Cây Kim thất láng thu hái Buôn Ma Thuột, Đắc Lắc Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa mơ hình quét gốc tự DPPH dịch chiết cồn 96% cao phân đoạn ether dầu hỏa, cloroform, ethyl acetat, n-butanol, cao nước Sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 96%, phân bố lỏng – lỏng, sắc ký cột pha thuận phương pháp tinh chế để phân lập hợp chất tinh khiết Cấu trúc chất phân lập xác định phổ MS NMR Kết quả: Dịch chiết cồn 96% cao phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa với độ mạnh giảm dần cao ethyl acetat > cao chloroform > cao n-butanol > cao nước > cao ether dầu hỏa với giá trị IC50 34,29, 37,79, 166,4, 207,61, 266,46 g/ml Từ 9,12 kg bột dược liệu chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu 1,24 kg dịch chiết đậm đặc Lắc phân bố lỏng-lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần, sau loại dung mơi thu cao ether dầu hỏa (19,9 g), cao chloroform (45,03 g), cao ethyl acetat (4,24 g), cao n-butanol (81,25 g) Từ 4,24 g cao EA phân lập hợp chất uracil (16 mg), 3,7-dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol (4,2 mg) Kết luận: Dịch chiết cồn 96% cao phân đoạn thể hoạt tính chống oxy hóa, đó, cao ethyl acetat khả chống oxy hóa mạnh với IC50 34,29 g/ml Uracil 3,7-dimethyloct-3-en1,2,6,7-tetrol lần phân lập từ Gynura nitida Từ khóa: Kim thất láng, hoạt tính chống oxy hóa ABSTRACT STUDY ON CHEMICAL CONSTITUENTS AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF GYNURA NITIDA DC., ASTERACEAE Hoang Duc Thuan, Bui My Linh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 201 - 205 Objectives: Gynura nitida DC belongs to the plant family Asteraceae Many species of the genus Gynura Cass are commonly consumed as a culinary cooked vegetable and believed to possess a wide range of benefits, such as anti-inflammatory and antihypertensive agents, improvement of blood circulation, dysmenorrhea, hemoptysis, and diabetes The aim of this study was to analyze the phytochemical constituents, study on antioxidant activity and isolate the active compounds of Gynura nitida Materials and Methods: Antioxidant activity was performed by DPPH radical scavenging method for 96% ethanolic extract and subextracts obtained by liquid-liquid extraction of G nitida Phytochemical study: percolation, liquid – liquid distribution, vaccum liquid chromatography, silica gel column *Khoa Dược - Đại học Lạc Hồng **Khoa Dược - Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Hồng Đức Thuận ĐT: 097 775 2500 Email: hoangthuand08@gmail.com Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 201 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 chromatography, eluted by suitable solvent system The structures of isolated coumpounds were identified by MS, NMR spectroscopic methods Results: The descending order of DPPH scavenging activity of G nitida extracts was ethyl acetate > chloroform > n-butanol > water > petroleum ether with IC50 values of 34.29, 37.79, 166.4, 207.61, 266.46 g/ml, respectively 9.1 kg of finely dried material was percolated with 96% ethanol The ethanol residue was dissolved in water and partitioned with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol to yield four subextracts after evaporation: petroleum ether (19.9 g), chloroform (45.0g), ethyl acetate (4.2 g), and n-butanol (81.3 g) From 4.2 g ethyl acetate extract, uracil (16 mg) and 3,7-dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol (4.2 mg) were isolated Conclusion: The 96% ethanolic extract and subextracts showed potentially antioxidant activity, the ethyl acetate extract showed significant effect in scavenging DPPH radicals with IC50 value of 34.29 g/ml, respectively The antioxidant activity-guided isolation of G nitida led to the identification of uracil and 3,7dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol Key words: gynura nitida, antioxidant ĐẶT VẤN ĐỀ Kim thất láng loài thuộc chi Gynura, họ Cúc Nhiều loài thuộc chi Gynura (G procumbens, G bicolor) sử dụng dân gian để điều trị viêm chỗ, hạ huyết áp, cải thiện tuần hoàn máu, chứng thống kinh, ho máu trị tiểu đường(1,3,8) Các nghiên cứu chứng minh gốc tự nguyên nhân gây chứng viêm, xơ vữa động mạch, Alzheimer gây lão hóa người(2), hoạt chất có tác dụng bắt gốc tự giúp loại bỏ nguy gây bệnh bảo vệ sức khỏe người(9) Với mong muốn bước đầu làm sáng tỏ thành phần hóa học hoạt tính sinh học Kim thất láng, đề tài tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao chiết mơ hình quét gốc tự DPPH Kim thất láng (Gynura nitida DC.) Việt Nam ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm Đối tượng nghiên cứu Phần mặt đất Kim thất láng (Gynura nitida DC., Asteraceae) thu hái thành phố Buôn Ma Thuột vào tháng 07/2017, tỉnh Đắc Lắc Mẫu dược liệu định danh TS Võ Văn Chi PGS.TS Bùi Mỹ Linh (nguyên giảng viên Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 202 Mẫu sấy khơ, ép tiêu thực vật lưu Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh với mã số (BĐR08-2015) Dung mơi hóa chất, trang thiết bị Dung môi sử dụng nghiên cứu dung mơi đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng phân tích bao gồm ethanol, methanol, n-hexan, chloroform ethyl acetat hãng Xilong (Trung Quốc) sản xuất Silica gel sắc ký cột: silica gel hạt mịn (kích thước hạt 0,025 – 0,04 mm) hạt vừa (kích thước hạt 0,04 – 0,063 mm) hãng Merck (Đức) sản xuất Silica gel sắc ký lớp mỏng: nhôm tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck) Phổ khối (ESI-MS) đo máy ALIGENT 1100 MC-LSD Trap Viện Cơng nghệ hóa học Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1HNMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC đo dung môi DMSO-d6 máy Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam Chiết xuất, phân lập Bột dược liệu khô (9,12 kg) xay mịn tới kích thước 0,1 mm, chiết ngấm kiệt ethanol 96% Ngâm dược liệu 24 rút dịch chiết với tốc độ ml/phút Tổng dịch chiết thu 90 lít Cơ thu hồi dung mơi, thu 1,24 kg cao toàn phần, để lạnh loại chlorophyll tách lớp Cao toàn phần sau loại chlorophyll Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 2019 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 thêm nước với tỷ lệ 1:1, lắc phân bố với dung mơi có độ phân cực tăng dần : ether dầu hỏa, cloroform, ethyl acetat, n-butanol (với tỷ lệ cao tồn phần: dung mơi 2:1, chiết nhiều lần dịch chiết nhạt màu) Cô thu hồi dung môi thu cao đặc: ether dầu hỏa (19,9 g), cloroform (45,03 g), ethyl acetat (4,24 g), n-buthanol (81,25 g) Phần dịch lại đem cô thu hồi dung môi thu cao nước (207,61 g) Nghiên cứu Y học khác nhau, thêm ml methanol Hỗn hợp lắc ủ nhiệt độ phòng bóng tối Sau 30 phút, đo độ hấp thu bước sóng 517 nm Tiến hành đồng thời với mẫu trắng (4 ml MeOH), mẫu chứng (0,5 ml DPPH + 3,5 ml methanol) Tiến hành lần, lấy giá trị trung bình Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) tính theo cơng thức: Abs chung  Abs thu Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa phương pháp DPPH HTCO(%)  Nguyên tắc DPPH (l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl) chất tạo gốc tự dùng để thực phản ứng mang tính chất sàng lọc có tác dụng chống oxy hóa chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể qua việc đánh bắt gốc tự do, làm giảm màu DPPH chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt, giảm màu xác định cách đo quang bước sóng 517 nm Tiến hành đo quang lần, lấy giá trị trung bình Abschung: độ hấp thu mẫu chứng, Tiến hành Dùng 0,5 ml dung dịch DPPH (nồng độ 0,5 mM methanol, pha dùng ngày) cho vào 0,5 ml dung dịch cao thử có nồng độ Bảng Bảng giá trị IC50 cao Kim thất láng Mẫu Giá trị IC50 (µg/ml) Cao tổng 98,95 Cao EP 266,46 Abs chung  Abs trang x100% Absthu: độ hấp thu mẫu thử, Abstrang: độ hấp thu mẫu chứng trắng Xây dựng đường chuẩn y = ax + b với phần trăm ức chế DPPH nồng độ khác Từ đó, tính giá trị IC50 vitamin C cao chiết KẾT QUẢ Kết thử hoạt tính chống oxy hóa: Dịch chiết cồn 96% cao phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa với độ mạnh giảm dần cao ethyl acetat (EA) > cao chloroform (CF) > cao nbutanol (n-BuOH)> cao nước > cao ether dầu hỏa (EP) với IC50 34,29, 37,79, 166,4, 207,61, 266,46 g/ml (Bảng 1, Hình 1) Cao CF 37,79 Cao EA 34,29 Cao n-BuOH Cao nước Acid ascorbic 166,4 207,61 2,26 Hình Biểu đồ so sánh giá trị IC50 dịch chiết Kim thất láng Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 203 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Trong cao phân đoạn, cao ethyl acetat cao cloroform có hoạt tính chống oxy hóa mạnh với giá trị IC50 34,29 37,79 g/ml, tiếp cao n-butanol, cao nước cao ether dầu hỏa với IC50 166,4, 207,6, 266,5 g/ml Cao ethyl acetat cho hoạt tính chống oxy hóa mạnh phân đoạn tập trung nhiều polyphenol Như vậy, cao ethyl acetat phân đoạn chủ đạo định hoạt tính chống oxy hóa Kim thất láng Tiến hành sắc ký cột nhanh cao ethyl acetat thu phân đoạn (PĐ 1-9) Phân đoạn (PĐ-4) triển khai qua sắc ký cột rây phân tử sephadex LH-20 thu hợp chất (4,2 mg) Từ phân đoạn PĐ-6 thu tủa màu xám, tủa rửa methanol thu hợp chất (16 mg) Hợp chất Bảng Dữ liệu NMR ((DMSO-d6, 500 MHz) hợp chất C DEPT -NH >C=O -NH >C=O >CH6 >CH- C ppm H ppm, m (J, Hz) HMBC (H  Cn) 10,96 s 151,5 10,79 s 164,3 100,2 5,44 d (1H; 7.5 Hz) C-4, C-6 142,1 7,38 t (1H; 6.0 Hz) C-2, C-4, C-5 động δH 10,98 10,79, proton gắn N Hai tín hiệu proton lại δ 7,38 t (6,0) δ 5,45 d (7,5) có khả liên kết đơi –CH=CHcấu dạng cis Quan sát phổ 13C-NMR, thấy có tín hiệu, có hai tín hiệu δ 164,3 151,4 ppm tín hiệu nhóm amid –CO-N- Hai tín hiệu carbon lại vị trí 100,2 142,1 ppm, dựa phổ HSQC tín hiệu carbon liên kết đôi –CH=CH- Kết hợp liệu so sánh với tài liệu tham khảo(7) hợp chất xác định uracil (Bảng 2) Hợp chất Dạng dịch đậm đặc không màu, phổ khối ESI-MS cho pic ion m/z 227,2 [M+Na]+ 431,3 [2M+Na]+ tương ứng khối lượng phân tử 204, tương ứng với công thức phân tử C10H20O4 Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (DMSO-d6) trình bày Bảng Trên phổ 13C-NMR kết hợp liệu DEPT HSQC, thấy có tín hiệu oxymethylen –CH2O- δ 64,7 ppm, tín hiệu oxymethin -CH-O- δ 77,7 77,0 ppm, tín hiệu -CIV-O- δ 71,6 ppm, nhóm – CH2- δ 29,5 ppm, nhóm CH3- δ 26,4; 24,4; 12,3 ppm Cặp tín hiệu δ 135,7 124,3 ppm cho thấy cấu trúc có nối đơi Trên phổ 1H-NMR, có tín hiệu H gắn với Csp2 5,48 ppm, có tín hiệu đỉnh đơn nhóm methyl δ 1,01; 1,06 1,51 ppm, tín hiệu proton –OH gắn với Csp3 vị trí δ 4,08; 4,30; 4,35; 4,56 ppm Kết hợp liệu so sánh với tài liệu tham khảo(6) hợp chất xác định 3,7dimethyl-3-octen-1,2,6,7-tetrol (Bảng 3, Hình 2) Bột vơ định hình màu vàng nâu, phổ ESI-MS m/z [M-H]- = 111,1, ứng với khối lượng phân tử 112, công thức phân tử C4H4N2O2 Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (DMSO-d6) trình bày Bảng Trên phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz), có tín hiệu, có tín hiệu hydro linh Bảng Dữ liệu phổ NMR (DMSO-d6, 500 MHz) hợp chất Vị trí C ppm 64,7 DEPT 77,7 135,75/135,72 124,35/124,36 29,49/29,47 >CHC >CH>CH2 77,0 71,6 24,4 12,3 >CHC -CH3 -CH3 204 >CH2 H m (J, Hz), nH 3,30 t (5,5); 1H 3,27 m; 1H 3,83 brs, 1H 5,48 brs; 1H 2,28 m [5] (7,0); 1H 1,85 m [6] (7,5); 1H 3,10 m, 1H 1,01 s; 3H 1,51 s; 3H COSY (H  Hn) H-2, 1-OH HMBC (H  Cn) C-2, C-3 H-1, 2-OH H-5 H-4, H-6 C-1, C-3, C-4, C-9 C-2, C-5, C-9 C-3, C-4, C-6 H-5, 6-OH H-5 C-4, C-7, C-8 C-6, C-7, C-10 C-3, C-4 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 2019 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Vị trí 10 C ppm 26,4 - DEPT -CH3 1-OH 2-OH 6-OH 7-OH H m (J, Hz), nH 1,06 s; 3H 4,35 brs; (CH2-OH) 4,56 brs; (>CH-OH) 4,30 d (2,5); (>CH-OH) 4,08 s; (C-OH) Nghiên cứu Y học COSY (H  Hn) - - HMBC (H  Cn) C-6, C-7, C-8 C-1 C-1, C-3 C-6, C-7 C-6, C-7, C-8, C-9 Hình Dữ liệu phổ NMR (DMSO-d6, 500 MHz) hợp chất hợp chất lần phân lập từ BÀN LUẬN Kim thất láng Hai hợp chất uracil 3,7-dimethyloct-3-enTÀILIỆUTHAMKHẢO 1,2,6,7-tetrol lần phân lập Algariri K, Meng KY, et al (2013) “Hypoglycemic and anti– chi Gynura Uracil base nitơ tham gia cấu hyperglycemic study of Gynura procumbens leaf extracts” Asian tạo nucleosid, tham gia cấu tạo mRNA Pacific journal of Tropical Biomedicine, 3:358-366 Uracil phân lập từ loài Carmen PB, et al (2019) “Free radicals in Alzheimer's disease: Lipid peroxydation biomarkers” Climica chimica Acta, 49:85-90 Gynostemma burmanicum(9), Boehmeria nivea(5) 3,73 Chen J, Mangelinckx S, et al (2014) “Caffeoylquinic acid dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol derivatives isolated from the aerial parts of Gynura divaricata monoterpennoid, tồn dạng đồng phân dia and their yeast α-glucosidase and PTP1B inhibitory activity” 13 Fitoterapia, 99:1-6 tự nhiên nên phổ C-NMR xuất Kitajima J, Aoki Y, et al (1998) “Monoterpenoid Polyols in Fruit cặp tín hiệu xấp xỉ Hợp chất of Cnidium monnieri” Chemical and Pharmaceutical bulletin, 46:1580-1582 phân lập từ loài Passiflora Liu C, Zou K, et al (2010) “Chemical constituents from leaves of (4) quadrangularis, Cnidium monnieri Hiện nay, Boehmeria nivea” China Journal of Chinese Materia Medica, 35:1432chưa có nghiên cứu cơng bố tác dụng 1434 Osorio C, Duque C, and Fujimoto Y (2000) “Oxygenated chống oxy hóa tác dụng dược lý uracil monoterpenoids from badea (Passiflora quadrangularis) fruit 3,7-dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol, đề tài tiếp pulp” Phytochemistry, 53:97-101 tục khảo sát hoạt tính chống oxy hóa hai hợp RunHui L, Heng L, et al (2009) “N-containing compounds from the traditional Chinese medicine ChanSu” Chemistry of Natural chất thời gian tới KẾT LUẬN Dịch chiết cồn 96% cao phân đoạn Kim thất láng thể hoạt tính chống oxy hóa, đó, cao ethyl acetat khả chống oxy hóa mạnh với giá trị IC50 34,29 g/ml Hai hợp chất phân lập từ cao ethyl acetat 3,7-dimethyloct-3-en-1,2,6,7-tetrol, uracil Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Compounds, 45:599-600 Teoh WY, Sim KS, et al (2013) “Antioxidant capacity, cytotoxicity, and acute oral toxicity of Gynura bicolor” EvidenceBased Complementary and Alternative Medicine, pp.8-10 Vũ Thị Ngọc Anh, Phạm Thanh Kỳ (2016) “Uracil, adenin, adenosin phân lập từ loài Gynostemma burmanicum King ex Chakrav Việt Nam” Tạp chí Dược học, 55:41-43 Ngày nhận báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/08/2019 Ngày báo đăng: 14/09/2019 205 ... tỏ thành phần hóa học hoạt tính sinh học Kim thất láng, đề tài tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao chiết mơ hình qt gốc tự DPPH Kim thất láng (Gynura nitida. .. Nam ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm Đối tượng nghiên cứu Phần mặt đất Kim thất láng (Gynura nitida DC., Asteraceae) thu hái thành phố Buôn Ma Thuột vào... chiết Kim thất láng Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 203 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Trong cao phân đoạn, cao ethyl acetat cao cloroform có hoạt tính chống oxy hóa