Ứng dụng vi khuẩn lactic đồng lên men với nấm men sản xuất bánh mì thay thế chất bảo quản hóa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM VŨ NGỌC YẾN LY ỨNG DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỒNG LÊN MEN VỚI NẤM MEN SẢN XUẤT BÁNH MÌ THAY THẾ CHẤT BẢO QUẢN HÓA HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành 60420201 TP HCM, tháng 10 năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM VŨ NGỌC YẾN LY ỨNG DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỒNG LÊN MEN VỚI NẤM MEN SẢN XUẤT BÁNH MÌ THAY THẾ CHẤT BẢO QUẢN HÓA HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành 6042020.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM VŨ NGỌC YẾN LY ỨNG DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỒNG LÊN MEN VỚI NẤM MEN SẢN XUẤT BÁNH MÌ THAY THẾ CHẤT BẢO QUẢN HÓA HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 60420201 TP HCM, tháng 10 năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM VŨ NGỌC YẾN LY ỨNG DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỒNG LÊN MEN VỚI NẤM MEN SẢN XUẤT BÁNH MÌ THAY THẾ CHẤT BẢO QUẢN HĨA HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 60420201 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Hồi Hương TP HCM, tháng 10 năm 2021 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP.HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hoài Hương Luận văn Thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 10 năm 2021 Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ) Họ tên TT Chức danh Hội đồng PGS TS Nguyễn Tiến Thắng Chủ tịch GVC.TS Nguyễn Lệ Hà Phản biện PGS.TS Ngô Đại Nghiệp Phản biện TS Trịnh Thị Lan Anh TS San Trâm Anh Ủy viên Ủy viên, Thư ký Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau luận văn sửa chữa (nếu có) Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn TRƯỜNG ĐH CƠNG NGHỆ TP HCM CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Độc lập - Tự - Hạnh phúc TP HCM, ngày 08 tháng năm 2021 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Vũ Ngọc Yến Ly Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 28/08/1986 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 1841880006 I- Tên đề tài: Ứng dụng vi khuẩn lactic đồng lên men với nấm men sản xuất bánh mì thay chất bảo quản hóa học II- Nhiệm vụ nội dung: (1) Nội dụng 1: Khảo sát đặc điểm sinh học, định danh chủng vi khuẩn lactic (2) Nội dung 2: Khảo sát hoạt tính sinh học chủng LAB L5 môi trường MRS môi trường Sữa gầy bổ sung nồng độ glucose khác  chọn mơi trường ni cấy thích hợp thay MRS (3) Nội dung 3: Khảo sát so sánh tiêu (hóa lý, vi sinh, cảm quan) loại bánh mì bổ sung LAB với bánh mì thường bánh mì bổ sung chất bảo quản hóa học calcium propionate (4) Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng thời gian điều kiện bảo quản lên giống khởi động chất lượng bánh mì sử dụng giống khởi động đồng lên men với nấm men (5) Nội dung 5: Đề nghị quy trình sản xuất sử dụng giống khởi động để đồng lên men nấm men bánh mì thay chất bảo quản hóa học III- Ngày giao nhiệm vụ: Ngày 23 tháng năm 2020 IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: Ngày 20 tháng 07 năm 2021 V- Cán hướng dẫn: TS Nguyễn Hoài Hương CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sĩ “Ứng dụng vi khuẩn lactic đồng lên men với nấm men sản xuất bánh mì thay chất bảo quản hóa học” thực với hướng dẫn TS Nguyễn Hồi Hương Ngồi ra, với vai trị người hướng dẫn, tơi có sử dụng số số liệu, kết có liên quan nghiên cứu tiền đề TS Nguyễn Hoài Hương liên quan đến vi khuẩn lactic Tôi xin cam đoan số liệu, kết nêu luận văn trung thực, tài liệu, thơng tin sử dụng Luận văn có nguồn gốc trích dẫn rõ ràng Học viên thực Luận văn (Ký ghi rõ họ tên) Vũ Ngọc Yến Ly ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp cho phép gửi lời cảm ơn đến Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Hoài Hương trực tiếp hướng dẫn tận tâm hỗ trợ suốt thời gian thực luận văn Đồng thời, xin gửi lời cám ơn đến bạn sinh viên khóa 2015, 2016 ngành Cơng nghệ sinh học Viện Khoa học ứng dụng hỗ trợ tơi thực thí nghiệm cho đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân giúp đỡ động viên tơi, giúp tơi vượt qua khó khăn suốt trình thực luận văn Tuy nhiên, thời gian thực luận văn có hạn hạn chế kinh nghiệm, đặc biệt khó khăn tình hình dịch bệnh phức tạp, nên kết thực luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót, hạn chế định Vì vậy, tơi mong nhận đóng góp ý kiến từ quý Thầy/ Cô để giúp hồn thành tốt luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Học viên thực Luận văn (Ký ghi rõ họ tên) Vũ Ngọc Yến Ly iii TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn lên men lactic L5 phân lập từ nem chua định danh thuộc loài Lactobacillus plantarum qua phương pháp giải trình tự gene 16S rRNA Dịch ni cấy L5 (SG0 SG7) hai môi trường Sữa gầy bổ sung 2g/l glucose (SG0) 20g/l glucose (SG7) thể khả ức chế nấm mốc A niger (một loài nấm mốc gây hư hỏng bánh mì) in vitro, khả phân giải protein, tổng hợp acid lactic sinh khối tương đương mơi trường MRS, chọn để lên men sản xuất giống khởi động L5 Bánh mì sản xuất cách đồng lên men nấm men dịch nuôi cấy L5 hai môi trường SG0 SG7 (đặt tên BM-SG0 BM-SG7) có màu sắc, mùi, vị độ xốp yêu thích bánh mì bảo quản calcium propionate (BM-CaP), đặc biệt thời gian bảo quản lên đến – 6,3 ngày, cao so với ngày bánh mì khơng chất bảo quản (BMT) 4,6 ngày bánh mì calcium propionate (BM-CaP) Sau ngày nhiệt độ phòng, BM-SG0 BM-SG7 có mật độ mốc tối đa 109 cfu/ml Hơn nữa, bánh mì từ SG0 cho kết cảm quan vượt trội sau tuần bảo quản giống khởi động Tuy nhiên sử dụng giống khởi động SG0 sau bảo quản – tuần mật độ nấm mốc bánh mì sau ngày nhiệt độ phòng đạt ngưỡng cho phép 100 cfu/g Từ đề nghị quy trình sản xuất sử dụng giống khởi động SG0 để đồng lên men nấm men bánh mì thay chất bảo quản hóa học iv ABSTRACT In this study, lactic acid bacteria strain L5, isolated from fermented meat (nem chua) was identified as Lactobacillus plantarum by 16S rRNA gene sequencing method Its culture broths (SG0 and SG7) in two skimmed milk media, supplemented with 2g/l glucose (SG0) and 20g/l glucose (SG7), displayed their growth inhibition against Aspergillus niger (a mold species which usually spoils bread) in dual culture test in vitro, the proteolytic activity, lactic acid and biomass synthesis equivalent to those obtained in MRS medium, therefore, they were chosen as fermentative media to produce starter culture L5 Bread produced by co-fermenting baker yeast and L5 culture broths SG0 and SG7 (so called BM-SG0 and BM-SG7) gained a more favorable color, taste, flavor and texture than calcium propionate bread (BM-CaP), especially had a shelf-life up to - 6.3 days, compared to days in the case of bread without preservative (BMT) and 4.6 days for calcium propionate bread (BM-CaP) After days at room temperature, BM-SG0 and BM-SG7 had a maximal mold density of 109 cfu/ml Moreover, bread from SG0 obtained outstanding organoleptic results even after weeks of starter storage However, using starter culture SG0 after - weeks of storage, the mold density of days room temperature bread reached the allowable threshold of 100 cfu/g Based on these results, process flow diagrams for starter culture SG0 preparation and its use to co-ferment with baker yeast to produce bread without chemical preservatives have been proposed v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iv MỤC LỤC v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU ix DANH MỤC HÌNH xii DANH MỤC BẢNG xiii MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan công nghệ sản xuất bánh mì 1.1.1 Giới thiệu chung .4 1.1.2 Vai trò nguyên liệu sản xuất bánh mì 1.2 Tổng quan bánh mì bột nhào chua (sour dough) .7 1.2.1 Giới thiệu chung .7 1.2.2 Phân loại bột chua 1.2.3 Hệ vi sinh vật bột chua truyền thống 1.2.4 Con đường trao đổi chất LAB bột chua 1.2.5 Chuyển hóa hợp chất nito LAB bánh mì bột nhào chua 10 vi 1.2.6 Các loại hợp chất hương bột chua 12 1.2.7 Vai trò ảnh hưởng chất bảo quản sản xuất bánh mì 12 1.3 Tổng quan vi khuẩn lactic 14 1.3.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn lactic .15 1.3.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 16 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men – trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic 18 1.3.4 Sản phẩm trao đổi chất ứng dụng vi khuẩn lactic .19 1.3.5 Một số hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn sinh 20 1.3.6 Khả kháng nấm vi khuẩn lactic 22 1.4 Tình hình nghiên cứu khả kháng nấm sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn lactic 24 1.4.1 Các nghiên cứu nước 24 1.4.2 Các nghiên cứu giới 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu .26 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 26 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 26 2.2 Vật liệu nghiên cứu .26 2.2.1 Vi sinh vật 26 2.2.2 Hóa chất mơi trường ni cấy 26 2.2.3 Dụng cụ 27 2.2.4 Thiết bị 28 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 29 PL-7 Sau trang khô, ủ nhiệt độ 370C 24 – 48 cho khuẩn lạc phát triển Tiến hành đếm khuẩn lạc, chọn đĩa có số khuẩn lạc dao động từ 25 – 250 khuẩn lạc định lượng vi sinh vật công thức: 𝑁= ∑𝐶 (𝑛1 + 0.1𝑛2 )𝑑 Trong đó: N: số khuẩn lạc có 1ml mẫu huyền phù ban đầu C: số khuẩn lạc đếm đĩa petri chọn 𝑛1, 𝑛2: số đĩa petri nồng độ pha loãng liên tiếp chọn d: hệ số pha loãng mẫu 2.6 Phương pháp khảo sát khả kháng nấm in vitro a Chuẩn bị môi trường vi khuẩn Chủng LAB L5 hoạt hóa MRS broth 370C 24h Tiến hành tăng sinh cấp MRS broth SG hấp khử trùng 1210C 15 phút, lắc 150 vòng/phút 24h b Chuẩn bị chủng nấm mốc Nấm mốc Aspergillus niger hoạt hóa cách cấy điểm vào đĩa petri chứa môi trường PDA, ủ 72h nhiệt độ phịng c Chuẩn bị mơi trường khảo sát đối kháng Môi trường sử dụng MRS agar cải tiến (không chứa ammonium citrate) hấp khử trùng 1210C 15 phút, sau đổ vào đĩa petri hấp khử trùng, đĩa 15ml Khi thạch đông, tiến hành đục chủng nấm chuẩn bị trước đặt vào tâm đĩa Dùng que cấy vòng cấy vạch chủng vi khuẩn LAB tăng sinh MRS broth SG cách mép đĩa 1,5cm (2 vạch phải nằm đối diện qua tâm đĩa đường kính, hình PL2.3) Đĩa đối chứng âm không cấy vi khuẩn, ủ 370C Quan sát phát triển nấm sau ngày ngày, đo đường kính tản nấm tính tỉ lệ kháng nấm theo công thức (2.1): 𝐓ỉ 𝐥ệ ứ𝐜 𝐜𝐡ế (%) = 𝐃đ𝐜 − 𝐃𝐭𝐧 × 𝟏𝟎𝟎 𝐃đ𝐜 (𝟐 𝟏) PL-8 Trong đó: - Dđc: đường kính tản nấm đĩa đối chứng (cm) - Dtn: đường kính tản nấm đĩa thí nghiệm (cm) Hình PL2.3 Mơ tả cách ria đo đường kính ức chế nấm mốc (theo Brunner cộng sự, 2005) 2.7 Phương pháp khảo sát khả sinh acid Tăng sinh chủng LAB L5 MRS broth, sau cấy chuyền sang mơi trường MRS broth, SG0, SG3 SG7 (các môi trường hấp khử trùng 1210C 15 phút), lắc 150 vòng/phút 24h Hút 10ml dịch tăng sinh vào erlen, đem chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N với thuốc thử phenolphtalein đến dung dịch có màu hồng nhạt pH đạt 8.2 – 8.3 Acid tổng tính quy acid lactic theo cơng thức (2.2): %𝐓𝐀 = 𝐕𝐍𝐚𝐎𝐇 × 𝟎, 𝟎𝟎𝟗𝟎 × 𝟏𝟎𝟎 𝐕𝟏 (𝟐 𝟐) Trong đó: - %TA: độ acid - VNaOH: thể tích NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ - V1: thể tích mẫu mang chuẩn độ 2.8 Phương pháp khảo sát khả phân giải protein Pha môi trường casein với tỷ lệ 1% Casein + 1,5% agar, hấp khử trùng 1210C 15 phút, sau đổ đĩa tiến hành đục lỗ đĩa PL-9 Hút 0,1ml dịch vi khuẩn sau tăng sinh bơm vào giếng thạch, giếng cịn lại bơm mơi trường để làm đối chứng Ủ nhiệt độ phòng 48h nhỏ thuốc thử TCA 10% vào, đo kích thước vịng phân giải (hình PL2.4) Khả phân giải protein đánh giá qua hiệu số (D-d) mm, hiệu số D-d lớn khả phân giải protein cao Trong đó: D: đường kính vịng phân giải (mm) d: đường kính giếng thạch (mm) Hình PL2.4 Cách đo vòng phân giải protease (Egorow NX, 1976) 2.9 Phương pháp xác định thơng số bánh mì a pH Mẫu bánh mì nghiền nhỏ cối sứ Đồng 10g mẫu với 90ml nước cất trung tính máy xay sinh tố nhiệt độ phòng phút Dịch sau đồng đem lọc thu dịch (bỏ 10ml dịch lọc đầu), sử dụng máy đo pH để bàn để đo pH bánh mì b Khối lượng Sử dụng cân phân tích số để cân khối lượng bánh mì sau nướng sau ngày bảo quản PL-10 c Thể tích Định hình bánh mì dạng hình trịn, dùng thước đo đường kính D (mm) chiều cao H (mm) bánh mì sau nướng sau ngày bảo quản (hình PL2.5) Sự thay đổi thể tích bánh đánh giá qua chênh lệch thể tích sau nướng sau thời gian bảo quản Chiều cao (H) Đường kính (D) Hình PL2.5 Phương pháp đo chiều cao đường kính bánh mì Thể tích bánh tính theo cách tính thể tích hình chỏm cầu (2.3): 𝛑𝐇 𝟑𝐃𝟐 ( 𝐕= + 𝐇𝟐 ) 𝟔 𝟒 (𝟐 𝟑) Trong đó: D: đường kính bánh (cm) H: chiều cao bánh (cm) d Độ ẩm Độ ẩm W xác định phương pháp khối lượng sử dụng cân sấy ẩm Cân 1g bánh mì thành phẩm miếng nhơm cân sấy ẩm, sau sấy mẫu 100 – 1050C đến khối lượng không đổi e Tính mật độ nấm mốc Khả kháng nấm bánh mì khảo sát mơi trường DG18 agar bổ sung acid tartric (pH 3,5) Bánh giữ bao nilon khử trùng cồn, sau lấy nghiền nhỏ mẫu cối sứ Đồng 10g mẫu với 90ml dung dịch Peptone Water máy xay sinh tố nhiệt độ phòng phút, pha loãng theo dãy thập phân đến PL-11 nồng độ 10-2 Hút 0,1 ml dịch pha loãng trang đĩa petri chứa môi trường DG18 agar, ủ 370C 72h Đếm đĩa có từ 25 – 250 khuẩn lạc Mật độ nấm mốc tính theo cơng thức 2.4: 𝐀 (𝐜𝐟𝐮/𝐠) = 𝐍 𝐧𝟏 × 𝐕 × 𝐟𝟏 + ⋯ + 𝐧𝐢 × 𝐕 × 𝐟𝐢 (𝟐 𝟒) Trong đó: - A: số khuẩn lạc 1g mẫu - N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn - n: số lượng đĩa cấy độ pha lỗng thứ i - V: thể tích dịch mẫu cấy vào môi trường - f: độ pha loãng tương ứng f Đánh giá cảm quan Nguyên tắc: Người thử nhận dãy mẫu mã hóa, yêu cầu người thử đánh giá mẫu theo mức độ ưa thích quy ước (phụ lục) Khi giới thiệu mẫu, trật tự mẫu trình bày ngẫu nhiên tất người thử xuất số lần đảm bảo cân nhóm người thử Cách tiến hành: - Dụng cụ: dụng cụ thơng thường (đĩa, ly nhựa) - Phịng đánh giá: PTN cảm quan Viện Khoa học ứng dụng - Số lượng người thử: 12 - Trình độ người thử: sinh viên không qua huấn luyện PL-12 PHIẾU HƯỚNG DẪN Xin vui lòng vị nước lọc trước thử mẫu Bạn nhận mẫu bánh mì Hãy nếm mẫu bánh theo thứ tự trình bày từ trái sang phải từ cho biết mức độ ưa thích bạn mẫu bánh mì theo thứ tự tăng dần từ ưa thích đến ưa thích cách ghi mã số mẫu vào thang đánh giá phiếu trả lời Vui lòng đưa câu trả lời cho trường hợp, bạn không chắn Ít ưa thích Ưa thích Lưu ý: - Bạn thử lại mẫu nếm xong tất mẫu Giữa lần thử mẫu vui lòng vị trước thử mẫu Khơng trao đởi q trình thử mẫu Mọi thắc mắc xin liên hệ thực nghiệm viên để hỗ trợ PHIẾU TRẢ LỜI Mã số người thử: Màu sắc: Ít ưa thích Hơi ưa thích Ngày: …./…./ 202 Ưa thích Ưa thích Mùi:Hãy xếp mẫu theo thứ tự từ ưa thích đến ưa thích Ít ưa thích Hơi ưa thích Ưa thích Ưa thích cách điền mã số mẫu vào thang phiếu đánh giá Ví dụ: Vị: Ưa thích Ít ưa thích Hơi ưa thích Ưa thích Độ xốp: Ít ưa thích Hơi ưa thích Ưa thích Ít ưa thích Xin cảm ơn bạn tham gia buổi đánh giá cảm quan! Hình PL2.6 Mẫu phiếu đánh giá cảm quan Ưa thích Ưa thích PL-13 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG LAB L5 PL-14 PL-15 PL-16 PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Bảng PL4.1 Tỉ lệ ức chế nấm L plantarum L5 sau ngày Môi trường Sau ngày (%) MRS 50,83a ± 3,15 SG0 51,67a ± 8,87 SG3 57,92a ± 1,44 SG7 56,67a ± 0,72 (Khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê theo cột, p