Tuyển chọn các chủng nấm mốc sinh enzym cellulase và ứng dụng trong công nghệ lên men cồn ssf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI o0o LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC SINH ENZYM CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ LÊN MEN CỒN SSF NGUYỄN THU HÀ HÀ NỘI - 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI o0o LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC SINH ENZYM CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ LÊN MEN CỒN SSF NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGUYỄN THU HÀ Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ NGUYÊN THÀNH HÀ NỘI - 2007 MỞ ĐẦU Năng lượng đóng vai trị quan trọng hoạt động sản xuất sinh sống người Những quan tâm đến phát triển lượng không thừa nhận thực vào năm 2025, giới thiếu hụt 50% lượng Các sản phẩm hóa dầu-dự trữ dầu mỏ dự đốn kéo dài đến 2050 Với mức tiêu thụ nay, than đá sử dụng cách tiết kiệm kéo dài 250 năm Như vậy, bối cảnh mà nguồn nhiên liệu hố thạch dần cạn kiệt, việc tìm kiếm nguồn nhiên liệu thay trở thành vấn đề cấp thiết toàn giới Tuy nhiên, thiếu hụt lượng không động lực thay đổi việc lựa chọn lượng Áp lực môi trường nhằm giảm ô nhiễm động vận tải nhà máy sử dụng nhiên liệu hoá thạch phát ra, tạo hiệu ứng nhà kính gần buộc phủ phải ban hành đạo luật hạn chế việc sử dụng nhiên liệu hoá thạch Chính vậy, nay, việc nghiên cứu phát triển ứng dụng loại nhiên liệu sạch, nhiên liệu sinh học đặc biệt cồn nhiên liệu nhiều nước giới Mỹ, Anh, Nhật, Brazil, Trung Quốc … quan tâm đẩy mạnh Hàng năm nước chi hàng tỷ đô la cho việc nghiên cứu đưa ứng dụng loại nhiên liệu vào thực tế Tổng thống Bush tuyên bố tham vọng nước Mỹ thay 75% lượng dầu nhập từ Trung Đông vào năm 2025 sử dụng cồn nhiên liệu để thay 30% lượng xăng dầu vào năm 2030 Trước tình hình này, Việt Nam bước đầu quan tâm, đầu tư nghiên cứu Điều đánh dấu việc ký kết hợp đồng xây dựng nhà máy sản xuất cồn với tập đoàn Itochu Nhật Bản vào tháng năm 2007 Với lợi nước nơng nghiệp Việt Nam hồn tồn ứng dụng công nghệ để sản xuất cồn từ sản phẩm nông nghiệp phế Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà phụ phẩm nông nghiệp Đặc biệt việc sản xuất cồn nhiên liệu từ loại phế thải nông nghiệp giải vấn đề nhiên liệu mà cịn xử lý tốt tốn môi trường cho quốc gia Tuy nhiên vấn đề mẻ Việt Nam Chính vậy, với mong muốn nghiên cứu ứng dụng hiệu việc sản xuất cồn nhiên liệu từ phế phụ phẩm nơng nghiệp đặc biệt từ bã mía phế thải ngành sản xuất mía đường, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzym cellulase ứng dụng công nghệ lên men cồn SSF” Nội dung nghiên cứu đề tài bao gồm: - Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzym cellulase - Khảo sát mơi trường phương pháp ni cấy nấm mốc thích hợp cho trình sản sinh enzym cellulase - Ứng dụng vào công nghệ lên men cồn SSF Đây nội dung nghiên cứu khuôn khổ đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ hệ thống thiết bị sản xuất cồn nhiên liệu từ phế phụ phẩm nông nghiệp” Bộ môn Vi sinh - Viện Công nghiệp Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 XU THẾ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHIỆP CỒN NHIÊN LIỆU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM Cồn dung môi quan trọng, sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác thực phẩm, dược phẩm, y tế số ngành công nghiệp (làm dung môi công nghệ sơn, vecni….) Hiện trước tình hình nguồn nhiên liệu hoá thạch (than đá dầu mỏ) dần cạn kiệt người quan tâm tới việc sản xuất sử dụng nguồn nhiên liệu sinh học (Bio-Fuel) để thay cho nguồn nhiên liệu hoá thạch Theo BP, tập đoàn dầu mỏ hàng đầu giới, trữ lượng dầu mỏ tồn cầu thăm dị tới năm 2003 khoảng 150 tỷ Mức tiêu thụ dầu mỏ toàn cầu vào thời điểm 3,6 tỷ tấn/năm Với mức độ gia tăng nhu cầu lượng tương đương với việc phát mỏ trữ lượng dầu mỏ tồn cầu cịn đủ cho nhân loại vòng thập kỉ tới Hơn việc sử dụng xăng dầu làm nhiên liệu thải vào khơng khí lượng lớn khí nhà kính (thành phần CO2) khói bụi hữu Hậu làm nhiệt độ khơng khí trái đất tăng lên 0.6-0.8°C, mực nước biển dâng cao 15-20cm, ô nhiễm môi trường Nếu không tâm hành động trái đất có nguy bị nóng lên thêm 2-3°C thiên tai, bão lũ, hạn hán bệnh tật hiểm nghèo xuất Chính lý cấp bách mà nhiều quốc gia giới kể nước có nguồn dầu khí lớn Mỹ, Brazin, Ấn Độ, Trung Quốc… tập đoàn lượng trọng nghiên cứu đưa vào ứng dụng loại nhiên liệu nhiên liệu sinh học để thay xăng dầu Một loại nhiên liệu sinh học đầu tư phát triển nhiên liệu cồn Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà Toàn giới năm 2002 sản xuất gần 33 triệu cồn, 70% dùng làm nhiên liệu phân bổ Châu Mỹ 65%, Châu Á 19%, Châu Âu 3%, lục địa khác 13% Brazil nước tiên phong sử dụng cồn thay xăng cách gần 40 năm Ở Mỹ đến có 20 nhà máy sản xuất cồn với công suất khoảng 13 triệu Ấn Độ nước dẫn đầu Châu Á sử dụng cồn làm nhiên liệu, phủ Ấn Độ dự kiến đầu tư khoảng tỷ USD để xây dựng nhà máy sản xuất cồn nhiên liệu Trung Quốc sử dụng cồn thay xăng thành phố lớn (Trịnh Châu, Lạc Dương, Cáp Nhĩ Tân, Hắc Long Giang, Triều Đơng) với nhà máy có cơng suất từ 200.000 - 800.000 tấn/năm Ở Đông Nam Á Thái Lan, Inđônêxia, Malayxia phát triển công nghệ sản xuất cồn dùng thay xăng Thái Lan thành lập ủy ban Cồn Quốc gia để nghiên cứu phát triển dạng nhiên liệu sinh học này, thay cho dầu diesel Năm 1981, có Pilot để sản xuất thực nghiệm cồn (99,5%), đến năm 1985 thiết lập số trạm phân phối dạng nhiên liệu sinh học Gasohol (thay xăng) Diesohol (thay diesel) ngoại ô Băngcốc Năm 2004, nước sản xuất 280.000 m3 cồn, đầu tư thêm 20 nhà máy để năm 2015 có 2,5 triệu m3 cồn dùng làm nhiên liệu Ở Việt Nam cồn sản xuất hầu hết sử dụng cho ngành công nghiệp đồ uống hoá chất Một số nhà máy sản xuất cồn với công suất lớn là: Công ty Rượu Hà Nội có cơng suất thiết kế 10 triệu lít cồn/năm Cơng ty Rượu Bình Tây (thành phố Hồ Chí Minh) với cơng suất thiết kế 20 triệu lít cồn/năm Ngồi nước có 26 doanh nghiệp Nhà nước tư nhân sản xuất rượu cồn địa phương như: Công ty Cổ phần Rượu Đồng Xuân (Phú Thọ) với công suất thiết kế 0,6 triệu lít cồn/năm, nhà máy cồn Tam Hiệp (Hà Tây), nhà máy Đường - Giấy - Rượu Hưng Nhân (Thái Bình) v.v Sản Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà lượng cồn vào năm 80 kỉ trước đạt 30 triệu lít/ năm Đến năm 2005 đạt khoảng 50 triệu lít/ năm Nhận thấy tầm quan trọng nguồn nhiên liệu sinh học an ninh lượng Quốc gia, ngày 09/3/2007 ngành dầu khí Việt nam ký kết hợp đồng hợp tác đầu tư xây dựng nhà máy sản xuất cồn từ sắn lát với Tập đoàn Itochu (Nhật Bản), khu đất 30 Khu Cơng Nghiệp Hiệp Phước Nhà máy có công suất 100.000 sản phẩm/năm với tổng mức đầu tư ban đầu khoảng 80-100 triệu USD Sản phẩm Cồn nhà máy pha chế với xăng thương phẩm theo tỷ lệ 10% cồn 90% xăng để tạo hỗn hợp nhiên liệu với tên gọi “Xăng E10” [1, 2, 19] 1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CỒN NHIÊN LIỆU Hai phương pháp để sản xuất cồn nhiên liệu phương pháp hydrat hoá etylen dầu mỏ xúc tác axit phương pháp sinh học thơng qua q trình lên men Trong đó, phương pháp sinh học phổ biến Nguyên tắc phương pháp sinh học hydrat cacbon nguyên liệu tinh bột cellulose phải thủy phân thành đường đơn, tiếp đến trình lên men đường thành rượu cuối trình chưng cất rượu thành cồn Tùy thuộc nguồn nguyên liệu sử dụng mà công đoạn thuỷ phân hydrat cacbon ban đầu có khác Có ba nguồn nguyên liệu để sản xuất cồn nguyên liệu chứa đường (nước mía ép, rỉ đường mía, rỉ đường củ cải…), nguyên liệu chứa tinh bột (ngô, khoai, sắn…) nguyên liệu chứa cellulose (rơm, rạ, thân ngô, bã mía …) [19] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 1.2.1 Cơng nghệ sản xuất cồn từ đường Đường mía nguyên liệu giàu saccaroza Brazil nước dẫn đầu sản xuất cồn nhiên liệu từ đường mía Hiện nay, Brazil có 60.000 đồn điền trồng mía với 6,5 triệu nhà máy sản xuất đường, cồn [18, 19] Công nghệ sản xuất cồn từ mía đơn giản nhất, mía sau ép dịch tiếp men giống lên men Tuy nhiên, mía cơng nghiệp quan trọng ngun liệu công nghiệp sản xuất đường sản lượng hạn chế Ngồi nước ép mía, rỉ đường - phụ phẩm công nghệ sản xuất đường, nguồn nguyên liệu sử dụng phổ biến để sản xuất cồn Rỉ đường thường chiếm từ 3-5% so với lượng mía đưa vào sản xuất tỷ lệ phụ thuộc vào chất lượng mía cơng nghệ sản xuất Trước đưa vào lên men, mật rỉ phải xử lý axit để loại bỏ tạp chất, cặn can xi, chất phi đường giúp cho trình lên men chưng cất sau thuận lợi Theo số liệu Tổng cơng ty mía đường Việt Nam, đến năm 2000 có 40 nhà máy đường vào hoạt động với tổng công suất khoảng 12 triệu mía Nếu tỷ lệ mật rỉ chiếm 3% nhà máy thải 420.000 Từ mật rỉ thu 300 lít cồn 100% (v/v) [3 ] 1.2.2 Công nghệ sản xuất cồn từ tinh bột - Thủy phân tinh bột: Nguyên liệu chứa tinh bột như: Ngô, khoai, sắn, gạo tấm, phải chuyển hoá thành đường lên men (glucose) nhờ hoạt động enzym λ amylaza β amylaza có sẵn hạt nảy mầm, tổng hợp từ vi sinh vật dạng enzym thương phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà - Lên men: Tiếp đến trình lên men nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae với phản ứng hóa học tổng quát sau: C6H12O6 → CH3CH2OH + 2CO2 + Q Thơng thường nấm men tích lũy khoảng 4-8% rượu dịch lên men, nồng độ rượu sản phẩm cuối tăng lên nhờ trình chưng cất - Chưng cất: Hiện nay, Việt nam công nghệ chưng cất cồn hoàn thiện với độ cồn lên tới 99% Việc tinh chế cồn 96% thành cồn tuyệt đối sử dụng rây phân tử nhiều nơi quan tâm nghiên cứu chuẩn bị đưa ứng dụng Có thể nói cơng nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường mía từ tinh bột hoàn thiện, nguồn nguyên liệu tinh bột đường mía sản phẩm nơng nghiệp quan trọng với số lượng hạn chế, nguồn nguyên liệu cellulose từ phế phụ phẩm nông nghiệp dồi chưa sử dụng Vì vậy, việc nghiên cứu, hồn thiện cơng nghệ sản xuất cồn từ nguồn ngun liệu cellulose có ý nghĩa thời điểm tương lai [3] 1.2.3 Công nghệ sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa cellulose Trong số nguồn nguyên liệu sinh học sử dụng cho sản xuất ethanol, nguyên liệu cellulose thực dồi khai thác Sản lượng sinh khối thực vật toàn cầu hàng năm vào khoảng 200 tỷ tấn, 90% số lignocellulose Có khoảng 8-20 tỷ thực tế sử dụng để sản xuất ethanol Sinh khối thực vật giàu lignocellulose nguyên liệu phức tạp nhiều so với tinh bột Thành phần chủ chốt chúng bao gồm cellulose, hemicellulose lignin gắn kết chặt chẽ với Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà liên kết hydro liên kết đồng hóa trị Để sản xuất ethanol, polymer sinh học cần phân huỷ thành đường đơn sau hỗn hợp đường hexose (chủ yếu glucose) pentose (chủ yếu xylose) lên men thành ethanol Việc thủy phân lignocellulose theo đường hóa học enzyme khơng đơn giản Ngồi ra, q trình thủy phân sử dụng axit (một công đoạn thiếu cơng nghệ có) cịn phân hủy lượng đáng kể đường tạo thành (tới 60% tùy theo chế độ thủy phân) sản sinh chất độc hại furfuran vi sinh vật công đoạn lên men Bản thân việc lên men đường xylose (chiếm 20-30% lượng đường tạo ra) thành ethanol gặp nhiều khó khăn có chủng vi sinh vật có khả thực cơng đoạn cách hiệu Công đoạn chủ chốt sản xuất cồn nhiên liệu từ biomass thủy phân nguyên liệu thành đường Hiện có hai hướng thủy phân thủy phân axit thủy phân enzym Công nghệ thủy phân axit có từ trước Đại chiến Thế giới lần thứ II không nghiên cứu nhiều cơng nghệ khơng có tính kinh tế cao Có hai dạng cơng nghệ thủy phân axit thủy phân axit đặc thủy phân axit loãng Trong năm gần đây, với nhiều thành tựu công nghệ sinh học, việc sản xuất enzym thương phẩm có bước tiến mạnh Các sản phẩm enzym đa dạng chủng loại với hoạt tính enzym cao Dẫn đầu lĩnh vực sản xuất enzym thương mại phải kể đến hãng Novo (Đan mạch) Một số ưu điểm công nghệ thủy phân enzym tốc độ phản ứng nhanh, điều kiện phản ứng đơn giản có tính chuyên hóa cao Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 64 Bảng 3.10 Phân nhóm chủng nấm mốc theo hoạt lực enzym Kí hiệu IU Chủng Trichoderma Chủng Aspergillus Tổng số chủng Nhóm 1÷5 12 15 Nhóm ÷ 10 10 Nhóm 10 ÷ 20 Nhóm 20 ÷ 30 - 10 10 Nhóm > 30 - 3 30 26 25 21.7 20 Trichoderma Aspergillus 15.2 15 10.8 10 6.5 6.5 6.5 6.5 0 Hình 3.4 Biểu đồ biễu diễn hoạt lực enzym chủng nấm mốc phân theo nhóm Qua biểu đồ ta thấy chủng nấm mốc Trichoderma tập trung chủ yếu nhóm (26%) nhóm (15.2%) nhóm có hoạt lực Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 65 enzym thấp từ ÷ 10 Ở nhóm có hoạt lực enzym cao từ 10 ÷ 30 (nhóm 3, nhóm 4) bao gồm chủ yếu chủng nấm mốc Aspergillus Ở nhóm nhóm có hoạt lực enzym > 30 có chủng nấm mốc Aspergillus chiếm 6.5% 3.6 PHÂN LOẠI BẰNG KỸ THUẬT FINGERPRINTING Trong tổng số 164 chủng nấm mốc, chúng tơi phân thành nhóm theo hoạt lực enzym Dựa vào việc quan sát hình thái, màu sắc bào tử nấm mốc hoạt lực enzym để chọn 16 chủng, từ sử dụng kĩ thuật fingerprinting để phát chủng giống 16 chủng lựa chọn Bảng 3.11 Danh sách 16 chủng fingerprinting TT Kí hiệu D-d (mm) IU FEC 130 25.3 34.513 FEC 94 25.5 30.969 FEC 74 25.0 30.428 FEC 110 22.8 28.493 FEC 114 25.7 26.815 FEC 98 24.0 25.451 FEC 57 23.3 22.856 FEC 53 23.1 19.742 FEC 93 25.6 19.403 10 FEC 105 25.0 19.017 11 FEC 95 26.6 18.988 12 FEC 156 22.9 16.803 13 FEC 147 19.4 7.828 14 FEC 128 21.1 7.157 15 FEC 158 21.9 6.150 16 FEC 102 17.0 5.408 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 66 Mồi sử dụng kĩ thuật fingerprinting MST1 Chu trình nhiệt thiết lập là: biến tính ban đầu 95ºC phút, 35 vịng lặp (biến tính 94ºC 40 giây, gắn mồi 55ºC 40 giây, pha kéo dài 72ºC phút), sau giữ 72ºC 10 phút, cuối trì 10ºC lúc lấy Sau kết thúc phản ứng, sản phẩm điện di gel agarose 1.5% dung dịch đệm 0.5x TBE với hiệu điện 50-100V Hình 3.5 Phổ fingerprinting sử dụng mồi MST1 Kí hiệu: (1) FEC 53 ; (2) FEC 57; (3) FEC 74; (4) FEC 93; (5) FEC 94; (6) FEC 95; (7) FEC 98; (8) FEC 102; (9) FEC 105; (10) FEC 110; (11) FEC 114; (12) FEC 128; (13) FEC 130; (14) FEC 147; ( 15) FEC 156; (16) FEC 158 Trước tiên nhận thấy kết chạy điện di sản phẩm PCR fingerprinting lên rõ ràng, điều chứng tỏ phương pháp tiến hành hợp lí ADN nhân tốt, kết đáng tin cậy Thang chuẩn đặt giếng M Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 67 Qua phổ PCR fingerprinting trên, nhận thấy: Phổ băng giếng 2;3;5;10 hoàn toàn giống Phổ băng giếng lại khác hoàn toàn chứng tỏ chủng nấm mốc mà phân lập khác đa dạng Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 68 3.7 ĐIỆN DI PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SDS-PAGE VÀ ZYMOGRAM CƠ CHẤT CMC Hình 3.6 Điện di protein theo SDS-PAGE ZYMOGRAM chất CMC 1-FEC35; 2-FEC37; 3-FEC53; 4-FEC57; 5-FEC74; 6-FEC93; 7-FEC94; 8-FEC95; 9-FEC98 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 69 Hình 3.7 Điện di protein theo SDS-PAGE ZYMOGRAM chất CMC 10-FEC102; 11-FEC105; 12-FEC110; 13-FEC114; 14-FEC128; 15-FEC130; 16-FEC147; 17-FEC156; 18-FEC158 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 70 Nhìn vào hai điện di ta thấy phổ băng giếng hoàn toàn khác biệt với phổ băng giếng khác Ở giếng 6, băng có màu đậm điện di SDS băng có hoạt tính cellulase Trong điện di SDS Zymogram, phổ băng giếng 4,5 hoàn toàn giống chứng tỏ hoạt tính cellulase chủng FEC57, FEC74 FEC94 Vì chọn chủng nấm mốc để đưa vào ứng dụng công nghệ lên men SSF chọn chủng khác biệt hình thái hoạt tính enzym 3.8 KIỂM TRA HOẠT TÍNH XYLANASE BẰNG CƠ CHẤT XYLAN Tiến hành làm gel thay Soluble CMC Soluble xylan phần Runing gel Kết điện di Hình 3.8 Điện di Zymogram chất xylan Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 71 1-FEC35; 2-FEC37; 3-FEC53; 4-FEC57; 5-FEC74; 6-FEC93; 7-FEC94; 8-FEC95; 9-FEC98 Hình 3.9 Điện di Zymogram chất xylan 10-FEC102; 11-FEC105; 12-FEC110; 13-FEC114; 14-FEC128; 15-FEC130; 16-FEC147; 17-FEC156; 18-FEC158 3.9 LÊN MEN SSF Mục đích trình lên men SSF để thử nghiệm xem liệu chủng nấm mốc mà phân lập tuyển chọn có thuỷ phân cellulose thành đường, từ lên men thu cồn hay khơng Thí nghiệm tiến hành với mẫu lên men có thành phần mục 2.2.10 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 72 Bảng 3.12 Kí hiệu mẫu lên men TT Kí hiệu Mẫu SSF Đối chứng (+) SSF Đối chứng (-), bổ sung sinh khối nấm mốc hấp SSF Đối chứng (-),khơng có bã mía xử lý SSF Test FEC 93 SSF Test FEC 93 xử lý SSF Test FEC 128 SSF Test FEC 128 xử lý SSF Test FEC 130 SSF Test FEC 130 xử lý 10 SSF 10 Test FEC 147 11 SSF 11 Test FEC 147 xử lý 12 SSF 12 Test FEC 156 13 SSF 13 Test FEC 156 xử lý 14 SSF 14 Phối hợp a 15 SSF 15 Phối hợp a xử lý 16 SSF 16 Phối hợp b 17 SSF 17 Phối hợp b xử lý 18 SSF 18 Phối hợp c 19 SSF 19 Phối hợp c xử lý 20 SSF 20 Phối hợp d 21 SSF 21 Phối hợp d xử lý 22 SSF 22 Phối hợp e 23 SSF 23 Phối hợp e xử lý 24 SSF 24 Phối hợp f xử lý Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 73 Kết lên men sau Bảng 3.13 Hàm lượng cồn mẫu sau lên men TT Kí hiệu mẫu Độ cồn (%v/v) Nước cất SSF 2.37 SSF SSF SSF 0.56 SSF 0.60 SSF 0.75 SSF 0.85 SSF 0.85 SSF 1.05 10 SSF 10 0.52 11 SSF 11 0.62 12 SSF 12 0.45 13 SSF 13 0.42 14 SSF 14 0.85 15 SSF 15 1.16 16 SSF 16 2.27 17 SSF 17 2.35 18 SSF 18 0.85 19 SSF 19 1.22 20 SSF 20 1.05 21 SSF 21 1.16 22 SSF 22 2.04 23 SSF 23 2.15 24 SSF 24 0.62 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 74 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu rút kết luận sau: Phân lập tuyển chọn đuợc chủng nấm mốc thuộc chi Trichoderma Aspergillus Chọn môi trường nuôi cấy nấm mốc thích hợp cho việc sản sinh enzym cellulase: Bã mía khơ 1.5g Cám gạo 3.5g Mandel x1 5ml Xác định hoạt tính enzym chủng nấm mốc theo phương pháp đục lỗ đĩa thạch phương pháp xác định đường khử SomogyNelson Kiểm tra hoạt tính emzym cellulase xylanase điện di Zymogram chất CMC Xylan Ứng dụng vào công nghệ sản xuất cồn nhiên liệu theo phương pháp lên men đồng thời SSF thu độ cồn cao 2.35 độ cồn Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Định (2003), Bio-Fuel : Cồn, nguồn nhiên liệu tương lai Khoa học công nghệ số 1-2/2003, trang 78 Vũ Nguyên Thành (2006) Thuyết minh đề tài nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ : Nghiên cứu công nghệ hệ thống thiết bị sản xuất cồn nhiên liệu từ phế phụ phẩm nông nghiệp (biomass).Viện Cơng nghiệp Thực phẩm Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng (2005), Công nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylic Nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Duy Hạng, Lê Xuân Thám (2000), Tăng cường chất lượng bã mía làm thức ăn gia súc phương pháp lên men sinh học Phòng sinh học viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh (2004), Công nghệ enzym Nhà xuất khoa học kĩ thuật Nguyễn Văn Ri (2004), Chuyên đề phương pháp tách chất Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Lê Ngọc Tú (2000), Hố sinh cơng nghiệp, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần thị Luyến (1998), Công nghệ enzym Nhà xuất nông nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh Lê văn Nhương, Nguyễn Chúc, Nguyễn Đức Lượng, Nghiên cứu thu nhận ứng dụng enzym vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 76 10 Võ Hồng Nhân, Trần Tuấn Đức, Thuỷ phân vỏ chuối enzym cellulase, Tạp chí khoa học cơng nghệ 1993 11 Đặng Văn Lợi, Lê Văn Hoàng (1999), Tối ưu hố q trình sinh tổng hợp enzym amylase cellulase A niger, Nông nghiệp Công nghiệp Thực phẩm 12 Hà Vân Linh, Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Khảo sát hoạt tính hệ enzym thủy phân chiết tách từ môi trường nuôi cấy Trichoderma sp thử ứng dụng chế biến phân hữu vi sinh, Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ ĐHQG TP.HCM, tập 6, tháng 02/2003 Tiếng Anh 13 Beatriz Rivas, Ana B Moldes, Jose M Dominguez, Juan C Parajor (2004), Lactic acid production from corn cobs by simutaneous saccharification and fermentation: a mathematical intepretation Department of Chemical Engineering, University of Vigol, Polytechnical Building, University Campus, As Lagoas, 32004 Ourense Spain 13 H.K.Manonmani and KR Sreekantiah (1997), Saccharification of sugar cane bagass with enzym from Aspergillus ustus and Trichoderma viride, Central Food Technological Research Institute, India 14 Malek Alkasrawi, Torny Eriksson, Johan Borjesson, Anders Winger, Mats Gralbe, Folke Tjerneldm Guido Zacchi (2003), The effect of Tween -20 on simultanous saccharification and fermentation of softwood to ethanol Department of Chemical Engineering and Department of Biochemistry, Lund University, Sweden Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 77 15 Michael W Davidson (2006), Plant cell wall National High Magnetic Field Laboratory 16 Neureiter M, Danner H, Thomasser C, Saidi B, Braun R (2002), Dilute-acid hydrolysis of sugarcane bagasse at varying conditions Appl Biochem Biotechnol, 98-100:49-58 17 Norton Nelson (1944), A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose The journal of Biological Chemistry 153:375-380 18 Novozymes (2002), Special Food Product Sheet Denmark 19 Pessoa-Jr A, Roberto IC, Menossi M, Dos Santo RR, Filho SO, Penna TC (2005), Perspectives on bioenergy and biotechnology in Brazil Appl Biochem Biotechnol, 121-124: 59-70 20 Sheehan, J.J (1994), Enzymatic Conversion of Biomass fỏ Fuels Production,Himmel, M E., Baker, J O., and Overend, R P., eds.,American Chemical Society, Washington, DC, pp 1–52 21 http://www1.eere.energy.gov/biomass/ 22 http://en.wikipedia.org/wiki/Cell-wall/ Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà 78 TÓM TẮT LUẬN VĂN Cồn dung mơi quan trọng sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác thực phẩm, dược phẩm, y tế số ngành công nghiệp (làm dung môi công nghệ sơn, vecni….) Trong số nguồn nguyên liệu sinh học sử dụng cho sản xuất cồn nhiên liệu, nguyên liệu cellulose thực dồi khai thác Hơn công đoạn chủ chốt sản xuất cồn nhiên liệu từ sinh khối thực vật thuỷ phân nguyên liệu thành đường Có hai hướng tiếp cận vấn đề này, thơng qua thủy phân axit thủy phân enzyme Hiện công nghệ thủy phân axit không nghiên cứu nhiều tương đối ổn định khó hạ giá thành Còn hướng ứng dụng enzym sản xuất ethanol từ sinh khối nghiên cứu nhiều hứa hẹn đem lại đột phá cơng nghệ Trong số vi sinh vật có khả thuỷ phân nguyên liệu thực vật, chủng nấm mốc Trichoderma Aspergillus quan tâm nhiều Chính mà khn khổ luận văn tiến hành phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh enzym cellulase Nghiên cứu sơ môi trường phương pháp nuôi cấy thích hợp để thu sinh khối nấm mốc cho hoạt tính enzym cao Qua tiến hành thử ứng dụng chủng nấm mốc công nghệ lên men cồn SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation), cơng nghệ kết hợp hai q trình đường hố lên men cơng đoạn Từ khố: Biomass, Cellulase, Trichoderma, Aspergillus, enzym Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI o0o LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC SINH ENZYM CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ LÊN MEN CỒN SSF. .. cellulase ứng dụng công nghệ lên men cồn SSF? ?? Nội dung nghiên cứu đề tài bao gồm: - Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzym cellulase - Khảo sát môi trường phương pháp ni cấy nấm mốc thích hợp... cho q trình sản sinh enzym cellulase - Ứng dụng vào công nghệ lên men cồn SSF Đây nội dung nghiên cứu khuôn khổ đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ hệ thống thiết bị sản xuất cồn nhiên liệu