♣ Kiểm tra hoạt lực enzym bằng phương pháp đục lỗ
Hoạt lực enzym cellulase được đánh giá trên cơ sở mức độ thủy phân cellulose dưới tác dụng của enzym thông qua độ lớn của vòng thủy phân. Enzym cellulase thủy phân CMC (cacboxyl methyl cellulose) trong môi trường thạch đĩa tạo thành vòng thủy phân trong suốt bao quanh lỗ được nhỏ enzym. Dựa vào hiệu số giữa đường kính vịng thủy phân (D) với đường kính của lỗ đục (d), từ đó ta xác định được hoạt lực của enzym cellulase.
Mơi trường đục lỗ thử hoạt tính enzym có thành phần gồm 0.5% CMC pha trong đệm Na-acetate 0.1M pH 5; 2% agar. Đun nóng mơi trường rồi đổ 60ml vào đĩa petri vng. Sau khi đổ đĩa thì dùng đục lỗ số 4 để đục lỗ (đưịng kính lỗ là 8mm). Nhỏ vào lỗ 0.05ml dịch enzym thô, 2 lỗ đối chứng mỗi lỗ nhỏ 0.05 ml enzym cellulast 1% và enzym của chủng 45a, ủ đĩa ở 50°C trong 24 giờ để enzym tác dụng với cơ chất. Sau đó lấy ra cho 15ml congored 0.1% vào và ngâm trong 30 phút. Đổ congored đi, rửa lại bằng nước muối NaCl 1M, đo vòng thủy phân trong suốt bao quanh lỗ.
♣ Xác định hoạt lực enzym dựa trên phân tích đường khử theo phương pháp Somogy - Nelson
Somogy - Nelson là phương pháp được sử dụng rộng rãi đểđịnh lượng đường khử do có ưu điểm là độ nhạy rất cao. Nền tảng của phương pháp này là đường khử bị oxy hóa bởi Cu2+ trong mơi trường kiềm, sau đó Cu2O tạo ra sẽ khử phức chất arsenomolybdate để tạo thành sản phẩm có màu xanh. Lượng đường khử có trong dung dịch sẽ được xác định gián tiếp qua lượng phức tạo thành.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà
36
CO32- + H2O --- > HCO3 + OH- HCO3- + H2O --- > H2CO3 + OH-
RCHO + Cu2+ + OH- --- > RCOOH + Cu2O + H2O Cu2O + H2SO4 --- > Cu2SO4 + H2O
2Cu+ + MoO42- --- > Cu2+ + Molybdenum blue
Phương pháp phân tích
Cho 0.5ml dịch chiết enzym thơ vào ống nghiệm có chứa 0.5ml CMC 1% pha trong đệm Na-acetate 0.1M pH 5. Tiến hành phản ứng ở 50ºC trong 180 phút. Thêm 1ml dung dịch Somogy I vào và đun sơi trong 10 phút, sau đó làm lạnh ngay bằng nước đá. Thêm 1ml dung dịch Somogy II vào, vontex đều, bổ sung 6ml nước cất, vontex và đem ly tâm 12000rpm trong 5 phút. Mẫu sau khi ly tâm thì tiến hành đo Abs ở bước sóng 760nm.
Mẫu đối chứng thì thay enzym thơ và CMC 1% bằng 1ml dung dịch đệm Na-acetate 0.1M.
Mẫu trước phản ứng thì thay CMC 1% bằng 0.5ml đệm Na-acetate 0.1M.
Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị dung dịch Glucose 10 mg/ml, dùng dung dịch Na-acetate làm dung mơi pha lỗng. Từ đó pha tiếp thành các dung dịch glucose với các nồng độ khác nhau như sau: 0.01; 0.05; 0.1; 0.15; 0.2; 0.25; 0.3; 0.35; 0.4 mg/ml
Tiến hành xây dựng đường chuẩn. Cho 1ml dung dịch Somogy I vào ống nghiệm có chứa 1ml dung dịch đường. Sau đó đun sơi trong 10 phút và làm lạnh ngay bằng nước đá. Thêm 1ml dung dịch Somogy II vào, vontex đều, bổ sung 6ml nước cất, vontex và đem ly tâm 12000rpm trong 5 phút. Mẫu sau khi ly tâm thì tiến hành đo Abs ở bước sóng 760nm.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà
37
Mẫu đối chứng thì thay 1ml dung dịch đường bằng 1ml dung dịch đệm Na-acetate 0.1M
Bảng 2.3 Abs của dung dịch Glucose ở các nồng độ khác nhau đo tại bước sóng 760nm
C (mg/ml) 0 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 Abs 0 0,176 0,929 1,783 2,591 3,174 4,15 4,646 5,05 5,27 y = 14,814x R2 = 0,9722 0 1 2 3 4 5 6 7 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 Nồng độ glucose (mg/ml) Ab s
Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn Glucose
Phương trình đường chuẩn: y = Abs = ax Lượng đường khử: x (mg/ml) = a y · E x (µmol) = 18 , 0 . a y · E Hoạt lực enzym: IU = (x1- x0). E . min-1 . ml-1
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà
38 = (y1 - y0) · 5 , 0 . 180 . 18 , 0 . a E Trong đó :
x0: Đường khử của mẫu trước phản ứng, µmol x1: Đường khử của mẫu sau phản ứng, µmol
y0: Chỉ số Abs của mẫu trước phản ứng y1: Chỉ số Abs của mẫu sau phản ứng E: Độ pha loãng tổng