Chuẩn bị mẫu chạy điện di
Mẫu chiết enzyme thô được ly tâm 10000rpm/5phút/2 lần sau đó đem cơ đặc chân khơng trong ống eppendorf. Hịa tan mẫu trong loading buffer với lượng thích hợp (2:1). Lắc đều và đun 4 phút ở 100°C (để giãn mạch protein). Sau đó ly tâm 10000rpm trong 30 giây. Mẫu chuẩn bị xong phải điện di ngay, hoặc để không quá 2 giờ ở 2°C.
PHƯƠNG PHÁPĐIỆN DI SDS-PAGE .
- Nguyên tắc: Dựa trên q trình dịch chuyển của các phân tử protein tích điện trong một dung dịch đặt trong điện trường, do vận tốc dịch chuyển của các phân tử mang điện phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của phân tử. - Phương pháp tiến hành *Running gel 10% Distilled water 3ml 30% Acrylamite 2,5ml 1,5M Tris-HCl (pH=8,8) 1,9ml 10% SDS 80µl 30% APS 15µl Temed 15µl
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà
41 *Stacking gel 5% Distilled water 1,385ml 30% Acrylamite 0,415ml 1M Tris-HCl (pH=6,8) 0,62ml 10% SDS 25µl 30% APS 7,5µl Temed 7,5µl
*Load 15µl mẫu . Chạy 70-100V trong 3 giờ
Sau khi kết thúc chạy gel thì tiến hành nhuộm gel như sau:
- Nhuộm gel trong 100 ml Comasin brilliant blue (CBB) ở 50ºC trong 1h hoặc lâu hơn để CBB bắt màu với protein
- Ngâm gel trong dung dịch Destain I ở 50ºC/30 phút, lặp lại 2 lần mỗi lần 100ml
- Ngâm gel trong 200ml dung dịch Destain II ở nhiệt độ thường, kèm theo lắcđến khi thấy rõ các vạch màu xanh thì dừng.
PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI ZYMOGRAM
- Nguyên tắc: Đây là phương pháp điện di dùng để kiểm tra hoạt tính cellulase và xylanase của enzym. Phương pháp này dựa trên sự không bắt màu của Congo red đối với các enzym có phảnứng với cơ chất, nghĩa là enzym nào có phảnứng với cơ chất CMC hoặc xylan thì sẽ khơng bắt màu khi ta nhuộm bản gel trong Congo red, từ đó sẽ tạo nên các băng có màu sáng hơn màu nền của gel.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà
42 - Phương pháp tiến hành: *Running gel 10% Soluble xylan 3ml (0.03g CMC in 3ml distilled water) 30% Acrylamite 2,5ml 1,5M Tris-HCl (pH=8,8) 1,9ml 10% SDS 80µl 30% APS 15µl Temed 15µl *Stacking gel 5% Distilled water 1,385ml 30% Acrylamite 0,415ml 1M Tris-HCl (pH=6,8) 0,62ml 10% SDS 25µl 30% APS 7,5µl Temed 7,5µl
* Load 15-20µl mẫu . Chạy 70-100 V/2-4h
Sau khi kết thúc running gel thì tiến hành nhuộm gel như sau: - Ngâm gel trong 100 ml Trixton x2%, lắc 30phút (làm 2 lần). - Ngâm gel trong 100 ml PB lạnh 0,1M, lắc 15 phút (làm 2 lần ) - Ngâm gel trong 100 ml PB ấm 0,1M trong 1h-12h/50OC
- Nhuộm gel trong 100ml Congo red 0,1%, lắc 30phút (bắt màu phản ứng) - Cố định màu bằng cách rửa gel trong 200ml NaCl 1M, rửa 2 lần, mỗi lần 15 phút.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thu Hà
43