(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu tạo dòng thuốc lá (nicotiana tabacum l ) mang gen gmdreb2 phận lập từ cây đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) MANG GEN GmDREB2 PHẬN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.Vũ Thị Thu Thuỷ Thái Nguyên, năm 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Vũ Thị Thu Thủy, giúp đỡ thầy cô giáo, cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại Khoa Sinh học– Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên Các số liệu nêu luận văn trung thực Các kết chưa công bố cơng trình khác Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu luận án Thái Nguyên, tháng 11 năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Phương Thảo XÁC NHẬN XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Vũ Thị Thu Thủy Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN i http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thu Thủy định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt suốt q trình tơi tiến hành nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện để tơi hồn thành Bản luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng - KTV phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập, thực thí nghiệm đề tài Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới bạn bè tồn thể gia đình động viên, khuyến khích, giúp đỡ tơi, ln quan tâm chỗ dựa cho tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Thái Nguyên, tháng 11 năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Phương Thảo Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ii http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây thuốc hệ thống tái sinh thuốc 1.1.1 Cây thuốc 1.1.2 Hệ thống tái sinh chuyển gen thuốc 1.2 Tính chịu hạn gen liên quan đến tính chịu hạn thực vật 1.2.1 Hạn tác hại hạn lên thực vật 1.2.2 Đặc tính chịu hạn thực vật 1.2.3 Gen liên quan đến tính chịu hạn 10 1.2.4 Gen DREB gen DREB2 12 1.3 Phương pháp tạo trồng chuyển gen 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vâ ̣t liê ̣u hoá chấ t và thiế t bi 26 ̣ 2.1.1 Vật liệu 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị 26 2.1.4 Điạ điể m nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp tạo nguyên liệu biến nạp 27 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN iii http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua A tumefaciens 27 2.2.3 Phân tích có mặt cấu trúc mang gen GmDREB2 phương pháp PCR 29 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết tạo nguyên liệu biến nạp 32 3.2 Kế t quả chuyể n vector mang cấu trúc GmDREB2 vào thuố c lá 33 3.2.1 Đồng nuôi cấy với dung dịch A tumefaciens cảm ứng tạo cu ̣m chồi 34 3.2.2 Tạo rễ chuyển môi trường tự nhiên 37 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen chuyển dòng thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN iv http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ABA Abscisic acid AS Acetosyringone A.tumefacines Agrobacterium tumefacines BAP 6-Benzyl Amino Purine bp Base pair (cặp base) DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleic triphosphate DREB Dehydration Responsive Binding protein ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3 butyric acid LB Luira and Bertani LEA Late Embryogenesis Abundant MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction RM Môi trường rễ TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Ti-plasmid Plasmid tạo khối u Vir Virulence region Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN iv http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm chiết DNA tổng số 29 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của că ̣p mồ i PCR khuế ch đa ̣i đoa ̣n GmDREB2 30 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GmDREB2 31 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen GmDREB2 31 Bảng 3.1 Kết cảm ứng chồi từ mảnh thuốc 36 Bảng 3.2 Kế t quả tạo rễ tái sinh thuốc thí nghiệm đối chứng 38 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN v http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây thuốc giai đoạn trưởng thành giai đoạn hoa Hình 1.2 Cấu trúc Ti - Plasmid 22 Hình 1.3 Mơ hình chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens 23 Hình 3.1 Tạo nguyên liệu biến nạp 32 Hình 3.2 Vùng T-DNA vector pBI121 - GmDREB2 33 Hình 3.3 Hình ảnh nhiễm khuẩn mẫu đồng ni cấy 35 Hình 3.5 Hình ảnh tạo rễ môi trường kháng sinh chọn lọc 38 Hình 3.6 Các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế ̣ T0 trồ ng châ ̣u nhà lưới 39 Hình 3.7 Kế t quả điện di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân đoa ̣n GmDREB2 từ 17 dòng thuốc chuyể n gen 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN vi http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Một tượng thay đổi môi trường ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển thực vật tình trạng hạn Hạn hán có ảnh hưởng xấu mức độ khác suốt trình hay giai đoạn sống thể thực vật dẫn đến làm giảm suất trồng, chậm phát triển gây chết Hiện giới diện tích đất nơng nghiệp bị hạn hán ngày tăng Ở Việt Nam tình trạng hạn hán trở nên báo động năm 2015, diện tích đất nơng nghiệp khơng có nước để sản xuất tăng cao Khả chịu hạn thực vật tính trạng nhiều gen quy định Hiện nay, người ta chưa tìm gen cụ thể thực định tính chịu hạn, mà xác định gen liên quan đến tính chịu hạn thực vật Nhiều trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn đậu tương công bố Ngân hàng gen Quốc tế, có gen DREB DREB (Dehydration Responsive Element Binding) họ gen sản xuất protein kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn thực vật Việc nghiên cứu gen DREB2 liên quan đến tính chịu hạn cho thấy nhóm gen đa dạng cấu trúc, chức tác giả khuyến cáo cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu Hiện nay, nhờ tiến kỹ thuật di truyền mà người ta tạo giống trồng có khả chịu hạn cách lai giống, đột biến thực nghiệm, công nghệ tế bào, chuyển gen Chọn tạo giống trồng thực nhiều phương pháp khác chọn dòng biến dị soma, lai giống, gây đột biến thực nghiệm, sử dụng công nghệ tế bào chuyển gen Đã có nhiều giống trồng chọn tạo giống lúa chịu hạn tác giả Đinh Thị Phịng [17], dịng lúa chịu nóng Nguyễn Thị Tâm [19] Các dòng lạc chịu hạn tạo cách gây đột biến Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com thực nghiệm- tác giả Vũ Thị Thu Thủy [23] Chuyển gen kỹ thuật cho phép đưa hay số gen định vào hệ gen chủ quan tâm để tạo trồng biến đổi gen nhằm cải thiện số đặc tính hay tính trạng theo hướng có lợi cho người Chuyển gen hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, tiến hành thực nghiệm nhiều giống trồng như: cà chua, lúa, ngô, đậu tương áp dụng nhiều nước giới Trong chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacines (A.tumefacines) tỏ ưu cá kỹ thuật chuyển gen khác tốn kém, quy trình đơn giản, nhanh chóng, dễ áp dụng nhiều đối tượng trồng Do hệ thống tái sinh thuốc tương đối đơn giản thời gian phân hóa từ mơ thành hoàn chỉnh ngắn nên nghiên cứu chuyển gen nhà khoa học thường chọn thuốc làm mơ hình Xuất phát từ sở lựa chọn tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng thuốc (Nicotiana tabacum L.) mang gen GmDREB2 phận lập từ đậu tương” Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng thuốc chuyển gen mang gen GmDREB2 phân lập từ đậu tương Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu tạo nguyên liệu biến nạp từ thuốc giống K326 (2) Nghiên cứu lây nhiễm A tumefaciens mang vector chuyển gen vào mảnh thuốc Tái sinh in vitro, chọn lọc tạo dòng thuốc chuyển gen (3) Phân tích có mặt gen chuyển dòng chuyển gen hệ T0 kỹ thuật PCR Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com ... ? ?Nghiên cứu tạo dòng thuốc (Nicotiana tabacum L. ) mang gen GmDREB2 phận l? ??p từ đậu tương? ?? Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng thuốc chuyển gen mang gen GmDREB2 phân l? ??p từ đậu tương Nội dung nghiên cứu. .. cứu ( 1) Nghiên cứu tạo nguyên liệu biến nạp từ thuốc giống K326 ( 2) Nghiên cứu l? ?y nhiễm A tumefaciens mang vector chuyển gen vào mảnh thuốc Tái sinh in vitro, chọn l? ??c tạo dòng thuốc chuyển gen. .. thẩm thấu (iii) Các gen liên quan đến phát triển rễ Một số gen nghiên cứu nhiều năm gần l? ?: LEA, P5CS, NCED, PLD [32],[40],[46] Gen LEA (Late Embryogenesis Abundant) nhóm gen liên quan tới nước