Hạt thuốc lá được cho vào bình pyrex (dung tích 100ml). Bình pyrex mở hé 1/3 nắp lọ đặt bên cạnh cốc thủy tinh chứa dung dịch Clo. Bổ sung vào cốc đựng Javen 3ml HCl, hỗn hợp này sẽ tạo ra khí Clo có tác dụng khử trùng hạt thuốc lá. Đậy kín bình khử trùng và dán parafin.
Sau 4 giờ lấy hạt đã khử trùng rồi tiến hành gieo hạt trên môi trường MS cơ bản (MS0) gồm: MS1 (20ml/l) + MS 2 (20ml/l) + MS 3 (5ml/l) + MS 4
(5ml/l) + MS5 (5ml/l), có bổ sung aga (10g/l) + sucrose (30g/l).
Lá bánh tẻ ở các cây con khỏe mạnh có 3-4 lá thật được dùng để chuyển gen. Sử dụng dao cắt bốn cạnh mép lá để gây tổn thương tạo thành mảnh nhỏ, có hình vuông 1cm2 (cắt bỏ đường gân giữa của lá). Lá bị tổn thương được đặt úp cảm ứng trên môi trường 150ml (MS0 + aga 10g/l + sucrose 30g/l + 1BAP) trong 2 ngày [26], [27].
2.2.2. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens
Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 20ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc (rifamycine 0,025g/l, kanamycine 0,05g/l) với chủng A. tumefaciens CV58C1 mang cấu trúc
pBI1221/GmDREB2. Nuôi trong tủ lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 16 giờ. Sau 16 giờ nuôi phục hồi khuẩn trong môi trường không kháng sinh, bổ sung thêm 20ml. LB lỏng đem nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 2 - 3giờ.
Lấy khoảng 1,5 – 2,0 ml dịch khuẩn và môi trường LB lỏng dùng để nuôi khuẩn như trên đo OD nếu OD600nm đạt 0.6 - 0.8, đủ điều kiện để biến nạp vào mảnh lá thuốc lá.
Ly tâm 5.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, bỏ dịch nổi, thu sinh khối lắng rồi hoà thành dịch huyền phù tế bào trong 40ml (1/2MS0 + 80µl AS).
2.2.3. Biến nạp
Sau 48 giờ cảm ứng, các mẫu lá đươ ̣c ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có nồng độ OD600nm đạt 0,6 – 0,8 có lắc nhẹ trong thời gian 30 phút. Sau đó, mẫu được đặt ngửa lên môi trường đồng nuôi cấy GM có bổ sung 200µl AS (thành phần GM gồm MS0 + aga 10g/l + sucrose 30g/l +BAP 1mg/l). Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 48 giờ.
2.2.4. Tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen
Sau thời gian đồng nuôi cấy, ngâm và lắc các mảnh lá biến nạp trong dung dịch 1/2MS0 có bổ sung cefotaxime (0,4g/l) trong 10 đến 20 phút. Thấm khô 2 mặt các mảnh lá, chuyển sang môi trường GM có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycine 0,05g/l, cefortaxime 0,4g/l để tái sinh.
Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình/cụm sau thời gian 4- 5 tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi của giống thuốc lá. Các cụm chồi được cắt chuyển sang môi trường kéo dài chồi MS0 có bổ sung: aga 10g/l, sucrose 30g/l, kanamycine 0,05g/l và cefotaxime 0,4g/l.
Tạo rễ và cây hoàn chỉnh
Khi các chồi đạt chiều cao từ 2-3cm, chọn những cụm phân hóa mạnh sau đó tách những chồi độc lập cấy chuyển sang môi trường ra rễ RM (MS0 + aga
10g/l + sucrose 30g/l + IBA 1mg/l + kanamycine 0,05g/l + cefotaxime 0,4mg/l).
Khi cây in vitro có 3-4 lá, có bộ rễ đảm bảo (thường sau 2 tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây được lấy ra khỏi bình nuôi cấy một cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây được trồng trên bầu trấu và cát có tỷ lệ 1 : 1.
Cây con 4 - 5 lá thật được đưa ra trồng trên chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lưới.
2.2.3. Phân tích sự có mặt của cấu trúc mang gen GmDREB2 bằng phương pháp PCR
Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số từ các mẫu lá non được tách chiết theo phương pháp của Saghai và cộng sự (1984) với thành phần đệm chiết ở bảng 2.2.
Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm chiết DNA tổng số
STT Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng 1 Tris-HCl 1M, pH 8 100 mM 2 NaCl 5M 1,4M 3 EDTA 0,5M, PH 8 50 mM 4 CTAB 2% (w/v) 5 Nước khử ion Các bước tiến hành:
(1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl dung dịch đệm tách, đảo đều và ủ ở 65oC trong 90 phút.
(2) Bổ sung 700µl hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút.
(3) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống eppendorf khác, bổ sung 500 µl isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút.
(4) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó rửa tủa bằng cồn 70oC.
(5) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA trong nước khử ion vô trùng và bảo quản ở -20oC.
Khuếch đại đoạn gen GmDREB2
DNA tổng số tách chiết từ lá thuốc lá được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sử có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0%.
Khuếch đại đoạn gen GmDREB2 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc
hiệu GmDREB2 soyF và GmDREB2 soyR được tổng hợp bởi hãng Bioneer có trình tự nucleotide thể hiê ̣n ở bảng 2.3.
Bả ng 2.2. Trình tự nucleotide của cặp mồi PCR khuếch đa ̣i đoa ̣n gen GmDREB2
Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide
GmDREB2 soyF 5’- ATGGAAGAAGCGGGTTTAG-3’ GmDREB2 soyR 5’- CTAATCTTCAGGTTTGGGATAC-3’
Thành phần phản ứng PCR nhân bản đoa ̣n gen GmDREB2 được trình bày ở bảng 2.4.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GmDREB2 STT Thành phần Thể tích (xl) (µl) 1 Nước khử ion 12,5 2 Master Mix 7,5 3 DREB2 soyF 2 4 DREB2 soyR 2 5 cDNA 1 Tổng Tổng thể tích 25µl
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen GmDREB2
Bước Phản ứng Nhiệt độ
(0C)
Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 95 4 phút 1
2 Biến tính 95 30 giây
30
3 Gắn mồi 57 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 45 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 7 phút 1
6 Kết thúc phản ứng
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Trong nghiên cứ u này chúng tôi tiến hành nuôi cấy in vitro cây thuố c lá để ta ̣o nguyên liê ̣u cho chuyển gen. Khi ta ̣o đủ nguyên liê ̣u, các mảnh lá thuốc lá đươ ̣c sử du ̣ng để biến na ̣p cấu trúc GmDREB2 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và tái sinh ta ̣o cây chuyển gen. Phân tích các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật sinh ho ̣c phân tử.
3.1. Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp
Hạt thuốc lá sau khi khử trùng được gieo trên môi trường MS cơ bản, sau 4 ngày hạt bắt đầu nảy mầm. Theo Banerjee và cộng sự [31], mảnh lá bánh tẻ là nguyên liệu thích hợp để chuyển gen vào cây thuốc lá. Để tạo nguồn nguyên liệu, hạt thuốc lá giống K326 được khử trùng bằng khí Clo trước khi gieo lên môi trường MS để nảy mầm trong điều kiện vô trùng. Theo Phạm Thị Vân và cs [25], [26] có thể sử dụng dung dịch javel thương phẩm nồng độ 30% để loại nấm mốc và vi khuẩn trên hạt thuốc lá. Phương pháp này đạt hiệu quả khử trùng 100% cho tỉ lệ nảy mầm cao trên 90%. Tuy nhiên, đối với hạt có có kích thước nhỏ như hạt thuốc lá, việc lắc rửa nhiều lần làm mất nhiều thời gian và giảm đi một số lượng đáng kể hạt. Trong thí nghiệm này, hạt thuốc lá K326 được khử trùng bằng khí Clo theo phương pháp của Topping (1998) [74] nguồn khí Clo tạo ra từ phản ứng giữa dung dịch HCl và javel sẽ khử trùng bề mặt các hạt thuốc lá.
A B
C D E Hình 3.1. Tạo nguyên liệu biến nạp
Cây thuốc lá K326 sau 4 tuần trên môi trường MS (hình 3.1A, 3.1B) Lá thuốc lá có kích thước 4-6cm (hình 3.1 C)
Mảnh lá thuốc lá có kích thước 1cm2 (hình 3.1D) Mảnh lá trên môi trường GM (hình 3.1E)
Các cây con sau khoảng 4 tuần trên môi trường MS có kích thước lá từ 4-6 cm là nguồn nguyên liệu tốt nhất để tái sinh và chuyển gen ở cây thuốc lá.
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 đã được Phạm Thị Vân và cs thiết lập [25], [26]. Theo quy trình này, các mảnh lá bánh tẻ được cắt thành những mảnh có kích thước 1cm2 và đặt lên môi trường cảm ứng GM (MS0, BAP 1mg/l, sucrose 30g/l, 10g/l agar, pH5,8) 2 ngày trước khi biến nạp
3.2. Kết quả chuyển vector pBI121-GmDREB2 vào thuốc lá
Plasmid pBI121 là một dạng Ti-plasmid trong Agrobacterium tumefacines đã được cải tiến bằng cách loại bỏ gen gây độc và gắn vào gen kháng kháng sinh để chọn lọc phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật. pBI121 có kích thước 13,0 kb.
Vector chuyển gen thực vật pBI121-GmDREB2 do Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, khoa Sinh học cung cấp (Hình 3.2).
Hình 3.2. Vùng T-DNA của vector pBI121 - GmDREB2
Theo sơ đồ hình 3.2, các vị trí trên T-DNA gồm có:
HindIII, NcoI, NotI là các enzym cắt giới hạn trong đó HindIII và NcoI là những enzym có chuỗi xác nhận gồm 6bp; NotI có chuỗi xác nhận 8bp. Những enzyme này nhận biết các trình tự DNA đặc hiệu, tuy nhiên vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết, có khi đến cả trăm base. Các enzym này cần Mg2+ và ATP để hoạt động. Hoạt động của những enzyme này bắt đầu bằng việc kiểm tra tình trạng methyl hóa của 2 adenine trong vùng nhận biết. Nếu cả hai adenine đều không được methyl hóa (dấu hiện cho
thấy đây là DNA ngoại lai), phức hợp enzyme thay đổi cấu hình và thực hiện hoạt tính phân giải. Ngược lại, nếu có một trong hai adenine được methyl hóa, chứng tỏ là DNA của tế bào, enzyme khi đó sẽ thực hiện chức năng của một enzyme methyl hóa cho gốc adenine còn lại để duy trì sự ổn định cho DNA bộ gene.
P35S của vector pBI121 - GmDREB2 là promoter của virus gây bệnh khảm
trên cây hướng dương. Gen lạ được chuyển nạp vào cây chỉ có thể được thể hiện khi có một trình tự promoter thích hợp kèm theo nó. Việc chọn lọc promoter như vậy phải tuân theo trình tự: ở đâu, khi nào, bao nhiêu, và trong điều kiện để gen thể hiện như thế nào. Theo đó, việc lựa chọn P35S vì đây là promoter cực mạnh, gen chuyển được biểu hiện trong mọi điều kiện khi gắn với promoter P35S.
GmDREB2 của vector pBI121 - GmDREB2 là đoạn gen được phân lập từ
cây đậu tương.
C-myc là chuỗi peptide có khối lượng là khoảng 1.202 Daltons và có 10 amino acid. C-myc được thiết kế vào vector pBI121 - GmDREB2 nhằm phát hiện kháng nguyên (là protein cần tìm) cho phản ứng lai Western blot phục vụ cho việc phân tích biểu hiện của gen được chuyển ở các thế hệ phân tích sau này.
NOS của vector pBI121 - GmDREB2 là tín hiệu kết thúc quá trình phiên mã.
3.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch A. tumefaciens và cảm ứng tạo cụm chồi
Các mảnh lá có kích thước 1cm2 được cắt ra từ cây in vitro sau 2 ngày đặt trên môi trường cảm ứng GM được ngâm vào dịch huyền phù vi khuẩn (OD600= 0,6 - 0,8 tốt nhất là 0,7) có lắc nhẹ 30 phút. Việc lắc nhẹ mảnh lá trong dịch huyền phù vi khuẩn làm tăng thể tích tiếp xúc giữa vết thương thực vật và dịch khuẩn. Đây là một trong những biện pháp có thể tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu quả chuyển gen.
Sau 30 phút nhiễm khuẩn, các mảnh lá được thấm khô và đặt vào đĩa petri chứa môi trường GM có bổ sung AS để trong tối 2 ngày. Sau quá trình đồng nuôi cấy, các mảnh lá được chuyển sang môi trường GM có bổ sung kháng sinh. Do vector pBI121/GmDREB2 có mang đoạn gen kháng kanamycine, nên
các môi trường sau biến nạp đều được bổ sung kanamycine 50mg/l để chọn lọc các cụm chồi chuyển gen. Trong nghiên cứu này, những kết quả về cụm chồi/cây đề cập đến là những cụm chồi/cây sống sót trên môi trường có chứa kanamycine. Quá trình chọn lọc còn bổ sung vào môi trường cefotacime, nồng độ 400mg/l nhằm loại vi khuẩn còn sót lại trên các mảnh lá.
Theo dõi số mảnh lá có cảm ứng tạo đa chồi được chúng tôi tiến hành với các lô thí nghiệm và đối chứng. Trong đó, lô thí nghiệm là các mảnh lá được chuyển gen GmDREB2 nuôi trên môi trường có kháng sinh. Đối chứng gồm hai lô, lô đối chứng thứ nhất kí hiệu là ĐC0 gồm những mảnh lá không được chuyển gen và cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh. Lô đối chứng thứ hai kí hiệu là ĐC1 là những mảnh lá không được chuyển gen và cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.
Các mảnh lá sau hai ngày đồng nuôi cấy trong tối được rửa khuẩn bằng môi trường 1/2MS0 có bổ sung kháng sinh cefotaxime 0,4g/l. Trong quá trình rửa khuẩn tiến hành lắc nhẹ khoảng 20 phút. Sau đó thấm khô và chuyển sang môi trường GM có bổ sung cefotaxime 0,4g/l, kanamycine 0,05mg/l (Hình 3.3).
A B
C D
Các mảnh lá được ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn (A); ,mảnh lá
trên môi trường đồng nuôi cấy (B); mảnh lá trên môi trường chọn lọc (C,D)
Quá trình biến nạp được thực hiện với 40 mảnh lá/lần biến nạp, lặp lại thí nghiệm 3 lần. Ở các lô đối chứng ĐC0 và ĐC1, mỗi lô chỉ tiến hành nuôi cấy 40 mảnh lá. Sau 10 ngày tại vết cắt của mảnh lá xuất hiện những cụm chồi cứng có màu xanh lá. Theo những nghiên cứu trước về tái sinh cây thuốc lá, đây là tiền đề cho việc tái sinh chồi. BAP là chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, có tác dụng kích thích tạo và phát triển chồi. Kết quả theo dõi tỷ lệ mẫu cảm ứng ta ̣o chồi được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.4.
Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng tạo đa chồi từ mảnh lá
Lô nghiên cứu Số mảnh
lá
Số mảnh lá có cảm ứng ta ̣o đa chồi
Thí nghiệm 120 89
ĐC0 40 0
ĐC1 40 35
(Số liệu thống kê sau 4 tuần cảm ứng)
Theo bảng 3.1, ở lô thí nghiệm với 120 mảnh lá được biến nạp thu được 89 mảnh lá có cảm ứng tạo đa chồi, đạt tỷ lệ 74,2%. Kết quả thu được này so với các công bố cùng trên giống thuốc lá K326 của Lò Thanh Sơn (93,3%) [18], Nguyễn Thị Thu Ngà (98%) [16] thì tỉ lệ tạo đa chồi ở trên là thấp hơn. Điều này có thể do nguồn gốc của các hóa chất dùng trong pha chế môi trường không cùng nguồn gốc. Các mô tái sinh đa chồi trên môi trường GM có bổ sung kháng sinh ở trên rất có thể vì trong genom của chúng có chứa gen kháng kanamycine. Do vậy có thể tạm kết luận, các mẫu tái sinh là mẫu đã biến nạp thành công. Tuy nhiên để chứng minh sự có mặt của gen chuyển đặc biệt là những biểu hiện của chúng cần có những nghiên cứu sâu hơn.
Song song với lô thí nghiệm chuyển gen, lô đối chứng ĐC0 được thiết lập bằng cách đặt các mảnh lá thuốc lá K326 trực tiếp lên môi trường GM có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và kháng sinh chọn lọc. Toàn bộ số mảnh lá của ĐC0 đều ngả màu vàng và chết dần. Kết quả này là do các mảnh lá không được biến nạp nên không chứa gen kháng kanamycine, vì vậy chúng không có khả năng tái sinh trên môi trường chọn lọc. Ở lô đối chứng ĐC1, trong số 40 mảnh lá đặt lên môi trường cảm ứng không bổ sung kháng sinh có 35 mảnh lá tạo đa chồi, đạt tỷ lệ khoảng 87,5%.
Sau 4-5 tuần nuôi cấy các cụm chồi lớn thu được từ lô thí nghiệm (hình 3.5A), đem tách nhỏ và lựa chọn được các cụm có số lượng chồi phát triển đồng đều cấy lên môi trường MS bổ sung cefotaxime 0,4g/l, kanamycine 0,05g/l để nhân nhanh chồi (hình 3.5B). Các cụm chồi ở lô ĐC1 cũng được tách ra và cấy lên môi trường MS không bổ sung kháng sinh.
Kết quả nghiên cứu sự kéo dài chồ i của các lô nghiên cứu đươ ̣c trình bày ở hình 3.4.
A B
Hình 3.4. Hình ảnh mẫu được cảm ứng và tách cụm kéo dài chồi