Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh
vật nói chung (vi sinh vật, động vật)... làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen [1],[20]. Có hai nhóm phương pháp dùng để chuyển gen vào thực vật: đó là phương pháp chuyển trực tiếp và phương pháp chuyển gián tiếp.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lí. Có thể kể đến các phương pháp như: phương pháp chuyển gen nhờ kĩ thuật xung điện; phương pháp chuyển gen bằng vi tiêm; phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn; nhờ súng bắn gen ...
Phương pháp bắn gen là phương pháp sử dụng các hạt kim loại nặng được bao bọc bởi DNA và chuyển vào mô tế bào nhờ súng bắn gen. Ưu điểm của phương pháp này là thao tác dễ dàng, biến nạp gen vào được nhiều tế bào, nguyên liệu đa dạng, hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào của các mô biệt hóa và mô phân sinh. Phôi soma được sử dụng như vật liệu đích đối với kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefacines cũng là vật liệu sử dụng tốt cho kỹ
thuật chuyển gen bằng súng bắn [61],[70]. Ở cây đậu tương, sử dụng súng bắn gen để biến nạp gen vào phôi sau khi phôi được tạo thành 7 tuần [51].
Chuyển gen bằng xung điện là phương pháp sử dụng xung điện trong thời gian ngắn để tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần làm cho DNA có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Ưu điểm phương pháp này có thể thực hiện với các mô in
vivo còn nguyên vẹn. Đoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn [21].
Với kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn, DNA ngoại lai theo đường ống phấn chui vào bầu nhụy. Thời gian chuyển gen là lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và đưa tinh vào thụ tinh. Thời điểm chuyển gen tốt nhất xảy ra khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử phân chia. Như vậy sự chuyển gen chỉ xẩy ra ở một tế bào cái duy nhất [21].
Ngoài các phương pháp chuyển gen trực tiếp ở thực vật còn có phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua virus hoặc vi khuẩn. Những vi khuẩn thực hiện quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua các cơ chế rất tự nhiên. Quy trình chuyển gen gián tiếp ở thực vật bao gồm những bước chính sau: (1) Xác định thông tin về gen liên quan đến đặc tính quan tâm; (2) Phân lập gen; (3) Thiết kế vector chuyển gen; (4) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (5) Biến nạp cấu trúc gen chuyển vào mô hoặc tế bào thực vật; (6) Chọn lọc các thẻ biến nạp; (7) Tái sinh cây biến nạp; (8) Phân tích cây chuyển gen [60].
Một trong những phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật được sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phương pháp chuyển gen thông qua loài vi khuẩn đất A.tumefacines.
Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm
1960- 1970. Việc phát kiến ra Agrobacterium có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu năm 1980 đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của công nghệ sinh học thực vật với những ưu điểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1-2 gen) trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn, do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao, tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm, kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền...[21].
Agrobacterium là một vi khuẩn đất gram (-) gây bệnh khối u ở thực vật và
có khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên từ loài thực vật này sang loài thực vật khác [7]. Trong tự nhiên, ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm thường gặp một số loại khối u gồm các tế bào không phân hóa và phát triển có tổ chức. Những tế bào trong tế bào khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống như tế bào ung thư ác tính ở động vật. Theo cơ chế hình thành, người ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u di truyền và khối u cảm ứng
Loại khối u cảm ứng được biết đến nhiều nhất là mụn cây do vi khuẩn
A.tumefaciens gây nên [21]. A.tumefacines là chi vi khuẩn gram (-) bao gồm
các loài gây bệnh kí sinh và vi sinh vật sống trong đất. A.tumefacines là loại vi
khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào tế bào thực vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A.tumefacines sẽ tạo ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall diease)
Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm nay và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật. A. tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen
vào nhiều loài nấm, chẳng hạn như A. awamori, A. fumigatus, Penecillium digitatums [59].
Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra ở thực vật. Trước hết là quá trình nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương. Các tế bào bị thương tiết ra những hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A. tumefaciens.
Tuy nhiên, vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u. Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing). T – DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u sau đó sẽ không phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn A. tumefaciens [21].
Ti- plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng 150 kb – 200 kb (Hình 1.2). Tuy nhiên chỉ một đoạn 2 kb – 3 kb có khả năng thâm nhập vào genome của tế bào chủ. Đó là đoạn T–DNA [58]. T–DNA được xác định bởi trình tự ở hai đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T – DNA borders), phần còn lại ngoài vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen [20].
Hình 1.2 Cấu trúc Ti - Plasmid (Nguồn : http://www.biotech.ubc)
Trên T – DNA có các gen tạo khối u. Gen tạo khối u sau khi gắn vào hệ gen của tế bào chủ sẽ tham gia quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin. Đây là các hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các khối u [43]. Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T – DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các gen mong muốn. Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường. Gen tổng hợp opine cần thiết để tổng hợp opine. Hợp chất này không được tổng hợp trong A. tumefaciens mà chỉ được tổng hợp trong tế bào chủ vì gen điều khiển sự biểu hiện của gen sinh tổng hợp opine chỉ hoạt động trong tế bào nhân chuẩn. Bằng cách này, vi khuẩn cảm ứng tế bào chủ tạo ra năng lượng và nguồn nitơ cần thiết cho chúng [1].
Ngoài ra, Ti plasmid còn gồm 2 hệ gen: hệ gen gây độc vir và hệ gen sinh
nhau cùng tham gia quá trình vận chuyển T – DNA [20]. Khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ, các gen gây độc vir được biểu hiện, chuyển T – DNA sang tế bào chủ và khối u được tạo thành do sự hình thành auxin và cytokinin. Đây là các chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục [21], dẫn đến thay đổi sự cân bằng hormon thực và hình thành các khối u. Tỷ lệ auxin so với cytokin tạo ra từ các gen vir sẽ quyết định hình thái khối u. Bên cạnh những gen chức năng, Ti plasmid gồm gen sinh tổng hợp amino acid hiếm, ví dụ: Một loại u tạo octopine và loại khác tạo nopanine, vì vậy người ta phân biệt 2 loại Ti plasmid là loại nopalin và loại octopine. Trình tự nucleotid của chúng chỉ khác nhau ở trình tự gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp nopalin và octopin [21]
Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn A. tumefaciens
A. tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương. Thực vật bị
thương sẽ sản sinh ra hợp chất amino acid, trong đó đường và axit vô cơ là những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm bằng cách hóa hướng động.
Theo mô hình 1.3, quá trình chuyển gen nhờ A.tumefaciens gồm 10 bước: Bước thứ nhất, Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ, sau đó tổ
hợp tín hiệu VirA/VirG của Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật
đặc trưng. Bước thứ ba, sự hoạt hoá của vùng gen vir. Bước thứ tư, T- ADN được tách ra khỏi Ti-plasmit nhờ phức hợp protein VirD1/D2. Sự tạo thành phức hợp VirD2- ADN (phức hợp-T chưa thành thục), cùng với một vài protein Vir khác, đi vào nguyên sinh chất tế bào chủ (bước thứ năm). Bước thứ sáu, sự kết hợp của VirE2 với sợi-T tạo thành phức hợp-T thành thục đi xuyên qua nguyên sinh chất tế bào chủ. Bước thứ bảy, phức hợp-T thành thục chủ động đi vào nhân tế bào chủ. Bước thứ tám, T- ADN bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất. Bước thứ chín, T- ADN tách khỏi các protein bảo vệ. Và cuối cùng, T- ADN hợp nhất vào hệ gen của thực vật.
Trong tế bào chủ, T – DNA sẽ hoạt động cùng gen nhân và mã hóa ra hormon và opine. Hormon kích thích sự phát triển của tế bào chủ, opine là nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, cho đến nay người ta vẫn chưa biết được đầy đủ cơ chế chính xác của quá trình này. Trong tế bào vật chủ, đầu cùng C của virE2 hướng tới DNA trong nhân và sẽ hòa nhập vào
hệ gen của tế bào chủ. Nếu không có trình tự tương đồng giữa trình tự gen của tế bào chủ và T – DNA được chuyển, T – DNA sẽ hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của tế bào chủ. Tuy nhiên, nếu những đoạn gen mà có độ tương đồng cao với hệ gen của tế bào chủ, chúng sẽ tái tổ hợp tương đồng. Tần suất tái tổ hợp tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước khác nhau, nhưng hiệu quả chuyển gen sẽ tăng khi giảm tỷ lệ các đoạn tương đồng [20].
Hiện nay người ta đã thành công trong việc cải biến Ti plasmid bằng cách cắt bỏ hầu hết các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn gen vir và phần T – DNA tối thiểu mang điểm ghép gen. Loại vector này đang được sử dụng rất hiệu quả trong việc đưa DNA lạ vào tế bào chủ [60].
Để chuyển được các gen mong muốn vào thực vật thông qua
A.tumefaciens trước hết cần phải thay đổi cấu trúc của Ti – plasmid. Do Ti – plasmid có kích thước lớn, chứa các gen gây khối u và có nhiều vị trí cắt của enzym giới hạn nên không thể dùng trực tiếp trong các thí nghiệm chuyển gen. Để giải quyết vấn đề này người ta tiến hành thiết kế các hệ thống vector dùng cho biến nạp. Trong quá trình này các vùng gen gây ra khối u ở thực vật sẽ được cắt bỏ, thay thế vào đó là các gen quan tâm có gắn thêm gen chỉ thị cho chọn lọc.
Những thành tựu trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen thông qua A.tumefacines
Công nghệ sinh học phát triển đã tạo điều kiện để các nhà khoa học tiếp tục ngiên cứu chọn tạo giống cây trồng bằng cách chuyển gen mã hóa các đặc tính mong muốn vào cây trồng.
Năm 1980, những thí nghiệm chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn A.tumefacines vào cây trồng được thực hiện. Năm 1986, các thử nghiệm đầu tiên trồng cây biến đổi gen trên đồng ruộng ở một số quốc gia. Năm 2006 được ghi nhận là năm đầu tiên của thập niên thứ hai của việc thương mại hóa cây trồng chuyển gen 2006 - 2015.
Tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu tạo cây chuyển gen thành công như Nguyễn Thị Thúy Hường và cs chuyển gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn vào cây đậu tương[8], Nguyễn Thu Hiền và cs chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật[6] , Lò Thanh Sơn nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương[18].
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liê ̣u hoá chất và thiết bi ̣
2.1.1. Vật liệu
Hạt thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội do Viện di truyền nông nghiệp cung cấp
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens CV58C1 mang cấu trúc pBI121-
GmDREB2 do Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường
ĐH Sư phạm- ĐHTN cung cấp.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất được sử dụng cho chuyển gen bao gồ m: Bacto tripton, yeast extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol, marker DNA 1kb. Các loại kháng sinh kanamycin, rifamicine, cefotaxime và các hóa chất thông dụng khác (X- gal, agarose,...). Các hóa chất chuyển gen được mua ở các hãng có uy tín trên thế giới như hãng Bioneer, Fermentas, Invitrogen...Hóa chất thông dụng mua tại các địa chỉ tin cậy.
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng, bình nuôi cấy, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH. Một số thiết bị dùng trong phân tích sinh học phân tử như: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, cùng với mô ̣t số trang thiết bị khác.
2.1.4. Đi ̣a điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm chuyển gen ở cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens được
tiến hành trên trang thiết bị Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.
Thí nghiệm phân tích cây thuốc lá chuyển gen được tiến hành tại Phòng thí nghiệm trong điểm công nghê ̣ gen, Viê ̣n Công nghệ Sinh ho ̣c.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá Nicotania tabacum K326 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58C1 được tiến hành theo phương pháp của Topping (1998) [72] có cải tiến, bao gồm các bước: (i) Tạo nguyên liệu chuyển gen (ii) Tạo dịch huyền phù vi khuẩn (iii) Biến nạp (iv) tái sinh (v) tạo rễ (vi) ra cây.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí nghiệm của phần nuôi cây mô cây thuố c lá được thực hiện trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 25oC ± 2, cường độ chiếu sáng 2000 lux.
2.2.1. Phương pháp tạo nguyên liệu biến nạp
Hạt thuốc lá được cho vào bình pyrex (dung tích 100ml). Bình pyrex mở hé 1/3 nắp lọ đặt bên cạnh cốc thủy tinh chứa dung dịch Clo. Bổ sung vào cốc đựng Javen 3ml HCl, hỗn hợp này sẽ tạo ra khí Clo có tác dụng khử trùng hạt thuốc lá. Đậy kín bình khử trùng và dán parafin.
Sau 4 giờ lấy hạt đã khử trùng rồi tiến hành gieo hạt trên môi trường MS cơ bản (MS0) gồm: MS1 (20ml/l) + MS 2 (20ml/l) + MS 3 (5ml/l) + MS 4
(5ml/l) + MS5 (5ml/l), có bổ sung aga (10g/l) + sucrose (30g/l).
Lá bánh tẻ ở các cây con khỏe mạnh có 3-4 lá thật được dùng để chuyển gen. Sử dụng dao cắt bốn cạnh mép lá để gây tổn thương tạo thành mảnh nhỏ, có hình vuông 1cm2 (cắt bỏ đường gân giữa của lá). Lá bị tổn thương được đặt úp cảm ứng trên môi trường 150ml (MS0 + aga 10g/l + sucrose 30g/l + 1BAP) trong 2 ngày [26], [27].
2.2.2. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens
Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 20ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc (rifamycine 0,025g/l,