Cơ sở di truyền chọn giống thực vật (NXB khoa học kỹ thuật 2001) lê duy thành, 160 trang

f)\l H o r \ |\H lui \(; IÃM THÒNG riN-THƯVIÊN 581 i ; r 1665 c/ (HI MV.046860 PGS TS LÊ DUY THÀNH PGS TS LÊ DUY THÀNH Cơ Sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT ■ ■ ■ Giáo trình dùng cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh, ngành Sinh học trường Khoa học Tự nhiên, Sư phạm, Nông nghiệp, Lâm nghiệp NHẢ XUẤT BẤN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẠ r HÀ NỘI 5-581.3 KHKT-00 84-87-00 LỒI GIỐI THIỆU Trong năm gần dày, tồng sản lượng lương thục cùa nưóc ta dã đạt số rát đảng khích lệ Từ nước thiếu lương thực đến dâ trỏ thành nước xuát kháu gạo dứng hàng thứ hai giới Riêng năm 1999, lượng gạo xuất kháu 4,4 triệu tán tống sản lượng lương thực 34,2 triệu tổn dó có 31 triệu thóc Ngồi yếu tố v ĩ quản lý Nhà nước, chế độ chinh sách, biện pháp kỹ thuật dầu tư, yếu tó dát, nưóc, khí hậu thịi tiết, gióng có vai trị đặc biệt quan trọng việc nâng cao suát sản lượng căy tròng Dă từ lâu, việc áp dụng nguyên lý di truyền học uản coi văn đề then chốt việc gây tạo cải tiến giống Giáo trình *Cơ )SỜ di truỳên chọn giống thực vật’ PGS TS Lê Duy Thành cung cáp cho người dọc co sô lý luận nguyên lý di truyìn học dược áp dụng vào phương pháp chọn giống thực vật nguyên tác ứng dụng số kỹ thuật sinh học phán tử kỹ thuật di truyền chọn giống căy tròng Cuốn sách Phàn pháp ứng dụng hợp, Uu th ế lai, bao gòm hai phần : tác giả giới thiệu nguyên t&c di truyần học phương uào chọn giống, hệ thống di truỵèn kiềm sốt tín h khơng đa bội thé, dột biến lai tế bào soma Phàn hai tác giả giới thiệu m ột sỗ kỹ thuật sinh học phún tù kỹ thuật chuyền gen, kỹ thuật RFLP, kỹ thuật PCR Đăy sách thiết không chi tài liệu học tập tốt cho sinh viên học viẻn cao học thuộc ngành sinh học m tài liệu tham khảo cho nhà chọn giống co ỏ có lién quan dén cơng tác chọn tạo gióng trdng Hy vọng sách gợi mỏ thêm cho bạn đọc vè vị trí, vai trị jli truỵèn học chọn giống căy trịng góp phàn tăng suất sản luọng căy trồng ỏ Việt Nam , xậy dựng nẽn nông nghiệp da dạng uà bần vững V iện sĩ, '^tié n sĩ k h o a h ọ c IV ần ĐÌnh L o n g V iện K h o a h ọ c Ký thuẠ t N ô n g n g h iệ p V iệ t N am > l NÓI ĐẤU N h ữ n g dóng góp di truyèn học vào việc cao auát sản luạng căy tròng dược xép uào hàng thứ hai, sau tiến đạt dược v ĩ phàn bón, thuỷ lại nơng hố Trong nửa sau th ế kỷ XX, việc tảng sản luợng ỏ nhièu loại căy tròng quan trọng trền th ế giới có phàn đóng góp khoảng 50% nhờ việc đưa vào sản xuăt giống căy trịng mói v ì thế, đă từ lău việc áp dụng nguyẽn lý di truýền học uán dược coi vấn dè then chốt việc gâỵ tạo cài tiến giống căy tròng M ặt khác, khoảng hai thập kỳ cuối th ế kỳ XX, kiến thức và, kỹ thuật sin h học dại, dặc biệt lỉnh vực nuôi cấy mô- tế bào, công nghệ sinh học sinh học p hán tủ đâ p h t triển nhanh chóng Cậc kỹ tlịuật nậy ,hi,ện naỵ p h t triện nhanh đến mức khiến cho nhà chọn gióng cảm tháy khó khăn việc lụa chọn cỉm ng d i áp ậ ụ r^ S ụ trợ giúp m ột số kỹ thuật vậỵ dối với phương pháp chọn giáng thực vật thơng thường, dứ thúc đáy q trình tạo giống căy trịng có n h ih t dậc tín h nơng- sinh học q Giáo trình 'Ca sờ di tmỳền chạn giếng thực vật' cung cấp cho người đọc ca 8Ò lý luận nguyên lý di truyèn học áp d ụng vào phương pháp chọn gióng thực uật bản, địng thời trình bày ngun tốc ứng dụng m ột aố hỹ thuật 8inh học phăn tử uà kỹ thuật d i truýền chọn gióng c&y trịng Cuốn sách có tám chương, bao gịm hai phàn lớn: Phần thứ nhát năm chương dịu, trình bày nguyên tác di truýện học phương pháp ứng dụng vào chọn gióng thực vật vấn di: hệ thống di trun kiểm sốt tín h khơng hợp, ưu th ế lai, đa bội thé, dột biến thục nghiệm lai tế bào aoma; Phàn thứ hai gdm ba chương cuối (6; SJ, giói thiệu m ột 8Ố ^ thuật ainh học phá n tử nguyên tác ứng dụng chúng vào chọn giống thục vật, kỹ thuật chuyồi gen, kỹ thuật R F L P kỹ thuật PCR Giáo trình dược dùng làm tài liệu học tập cho sinh viên năm cuói học viên cao học thuộc nhóm chuyên ngành "Co thể thục vật", n h u di trui học, sinh lý học thực vật, hố sinh học Khoa Sinh học ó Trường dại học Khoa học tự nhiên, DHQG H Nội, Đại học S phạm , Dại học Nông nghiệp, Đại học Lâm nghiệp Sách củng có th é duợc dùng làm tài liệu học tập tham khảo cho học viên LỊI NĨI đ Xu cao học ỏ chuyên ngành có liin quan thuộc viện nghiên cứu trường đại học khác cho quan tăm dến vấn đ i VÌ sách dược xuăt đàu, chác rửng không thé tránh khởi khiếm khuyết The giá xin chăn thành cám ơn ý kiến đóng góp xăy dựng dể cho sách dược hoàn thiện han l ầ c giả Chương HỆ THỐNG DI TRUYỀN KIẾM SOÁT TÍNH KHƠNG Hộp ỏ THựC VẬT 1.1 MỎĐẰU Tính khơng hợp (incompatibility) trỉnh sinh sản ỉà khái niệm tượng h ạt phấn khơng có khả nảy mầm ống phấn khống thể x&m nhập vào vịi nhuỵ thực q trình thụ tinh đây, ta chl đề cập đến tính khơng hợp hệ thống di truyền kiểm soát, chủ khống nói đến tượng bất thụ rối loạn mặt sinh lý, tế bào yếu tố ngoại cảnh gây Tính khơng hợp có thê’ xảy phạm vi quan sinh sản đực m ột cây, mà ta gọi ỉà tính khơng tụ hợp (self incompatibility), nghĩa dó khơng th ể xảy q trình tự thụ phán Tính khơng hợp cd th ể xảy giao phấn nhóm có quan hệ họ hàng định với nhau, mà ta gọi ỉà tính khơng hợp chéo (incompatible crosspollination) - nghỉa nhdm khổng giao phối với Hệ thống tính khơng hợp hoạt động trạng thái thề bào tử (sporophytic incx>mpatibility) trạng thái thé giao tủ (gametophytic inoompatibility) Nđ kiểm sốt tương tác vịi nhuỵ vầ hạt phấn nhờ âự hôạt động alen thuộc locut s THiy nhiên, sổ chi thực vật người ta phát tượng khổng phải m hai nhiều locut can thiệp vào tính khống hợp ỏ trạng thái giao tử Theo Darlington Mather (1949) thỉ có đến 1/2 số lồi thực vật h ạt kín có tượng khơng hợp Điều ghi nhận phổ biến 78 họ, bao gôm khoảng 3000 loài, họ đậu, cà, hoa hồng, cúc, bầu bí, hồ thảo, đu đủ, Hiện tượng khống hợp cđ ý nghĩa quan trọng trỉnh tiến hố giới thực vật Ntí ngăn cản nội phổi, tạo điều kiện cho ngoại phối vỉ làm tăng khả biến dị sinh vật M ặt khác, nổ lại nhà chọn giđng sử dụng rát có hiệu trinh chọn giống theo ưu th ế lai Bảng 1.1 cho thấy số đặc điểm tính khổng hợp số chi thực vật ctí tượng phổ biến Bảng I.l Ilệ thống tính khồng họrp thề ár số chi thực vột Chỉ thực vật Briìssica Dặc điềm hình thái di truyền Hệ thống ưnh khơng hợp (2) Đồng hình, đơn gen (3) Thề híin tử HỆ THỐNG DI TRUYỀN KỂM SỐT TÍNH KHƠNG Hộp ỏ THựC VẬT Tiẽp bảng /./ ( 1) Raphanưs Trifoiiwn Purứhrum Lừtum Helianthiis Pagopyrưm Lotus Lỵcopersicon M eđiCi^o Nicatíana Phaiarừ Pnơm Pyrus c St S |> S3 2) Tính khơng hợp th ể bào tử chịu kiểm soát nhân lưỡng bội trạn g thái th ể bào tử ; nghía là, hoạt động (kiểu hỉnh) hạt phấn hay ống phấn kiểu gen lưỡng bội th ể 2n qui định 3) Giữa alen có hạt phấn vịi nhuỵ có mối tương tác, m thường quan hệ trội- lặn Chẳng hạn, hạt phấn vịi nhuỵ có tính trội hoàn toàn alen alen khác theo kiểu giống nhau, xảy tượng khơng hợp chéo m ột số nhóm có kiểu gen khác Vi th ế ta ctí th ể thấy rằng, tính khơng hợp chéo dạng tính khơng hợp thể bào tử Giả sử, S j> S 2, Sj, S thl kiểu gen SjS có phản ứng khơng hợp với kiểu gen Sj S 3, SjS^ Tính khơng hợp trở nên phức tạp hơn, quan hệ trội- lặn alen locut s th ể khơng giống hạt phấn vịi nhuỵ Điều thường quan sá t thấy hướng lai thuận lai nghịch, v í dụ, Sj> hạt phấn vòi nhuỵ; S j> h ạt phấn; S j> SI vòi nhuỵ phép lai S|S (mẹ) X SịSg khống hợp; đo' phép lai nghịch S|S^ (mẹ) X SịS^ lại có phản ứng hợp 1.4 TÍNH KHƠNG H ộp ĐA HÌNH Như nói, số lồi, Primula ưulgarìs, Lythrum salicaria tính khơng hỢp tăng cường tượng đa hình cấu trúc hoa : vòi nhuỵ nhị có thê’ có dạng dài, ngán hay trung binh ; tượng đối lập độ lớn hạt c s ỏ DI TRUYỂN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 145 B PCKdyng mù nein gidi hạn -X -C z= í-* phân cắt bửí eozym gi , gồm nhát 40% G/C, prim er dài có tính đặc hiệu giá thành đ hơn; prim er chứa đoạn cổ tới > nucleotỉt liên tục loại thi nổ m át tính đặc hiệu 8.3 Sử DỤNG PCR ĐỂ LẬP BẤN ĐÒ DI TRUYỀN Bản đồ di truyền sơ đồ gồm chi thị phân tử (molecular m arker) hoậc thị kiểu hình xếp gần nhau, càn cho phân tích hệ gen Các thị có liên quan đến tính trạng cần nghiên cứu người ta sử dụng chương trìn h chọn giống thực vật, đặc biệt cho nghiên cứu chuyển gen tách dòng gen Bởi thị kiểu hình khơng đủ phong phú để lập đồ di truyền xác nên thị phân tử sử dụng cách ngày phổ biến Các thị ADN trước thường dùng tính đa dạng chiều dài phân đoạn cát giới hạn (RFLP) Tuy nhiên, để phát RFLP ta phải áp dụng phép lai "Southern blot" rấ t tốn công phức tạp Trong đđ, gần đời nhiều kỹ thuật mâi dựa nguyên tác PCR cho phép ta xác định thị di truyền tính đa dạng hệ gen với nhiều ưu điểm AFLP, SSR, STS, RAPD chẳng hạn kỹ th u ật xác định tính đa dạng ADN nhân ngẫu nhiên, viết tắ t RAPD (Random amplifíed polymorphic DNA = RAPD) Nguyên tác phương pháp là, người ta sử dụng m ột tập hợp prim er cổ trậ t tự nucleotit ngẫu nhiên (thường gồm 10 oligonucleotit) để nh&n đoạn ADN hệ gen cách ngẫu nhiên theo nguyên tắc PCR sản phẩm thu tập hợp đa dạng dịng đoạn ADN Tính đa dạng thu nhờ kỹ th u ật RAPD đáng tin, vi ctí thay đổi m ột bazơ nitơ ngản cản việc tiếp hợp prim er đoạn ADN đích Sự m ất đoạn nhiễm sắc th ể thêm bớt điểm gán prim er xen vào gen làm thay đổi kích thước đoạn ADN đửợc nhân Mỗi prim er có th ể tạo m ột vài đ a dạng phát cho phổ điện di đặc trưng kiểu v&n tay Một ưu điểm khác phương pháp với oligonucleotit ta có th ể sử dụng với loài khác nhau, mẫu dị RFLP có th ể dùng cho lồi ctí quan hệ gần Tính đa dạng thu từ thị RAPD đánh giá cao so vâi phương pháp RFLP cho phép phát tính đa dạng đoạn chứa trậ t tự nucleotit lặp lại u điểm sau phương pháp sau thời gian nhân khoảng 2- giờ, tính đa dạng có th ể quan sát nhờ kỹ th u ật điện di gel agarose, trán h tổn thời gian chi phí phải thực phép lai có sử dụng m ẫu dị đánh dấu phóng xạ phương pháp RFLP Q trình xây dựng di truyền phân tử thường trải qua bước sau: • Chọn quần thể lập đb; - Xác định tần - Xác định nhóm liên kết; - Xác định vị trí tương đối gen số tái tổ hợp xảy quần th ể đó; thị phân tử nhiễm sác thể; c ỡ s ỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 147 - Việc xử lý phân tích số liệu thu để thiết lập đồ di truyền phân tử phải nhờ đến chương trỉnh máy tính chuyên dụng, 'lin ka g e-r (Suiter et al., 1983: J Hered 74, 203-204; Echt et al., 1992: Maize Genet Coop, Nwsl 66, 27-29), "Mapmarker" (Lander et al., 1986: Cold Spring H arbor Symposia on quantitative biology 51, 9-62; Lander e t al., 1987: Genomics 1, 174-181), 'M apmanager' (Manly and Elliot, 1991: M ammalian Genome 1, 123-126), 'Join M ap' (Stamp, 1993: Plant J., 3, 739-744) Các chương trinh phần mềm cho phép xác định tần số tái tổ hợp từ quần thể phân ly phân tích, khả liên kết m ột chl thị cần xác định với thị đă biết trước nhờ co' th ể xác định vị trí tương đối hay trậ t tự phân bố chi thị di truyền liên quan đến tính trạn g cần nghiên cứu 8.4 NGUYÊN TẮC VÀ c s ỏ DI TRUYẾN CỦA PHƯƠNG PHÁP CHỌN LỌC NHỒ CHÌ TH| DựA VÀO PCR Một thị di truyền cần phải có yêu cầu : 1) có khác biệt thể bố th ể mẹ; 2) Nó phải truyền lại xác cho hậu Người ta phân kiểu thị di truyền sau: - C hỉ th ị h ìn h thái: Về m ặt nguyên tác, tính trạn g hỉnh thái Tiào đtí locut kiểm sốt mà biểu khơng bị ảnh hưởng tác động mơi trường, có th ể dùng làm thị hình thái trinh chọn lọc Phương pháp chọn lọc nhờ thị (m arker assisted selection = MAS) sủ dụng tính trạ n g cần nghiên cứu liên kết chặt chẽ vối tính trạng khác dễ dàng phát m ật hỉnh thái Chẳng hạn, lúa gen kháng bệnh rầy nâu (BPH) liên kết chặt chẽ với gen qui định m àu tím bao mầm Khi lai mang tính kháng rầy có bao m ầm màu tím với khổng m ang tính kháng cố bao mầm màu xanh 95% ¥2 có bao m ầm m àu tím kháng với rầy nâu Trong trường hợp này, bao mầm chi thị hỉnh thái sử dụng để chọn lọc tính kháng rầy nâu TXiy nhiên, thị hình thái kiểu th ế thực vật khổng nhiều Mặt khác, nhiều thị hinh thái đột biến khơng có lợi cho thực vật Hơn nữa, nhiều tính trạn g nơng học quan trọng trịng lại số gen khổng liên kết với kiểm soát biểu chúng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển khác thể • C hỉ th ị p h â n tử : Chỉ thị phân tử đặc điểm thể khía cạnh hoá học hay cấu trú c phân tử di truyền lại cho hậu thế, giổng nhân tó di truyền Mendel, lại ctí th ể định lượng Cđ hai loại thị phân tử : • Chi thị isozym Isozym dạng enzym có m ột phản úng hố học (hoạt tính xúc tác tương tự giống nhau) lại bị ức chế phân tử khác nhau.Về m ật di truyền, có th ể chia isozym làm hai dạng: Isozym đan gen : Các isozym chịu kiểm soát gen; Mặc dầu chúng hlnh th àn h từ chuỗi polypeptit đơn, có th ể ctí kiểu phân tử khác ( khác th àn h phần trậ t tự axit amin; phân tách phương pháp điện di) lsozym da gen : Các isozym m ă hoá hai hay nhiều gen chúng phân biệt đặc điểm hố miễn dịch đặc tính enzym • Chl th ị phân lử ADN Khác với hai loại thị hỉnh thái chi thị isoz)Tn, thị phân tử ADN 148 KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DựMG CỦA NÓ TRONG CHỌN GIỐNG THựC VẬT phong phú đa dạng ADN , tính ổn định khống lệ thuộc chúng vào yếu tố mối trưòng Các thị di truyền phân tử sử dụng đế xác định mối quan hệ cá th ể loài loài, sở cho việc phán loại loài (các thứ), phát loài mối quan hệ tiến hố lồi (Âhn et al.,1993; Dunforal et al.,1995) Chúng dùng để lựa chọn ưỉ hợp lai (Nair et al., 1995; Zhang et al.,1995) Kiểu thị sử dụng có hiệu đế lập đb phân tử cho trồng có phương thức sinh sản sinh dưỡng hoậc sinh sản hữu tính khtí khăn Các thị phân tử chia làm hai nhđm lớn: - Chí thị dựa sò lai ADN hay thị RFLP u điểm phương pháp dựa băng diện di thu được, ta khững phát cá thể dị hợp tử (Aa) đồng hợp tử (AA aa) mà phân biệt cá thể đồng hợp tử trội vối cá th ể đồng hợp tử lặn v ỉ thế, người ta gọi thị thị đồng trội Tuy nhiên, phương pháp có nhược điểm qui trinh phức tạp, c&ng kềnh, khổ tự dộng hoá, tốn phải sử dụng chất đồng vị phóng xạ nguy hiểm cho người - Chỉ thị dựa sô nhăn ADN băng kỹ thuật PCR Cho đến đả ctí rấ t nhiều chl thị phân tử phát triển dựa sở nh&Ti ADN bầng kỹ th u ật PCR, AFLP, RAPD, SSR, STS 8.4.1 Chọn lọc nhờ vào thị ADN Sự đời thị phân tử làm tăng hiệu iực phương pháp chọn lọc nhờ thị Các chi thị ADN dùng phổ biến RFLP Về sau, người ta đă phát nhiều loại thị ADN khác Trong chọn lọc nhờ chi thị, gen đích (gen cần Đghiẽn cứu) phát dựa vào thị ADN dựa vào biểu kiểu hinh gen Hình 8.3 minh hoạ nguyên tác sở di truyền việc xác định gen đích dựa vào thị l ầ giả định rằng, locut nàm nhiễm sác th ể lúa kiểm sốt tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi Cây thể cho (donor) chứa gen kháng (R) liên kết với gen chi thị ADN (m) thể nhận (recipient) mang alen khổng cđ khả nang kháng (S) Hên kết với thị ADN (M) Sau lai cho nhận ta thu lai Fj dị hợp tử gen kháng (gen đích) locut thị ADN, th ể băng điện di Cây F j tự thụ phấn cho quần thể F phân ly Dựa trôn phổ điện di chi thị ADN, ta cđ th ể phân cá th ể quần th ể phân ly thành nhóm MM, Mm mm Trong nhổm mm phần lớn m ang alen kháng (R) đo liên kết Khi giá trị r (khoảng cách thị ADN gen đích) bé thỉ tỷ lệ thuộc nhóm mm mang alen R lớn Vì thế, chọn lọc dựa vào chi thị ADN cho phép chọn lọc gen đích, trừ cá thể chọn lọc m ang nhiễm sắc th ể đă qua tái tổ hợp Nếu tần số tái tổ hợp gen đích thị ADN khổng thay đổi tìl quần thể lập đồ đến quần th ể chọn lọc thỉ ta cđ khả chọn lọc gen đích dựa chl thị ADN với m ột độ xác cao 8.4.2 Chọn iọc nhờ thị dựa vào PCR Tính biến dị di truyền giổng loài cd thể phát sai khác chiều dài đoạn ADN đích nhân nhờ PCR sử dụng m ột cập primer Dó thay bazơ nitơ điểm liên kết prim er hoậc sáp xếp lại trậ t tự ADN vùng chứa điểm Những thay đổi th ế phản ánh tính đa dạng chiêu dài đoạn ÂDN nhân (ampỉicon length co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT thể cho mR- 149 I hển hặ n X 71 licn kết (r) gcn dích chi Ihị ADN bâng chì thị ADN cày bố mẹ I m - M R -s băng chi thị ADN cày lai Ki ba kiểu gen chì thị mm, mM, MINI p gcn đích liên kết với kicii gcn mm Hỉnh ».3 Sơ đd V? xở di Iruyin cùa phuưng pháp chọn lọc nhờ thị phân từ polymorphism = ALP) Khi ta không phất ALP hai giống (trong hình 8.4 giống A giống B) bàng cập primer thỉ RFLP dựa trê n PCR (PCR based RFLP = PBR) cđ thể sử dụng tiếp để ph&n biệt sản phẩm PCR, nhờ việc dùng enzym cát giới hạn thay bazơ nitơ điểm cát hay thay đổi trậ t tự nucỉeotit vùng hai điểm cắt, ALP PBR thị dựa PCR Các prim er dùng phương pháp chọn lọc nhờ chi thị dựa trê n PCR thường vào điểm có trật tự nucleotit dá dược xác dịnh cd tên gọi tắ t STS Chi thị STS Một kiểu chi thị di truyền sử dụng phổ biến việc lập đồ genom điểm trật tự dược dảnh dáu (Sequence Tkgged Si te = STSs) STS đoạn ADN ngán gồm khoảng 60 - 1000 bp phát kỹ th u ật PCR Nó cho phép xác định vị trí đánh dấu cách sử dụng trình tự nacleotit biết trước ADN genom Hai đoạn mồi thiết kế dựa trỉnh tự nucleotit đả biết giúp ta xác định vùng ADN cần tìm kiếm Các đoạn mồi STS thừờng chứa khoảng 20 nucleotit (dài đoạn mồi kỹ th u ật RAPD) nên có tính đặc hiệu cao với PCR Một lượng lớn STS tạo nhờ việc sử dụng kỹ th u ật RFLP dòng cADN làm mẫu dò 150 KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG CỦA NÓ TRONG CHỌN GIỐNG THựC VẬT Giống A Giống B Giống c ADN - PCR Phân tích gel ALP Phân cát bàng i enzym giới hạn Phân tích gel PBR Hình Sơ đồ để pliát ALP PBR Mỗi STS xác định điểm đồ mốc genom ỏ c&y lúa, STS coi mốc chuẩn (Villareal e t al., 1995); chẳng hạn, người ta xác lập STS liên kết với m ột số gen kháng stress nhân tố sinh học gây Dựa trơn kết phân tích thị STS , RAPD người ta cd thể xây dựng đồ di truyền liên kết giống trịng Nhờ vậy, việc tỉm kiếm gen kiểm soát liên quan chặt chẽ đến m ột tính trạ n g di truyền có th ể tiến hành cách dễ dàng, ví dụ, Lê IVầĩi Bỉnh (1992) đă phân lập xác định trình tự nudeotit bốn dịng cADN bất nguồn từ số protein lạ xuất giai đoạn mạ có liên quan đến tính chịu lạnh giổng lúa Nipponịare thuộc lồi phụ o aativa Japonica\ đđ cố hai dòng đáng ý pBC442 chứa 754 bp pBC591 chứa 964 bp Cả hai dòng cADN đèu cđ m ă mở đầu ATG, m ă kết thúc dòng pBC442 TAA dòng pBC591 TAG Dộ dài khuữn dịch thỏng dòng pBC442 468 nucleotit, mã hoá cho m ột phân tử protein chứa 156 axit am in d Ò D g pBC591 762 nucleotit, mâ hoá cho m ột phân tử protein m ang 254 axit amin Dựa trơn sở đó, để tìm kiếm cổ m ật gen liên quan đến tính chịu ỉạnh kiểu m ột giổng lúa khác đó, ta có th ể sử dụng cặp mồi đặc hiệu (như LTB964/LTB965 LTB968/LTB969) để nhân đoạn pBC442 pBC591 bầng kỹ th u ật PCR, chúng tòn tạỉ giống lúa cần tỉm co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT 151 Hình 8.5 minh hoạ việc sử dụng PCR để phát STSs Muốn vậy, trước tiên ta phải biết đầy đủ trật tự nucleotit đoạn ADN cần lập đồ để thiết kế đoạn mồi Mồi lai vỏi cặp bazơ đầu kéo dài tổng hợp mạch Nếu xuất đoạn ADN tổng hợp thl điều chứng tỏ ADN chưa biết có đoạn trật tự nucleotit đánh dấu (STS) mà ta càn tỉm 250 bp PCR n chu kỳ điện di ||L bp * Hình 8.5 Sử dụng PRC đê phát STS: Trong ví dụ này, ta sừ dụng cập mồỉ hai đầu cách 250 bp Sau số chu kỳ PCR xuất nhiầi đoạn ADN xoắn kép chứa 250 bp Điện di sản phầm ta biết xác kích thước chúng Chi th ị AFLP Dựa trê n nguyên tắc PCR, kỹ th u ật AFLP (AmpIiHed F ragm ent Length Polymorphism = AFLP) cho phép ta phát tính đa dạng vè chiều dài đoạn A D N dược nhăn chọn lọc Nguyên tắc kỹ thuật sau: dừng enzym giới hạn để cát ADN genom thành phân đoạn có kích thước khác nhau; số sỗ cd số phân đoạn mang đàu mút giổng Nếu ta sử dụng đoạn (adaptor) có gán thêm oligonucleotit chọn lọc trước để 152 KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG CỦA NÓ TRONG CHỌN GIỐNG THựC VẬT định hướng cho việc gắn cặp mồi PCR, tấ t đoạn ADN có đàu m út giống nhăn Khi thay đổi sổ lượng trậ t tự oligonucieotit chọn lọc đầu nối ta cd thể nhận đoạn ADN nhân khác Kỹ thuật đánh giá nhanh chóng có hiệu việc xác định tính đa dạng trồng, lúa, lạc (Redona et al., 1998; H e et al., 1997) Chi thị SSR SSR (Simple Sequence Repeats = SSR) hay gọi vi vệ tinh (microsatellites), đoạn ADN ctí lặp lại trật tự nucleotit đan giản Hiện tượng tồn SSR th ể sinh vật Eukaryote phổ biến động vật thực vật Tuy nhiên, tùy loài mà số ỉượng nucleotit đơn vị lặp lại thay đổi từ đến hàng chục số lượng đơn vị lặp lại biến động từ đến hàng trăm ngàn hoậc nhiều v í dụ, Arabidopsis thaliana có đến 600 đơn vị lặp lại (GA/CT); lúa, ctí khoảng 1000 đơn vị lặp lại (AC/TG), 1000 đơn vị (GA/CT), 1000 đơn vị (GT/CA), gần 300 đơn vị (GATA/CTAT) Ngồi ra, người ta cịn thấy đơn vị lặp lại kiểu (CGG/GCC) mầm (như ngô, lúa ) phổ biến hai màm Phương thức lặp lại đa dạng Nhưng tựu tru n g lại cd ba kiểu sau; 1) lặp lại hoàn toàn : đơn vỊ lặp lại xếp tiếp nhau; 2) lặp lại khơng hồn tồn : xen kẽ vào đơn vị lặp lại nucleotit khác; 3) lặp lại phức tạp ; xen kẽ đơn vị lặp lại khác Thơng thường, SSR có m ặt chủ yếu vùng dị nhiễm sắc nhiễm sắc thể, vùng tâm động đầu mút Chúng giữ vai trị quan trọng việc điều hồ phiên mâ gen hoạt động vùng ngun nhiễm sác, góp phần làm tăng tính ổn định học nhiễm sắc th ể trình phân bào cđ thể chứa đựng thơng tin di truyền liên quan đến xác định giới tính động vật thực vật Kỹ th u ật SSR cho phép ta phát tính đa hinh độ dài trậ t tự nucleotít đơn giản Kỹ thuật tương đổi khổng phức tạp, dựa nguyên tác PCR (với cặp mòi dễ tìm kiếm thị trường) phương pháp điện di gel Do khác số lượng nucleotit đơn vị lặp lại số đơn vỊ lặp lại mà đa hinh độ dài SSR nhân phát sau trin h điện di gel agarose hay polyacrylamid Trong thực tế, chi thị SSR đă dùog để chọn lọc tính kháng bệnh khảm virut đậu tuơng, sổ tính trạ n g có quan hệ chặt chẽ đến suất lúa, chất lượng glutenin protein dự trữ lúa mỉ, nhự cho phép xác ỉập mối quan hệ thân thuộc giống trồng ỏ cà chua, lúa, đậu tương, mía Theo McCouch (1996), kỹ th u ật tỏ rấ t hữu hiệu việc phân định sai khác giống lồi phụ tính đa dạng alen thuộc locut ỏ số trồng, nhờ chi thị SSR ngưòi ta xây dựng đồ di truyền liên kết, cà chua có tới 32 SSR m ang đơn vị lập lại (GACA) (GâTÂ) (Gupta, 1966); d lúa, Zhao (1993) đa đưa đ& thị SSR kiểu lặp (GGC) Riêng tính hiệu việc sử dụng thị phân tử để phân biệt sai khác thứ trồng, đậu tương mía, thỉ thị SSR có phần ưu việt so với thị RAPD (Havey, 1997) NgoỀd Wu (1993) cho rằng, có th ể sử dụng thị SSR để đánh giá tiềm năng suất lúa lai loài phụ Một úng dụng quan trọng khác chi thị SSR việc dùng chúng để xác định c o s ỏ DI TRUYỀN CHỌN GlỐNG THựC VẬT 153 giới tính thực vật Chẳng hạn, đu đủ đực, sau dùng enz 3on giới hạn H indll để xử lý genom sử dụng mẫu dị (GATA)4, Parasnís (1998) phát đoạn ADN có độ lớn kb, mà tượng khơng có c-ây đu đủ Chi thị RAPD Bằng phương pháp PCR, muốn nhân đoạn ADN ta phải biết trậ t tự nucleotit đẽ’ thiết kế cập mồi thích hợp Vì thế, việc áp dụng để nghiên cứu ADN genom giống trông gặp nhiều khó khăn \^ o đầu thập kỷ 90, kỹ thuật phân tử có tên gọi RAPD (Random amplified polymorphic DNA = RAPD) đời cách độc lập hai phịng thí nghiệm khác (Williams, 1990 Welsh et al., 1991) Kỹ thuật cho phép phát tính đa hình đoạn ADN dược nhăn ngẫu nhiên việc dùng mồi đơn chứa tr ậ t tự nucleotit ngẫu nhiên Thường mồi chứa từ đến 12 oligonucleotit - tối thiểu bp Có hàng ngàn loại mồi chứa khoảng 10 bp số lượng mồi dùng nghiên cứu số hạn chế Trong phản ứng này, mồi đơn gắn vào hai điểm khác hai mạch đơn đối diện đoạn ADN khuôn Nếu điểm gắn mồi nầm khoảng cách nhân (thường tìí 200 đến 2000 nucleotit ) đoạn ADN nhân lên Sự có m ặt sản phẩm chứng tỏ có tương đồng hoàn toàn hay phàn giữa ADN genom với mồi oligonucleotit Các mồi dùng RAPD có kích thước ngán nên dễ tlm đoạn tương đồng mạch đơn ADN genom Nói chung, đoạn mồi cđ thể định hướng cho việc nhân số locut genom Vì thế, m ột phương pháp có hiệu để xác định tính đa hình trậ t tự nucieotit cá thể v í dụ, tần sổ tìm thấy đa hình RAPD 0,3 / mồi Arabidopsis thaliana; 0,5 / mồi đậu tuơng; / mồi ngô 2,5 / mồi N crassa Các ưu điểm kỹ th u ật là, ta khơng cần phải biết trình tự nucleotit đoạn ADN nhân bản; qui trinh tiến hành tương đối nhanh, dễ thực dùng ánh sáng huỳnh quang thay cho chất phóng xạ Mặt khác, dựa vào nguyên tác POR nên phân tích ta chi cần lượng nguyên liệu ADN tính nanogam đủ Các chi thị RAPD thường dùng đê’ phân tích xác định mổi quan hệ thân thuộc thứ trồng hay cá thể đê’ phục vụ cho cỏng tác lai tạo phân loại Chúng sử dụng thị phân tử để xác định gen kiểm sốt hoậc có liên quan đến tính trạng trịng, tính trạng chất lượng sợi bơng, tính trạng kháng virut cà chua ("Iktineni et al., 1996; Winter et a l , 1995) u điểm kỹ thuật phân tích RAPD nhanh, rẻ cho phép tiến hành với số lượng mẫu lớn Hạn chế kỹ thuật phân tích là, phụ thuộc vào phịng thí nghiệm thiết bị nghiên cứu ; việc bảo quản mẫu vấn đề, khơng lớn Mặt khác, cần thiết bị điện toán để xử lý sổ liệu Nđi tóm lại, qui trinh chọn lọc nhờ thị dựa vào PCR sử dụng kỹ th u ật PCR để tạo thị liên kết với gen đích Quy trình gồm bước sau : Tầch nhanh ADN để dùng cho phân tích PCR Nhân ADN nhờ kỹ thuật PCR 154 KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG CỦA NÓ TRONG CHỌN GIỐNG THựC VẬT Xử lý sản phẩm PCR enzym cát giới hạn Phân tích gel (phổ điện di) sản phẩm PCR Xác định m ang gen đích dựa thị PCR Cần nhớ ràng, trước tiến hành chọn lọc nhờ thị dựa vào PCR cần phải xác định gen đích cần chọn lọc phải cd sẵn thị dựa vào PCR Nếu gen cần nghiên cứu chưa xác định đồ thỉ cần phải lập đb gen với thị ADN 8.4.3 Đánh giá phương pháp chọn lọc nhờ thị (MAS) dựa vào PCR Sự phát triển nhanh chóng kỹ th u ật dùng thị ADN đâ cung cấp cho nhà khoa học công cụ lĩnh vực chọn giống Lợi ích phương pháp chọn lọc rút ngắn thòi gian chọn lọc tính trạ n g khơng th ể đánh giá khd đánh giá bàng phương pháp chọn giống thống thường; vỉ thế, nố làm tảng hiệu chọn giống T\iy nhiên, cd ba hạn chế cho việc áp dụng phương pháp chọn lọc này: Tốc độ lập đồ gen rấ t chậm; vỉ thế, số lượng gen cung cấp cho MAS bị hạn chế Hơn nữa, nhiều gen đưa vào (ft xa thị đâ biết (liên kết không chặt) nên sử dụng cho MAS Cần phài cd kỹ th u ật thúc đẩy trinh lập đồ gen, cho cd số lượng lớn gen sử dụng cho MAS Hiện chi cổ sổ lượng hạn chế thị PCR sử dụng cho MAS Việc sử dụng MAS tốn Mặc dàu vậy, ta co thể hy vọng khd khán giảm bớt tương lai phương pháp MAS dựa kỹ th u ật PCR chiếm vị trí quan trọng trỉnh chọn giống nhiều trồng c o s ỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT 155 TÀI LIỆU THAM KHẤO CHÍNH Chopra V.L., (Ed.), 1989 Plant breeding- theory and practice Oxíord & IBH Publishing CO PVT LTD, NevvDelhi, Bombay & Calcutta; 466p Chopra V.L and A Nasim, 1990 Genetic engineering and biotechnology Oxford & IBH pubỉishing Co PVT.LTD, New Delhi, Bombay and Calcutta, 200p Kochert G., 1991 Introduction to RFLP mapping and pỉant breeding applications The RockefelIer Poundation, International program on Rice Biotechnology; 15p Grierson D (Ed.),1992 Plant genetic engineering Chapman & Hall publishers Glasgovv, London and New York; 38-59p Hayvvard M.D., N.o Bosemark and I Romagosa,1994 P lant breeding Chapman & Hall publishers London, New York and Tbkyo; 550p M urray D.R (Ed.), 1991 Advanced methods in plant breedÌDg and biotechnoỉogy CAB international publishers, London; 365p M urray M.Y (Ed.), 1992 Plant biotechnology Pergamon press, Oxford, NY, Seoul, Tbkyo; 317 p Pam ela p., 1993 Biotechnology: A guide to genetic engineering WCB Publishers USA 253 p Paolelỉa R, 1998 Introduction to molecular biology WCB publishers Boston, New York, Caliíornia and Missouri; 24Ip 10 Ryu D.D.Y and s Furusaki,1994 Advances in plant biotechnology Elsevỉer, Ámsterdam, NY, London & T\)kyo; 371 p 11 Weaver R.F and p.w Hedrick, 1997 Genetics WCB publishers ỉx>ndon, Sydney, Tbkyo and Tbronto; 638p 156 MỰC LỤC MỤC LỤC Lòi giới thiệu Lời đầu Trang Chương Hệ thống di truyền kiểm sốt tính khơng hợp thực vật 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 Mở đầu Tính khơng hợp trạ n g thái thể giao tử Tính khơng hợp trạ n g thái thể bào tử Tính khơng hợp đa hỉnh Tính hợp giả Hiện tượng đa bội lai xa với tính khơng hợp Mối quan hệ tính khỗng hợp với kiểu hạt phấn Hiệu ứng sinh lý, sinh hố chăt ph&n tử tính khổng hợp Nguyên tấc sừ dụng tính khỏng hợp chọn giổng theo ưu th ế lai g 10 10 11 13 15 Chương ưu lai ứng dụng chọn giống thực vật 2.1 Khái niệm tượng ưu th ế lai 2.2 Khái niệm dịng tự phói sử dụng ntí chọn gỉổng 2.3 Di truyền tính bất thụ đực phương pháp sử dụng nđ chọn giống 2.4 Cơ sở lý luận di truyền học ưu lai vấn đề trì nd hệ sau 17 18 23 34 Chương Di truyền da bội thể ứng dụng chọn giốnjg thực vật 3.1 Khái niệm tượng đa bội thể ph&n bố nổ tự nhiên 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 Phân loại kiểu đa bội th ể Các đường hình thành đa bội thể Dặc điểm di truyền đa bội thể Các phương pháp g&y đa bội th ể thực nghiệm Phương pháp chọn lọc đa bội thể Những hiệu ứng tính đa bội Một số thành tựu nguyên tác phương pháp chọn giống đa bội thể 43 44 45 47 57 60 62 64 co s ỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 157 Chương M ột số vấn đ ề p h t sinh d ộ t biến thự c nghiệm tr o n g chọn giống th ự c vật 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 Vài nét mở đâu Tầc dụng đột biến chọn giổng Ấnh hưởng đặc tính di trun vật ìiệu đến phát sinh đột biến Các kiểu tác nhán gây đột biến Quá trỉnh phát sinh đột biến việc nghiên cứu chúng qua th ế hệ Một số thành tựu nguyên tác phương pháp chọngiống đột biến 67 68 69 70 82 94 Chương L tê bào som a 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 Mở đàu Tầch protoplast Dung hợp protoplast Nuôi cấy protoplast tái sinh Chọn lọc sản phẩm dung hợp Con lai dung hợp nhân Con lai dung hợp tế bào chất Một số thành tựu kỹ thuật lai tế bào soma 98 98 99 100 101 102 102 106 Chương ổ Ký th u ậ t ch u y ển gen ứng d ụ n g củ a tr o n g chọn giống th ự c vật 6.1 6.2 6.3 6.4 Mở đầu Một số nguyên tác sinh học việc chuyển gen Khái niệm chung vectơ sừ dụng kỹ thuật chuyển gen Các phương pháp chuyển gen 6.5 Tiêm nâng vầ han chê củã kỹ thuật cìhuyển gẽfì 107 109 110 111 126 Chương Ký th u ậ t K FLP tro n g nghiên u di tru y ề n v c h ọ n giông th ự c v ật 7.1 7.2 7.3 7.4 Đại cương RFLP Thư viện thị phân tử Lập đò di truyền RFLP So sánh việc xác định gen phương pháp di truyền thông thường với phương pháp RFLP 7.5 Xây dựng đồ di truyền cách sừ dụng chi thị RFLP 7.6 Bản đồ RFLP bàn đồ thơng thưịng 7.7 ứng dụng kỹ thuật RFLP chọn giống thực vật 129 130 132 135 136 138 139 158 MỤC LỤC Chương K ỹ thuật PCR ứng dụng chọn giống thực vật 8.1 Nguyên tác kỹ th u ật PCR 8.2 Sử dụng PCR để tách dòng đoạn ADN chưa biết trậ t tự nucleotit chúng 8.3 Sử dụng PCR để lập đồ di truyền 8.4 Nguyên tác sở di truyền phương pháp chọn lọc nhờ thị dựa vào PCR 142 144 146 147 159 PGS TS LÊ DUY THÀNH CO Sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT ChỊu trách nhiệm xuất bản: Biên lập: Sửa chế bán: Trình bàyl^a: PGS.TS TƠ ĐẢNG HẢI NGUYỄN H U Y TIẾN QUANG HUY HƯCTNG LAN NHÀ XUẤT BẢN khoa học ký TIIUẬT 70 TRẰN IIƯNG ĐẠO - HÀ NỘI ... cuói học viên cao học thuộc nhóm chuyên ngành "Co thể thục vật" , n h u di truyòi học, sinh lý học thực vật, hoá sinh học Khoa Sinh học ó Trường dại học Khoa học tự nhiên, DHQG H Nội, Đại học. .. co sô lý luận nguyên lý di truyìn học dược áp dụng vào phương pháp chọn giống thực vật nguyên tác ứng dụng số kỹ thuật sinh học phán tử kỹ thuật di truyền chọn giống căy tròng Cuốn sách Phàn pháp...PGS TS LÊ DUY THÀNH Cơ Sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT ■ ■ ■ Giáo trình dùng cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh, ngành Sinh học trường Khoa học Tự nhiên, Sư phạm,