Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống thực vật: Phần 2

Khi dung hợp protoplast giữa s.. rustica chống được các bệith trên.. A) Sơ đõ chut^ cho vecta hiển nạp cùa tẽ bào Eukaryote.. C) Sỉnễi íổng ỉtợp phylohormon ớ phần mô có [r]

98

Chương 5

LAI TỂ BÀO SOMA 5.1 M ỏ ĐẦU

N hư ta đă biết, khác với tế bào động vật, t ế bào thực vật ctí th àn h tế bào lớp bao Thành tế bào gồm xenlulo (khoảng 20-30 % ), hemixenluỉo pectin Nếu th àn h tế bào bị tách bỏ, lúc đđ tế bào thực vật lộ lớp m àng sinh chất cùng, m trạ n g thái ta gọi tế bào tràn hay protoplast. Khi protoplast tiếp xúc với thỉ chúng cổ th ể hợp n h ất lại làm một, m ta gọi 8ự d u n g hợp protoplast. Nếu protoplast cđ nguòn gốc từ tế bào som a thuộc giống, loài chi khác dung hợp lại thi cđ th ể dẫn đến tượng lai té bào soma (somatic hybrydization),

Vi tế bào thực vật cố thành tế bào, nên trước thời gian dài người ta cho ràn g kỷ th u ật dung hợp protoplâst giới hạn tế bào động vật; m ặc dầu từ rấ t sớm K uster (1909) đă nêu ý tưởng sử dụng phương pháp lai tế bào soma để vượt qua khó khản nảy sinh trìn h lai xa thực vật Mãi nảm 1960, sau nghiên cứu thành cổng Cocking với việc dùng m ột hỗn hợp

e m y m cellulose, pectinase maceroz3nne để tách bỏ th àn h tế bào thực vật, thi kỹ th u ậ t dung hợp protoplast mdi áp dụng thực vật Tuy nhiên, nổ chi thực phát triể n m ạnh m ế cố xu hiỉớng úng dụng tro n g chọn giổng sau kết n ^ i ê n cứu việc tái sinh hoàn chỉnh thuổc từ protopỉast Ikkebe (1971) việc tái sinh thuốc lai dung hợp protoplast hai loài N tabacum với N langsdorffi

của Carlson (1972),

Sự r a đời kỹ th u ậ t protoplast cho phép ngườỉ ta tẹo nhữ ng tái tổ hợp di truyền đơn vị phân loại xa ( loài hay chi) m phương pháp ỉai hữu tính khị khơng đ t Trong trỉn h dung hợp, bên cạnh kết hợp genom nhân, cố th ể xảy hợp n h ất tế bào ch ất protoplast Nhờ vậy, m ột số tín h trạ n g gen tế bào chất kiểm sốt, tính b ất th ụ đực, cố th ể chuyển m ột cách không khó khăn từ sang khác nhờ kỹ th u ậ t

Muốn tiến hành lai tế bào soma càn phải tách protoplast m ột cách nguyên vẹn, cho chúng dung hợp với nhau, làm cho sản phẩm dung hợp phân chia tái sinh chúng th àn h

5.2 TÁCH PROTOPLAST

pháp enzym, nđ cd^hiệu su ẩt rấ t cao m lại không gây thương tổn cho tế bào

Khi thành tế bào tách ra, protoplast phải phóng thích mơi trường cd áp su ất thắm th áu cao để trá n h nước xâm nhập vào không bào, gây vỡ protoplast ( ví dụ, cd th ể dùng dung dịch manitol 0,5 M) Tuy nhiên, thời gian lưu lại khơng nên q dài khiến cho trao đổi chất tế bào cấu trúc màng lưới sinh chất bị tổn hại

Dể tách protoplast, ví dụ từ thuốc trồng nhà kính, tưới thường xuyên 25"C, thỉ thứ ba từ xuống ngiiồn thực liệu thích hợp Lá khử trù n g ethanol 70% vài giây, sau nhúng vào dung dịch hypoclorit canxi 5% rửa nước cất Lá thái nhỏ cho vào đỉa P etri chứa hỗn hợp enzym sau : 0,1 % cellulase, 0,02% macerozyme 0,05% driselase, để qua đêm (khoảng 16 h) Sau đó lọc qua rây cđ lỗ 50 - 80 /ym, rửa bàng dung dịch không chứa enzyxn bầng cách ly tâm

Ngoài lá, người ta cd th ể dùng phần trụ mầm hay rễ làm nguyên liệu tách protoplast Do không chứa diệp lục nên nguồn protoplast dễ phân biệt với protoplast tách từ mô th ịt Một nguồn nguyên liệu khác dùng để tách protoplast tế bào nuôi cấy dạng huyền phù Đôi với hoà thảo, điều cần biết là, cd protoplast tách từ tế bào phôi nuôi cấy dạng huyền phù có khả nảng phân chia tái sinh cao (Fujimura,1985 )

53 DUNG HỘP PROTOPLAST

Lần Carlson (1972) tái sinh thuốc từ protoplast bàng cách cho dung hợp protoplast mơi trường cfịng thẩm tích dung dịch n itra t n atri Còn Melchers (1974 ) dung hợp protoplast củng thuốc môi trường 50 mM Ca + 0,4 M m anitol với pH = 10,5 Môi trường Melchers tỏ rá t thích hợp cho việc dung hợp tế bào chất Sau này, Kao (1974) đả phát chát polyethylen glycol (PEG) cd tác dụng làm tân g hiệu quà dung hợp protoplast; vl nd chất qd lực với nước, làm tăn g tính thẩm thấu tăng bề m ặt tiếp xúc protoplast Chỉ sau vài phút ngăĩh vào dung dịch 20 - 40 % (w/v) PBG (mol Wt 1500 - 1600) hàu tấ t cà protoplast kết dính lại Tuy nhiên, việc dung hợp thực xảy pha ỉông PEG mơi trường có nồng độ cao pH cao (pH=« 10,5) T\iy nhiên, PEG có độc tín h tế bào thực- vật nên người ta thường dùng nồng độ thấp thêm vào m ột DMSO (dimethyl sulíoxid)

Sau này, phương pháp dung hợp nhờ xung điện (electrofusion) Zim m erm an đề xướng (1982) nhièu người áp dụng Nguyên tác phương pháp ; môi trường chứa protoplast đặt hai điện cực; dung hợp xảy ta tạo m ột xung điện với điện th ế cao ( 500 - 10000 v/cm) khoảnh khác 5-6/1000 giây

Với họ cà, hiệu dung hợp phương pháp đ t tới > 50% Càn nhớ là, hiệu su ất dung hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố: m ật độ protoplast, nhiệt độ thí nghiệm, nồng độ PEG, cường độ điện trường nguồn nguyên liệu cho protoplast (tế bào mơ th ịt thường thích hợp mô sẹo rễ cây) Sự cd m ặt m ột lượng lớn không bào h t tinh bột làm giảm khả nảng sống sơt protoplast trin h dung hợp Dưối đâv (bảng 5.1) môi trường Bourgin (1979) dùng cho nuôi cấy protoplast tách từ th ịt thuốc

100 LAI TẾ BÀO SOMA

Bàng 5.1. MƠI trurịrng nuối cấy protoplast thuốc (Bourgỉn, 1979 )

Hoá chất Nồng độ (mg /ỉ) Hoá chất Nồng độ (mg/l)

NH4NOj 825 Inositon KK)

KNOj 950 Calciuiii pantothenat

Ca0 2 H2 2 BẾtXin ,

MgSố4-7H20 185 Axit nicoUi^

KH2PO4 85 PyrỉdcKin

FeSQ,.7H20 27^5 Thiamin

Na2m yrA 37^5 Axit naphthalen acetỉc

Tsắo^ 6-Ben2ylamlnopui1n

H2B Ặ Sucrose 0 0

MnS04.4H2Ơ , Mannitol 80000

CuS0 4^ H2 0,03 p H ^

AIOị 0,03

NICI2.6H2O 0,03

KI ,

5.4 NI CẤY PROTOPLAST VÀ TÁI SINH CÂY

Mơi trường nuôi cấy protoplast khác xa so với môi trường nuôi cấy mô đ ể cho tế báo cổ th ể phfln chia hinh th ành md sẹo Điều khác trư ãc tiên là, mổi trư dng cần phảỉ cd áp suăt thẩm thâu cao lúc ban đầu bầng cách aử dụng m annitol sorbitol ; thứ hai là, mơi trường phẩd ctí nơng độ chất sinh trưởng tương đổi cao Đối với protoplast thuổc nồng độ chất đổ : mg/1 NAA (15 Ịiim.) mg/ỉ benzylam inopurín (5

/im ) - Xem bảng 5.1 M ật độ protoplast / ml phải điều chỉnh cho cd th ể đếm bầng bu&ng đốm hồng cầu Vối thuốc lá, nồng độ đó 60000 protoplast /ml (nốu tế bào cđ kích thước bé thỉ m ật độ ctí th ể tAng lên) Môi trường dịch th ể protoplast cần đ ật trong điều kiộn tổi chứng b&t đ&u phftn chia l&n thú nhát Sau đổ kho&ng tìỉ -6 ngày thỉ th ành tế bào tái sinh (tùy theo loài cây) Cấu trú c tế bào cố th ế quan s t kính hiển vi soi ngược, chúng ni cấy trê n môi trường lỏng THỉy nhiên, nuôi cấy trơn mơi trường đặc thl ta có th ể theo dõi p h át triể n protoplast hinh th àn h từ n g cụm t ế bào bé cđ nguồn góc từ từ n g protoplast

Đ ể chọn lọc đột biến sinh hoá hoậc lai soma ngưdi ta cổ th ể nuỗi cẨy tách riêng protoplast từ ng đĩa P e tri nhỏ mối trường cổ n&ng độ auxin th ấp m ật độ tế bào thấp (1 tế bào / Iml) Với protoplast cải dầu, bàng phương pháp nuôi cấy liên tục cđ thay mơi trường 2-3 lần có th ể thu nhổm tế bào cổ kỉ}ả n&ng tái sinh, sau chuyển chúng san g mối trường đặc tạo ch&ỉ thân

tố bào phơi ni cẩy dạng huyền phù ( thưịng đổi với họ hoà thảo ) thi cụm tố bào v&n giữ nguyẽn khả n&ng phát sinh phối để hinh thành nên phổi Nếu đảm bảo qui trìn h chặt chẽ trên, thi phồi mô phân sinh sỗ hỉnh th àn h sau khoảng -5 tu ầ n lễ Tuy nhiên, trường hợp mà điều kiện th í n i^iộ m khống tổi ưu có biến đối mặt di truyền thỉ xuát thay đổi VẾ sổ lượng nhiễm sác th ể Ví dụ, với protoplast từ khoai tây 2n, tầ n số 2n tá i sinh khoảng 10%, lại chủ yếu 4n

5.5 CHỌN LỌC SẤN PHẨM DUNG Hộp

Giả sử ta cho dung hợp protoplast từ khác thu kiểu tế bào dị nhân (heterokaiyocjrte), có trộ n lẫn nhân tế bào chất (bao gốm ty, lạp th ể tế bào chẫt ) Song, dung hỢp có th ể xảy r a nhãn hoậc tế bào chất chi phần nhân Điều phụ thuộc vào quan hệ lồi Ví dụ, tàn số dung hợp N.tabacum / N.tabacum ỉà 10 ■*, Brassica campetris / B oleracea 0,5 Dể làm tăng khả tái sinh cáy lai, người ta sử dụng số phương pháp làm tản g tỷ lệ tế bào dị nh ân hoậc phương pháp chọn lọc tế bào lai

Dưới đây, ta xem xét sổ kỹ thuật tách sản phẩm dung hợp

1) Gleba (1978) đề xuất kỹ thuật tách ũh&n dịng đổi với sản phẩm dung hạp kính hiển vi, dựa vào sai khác m ặt hinh thái; chẳng hạn cổ m ặ t chloroplast từ protoplast mô thịt khũng cổ m ặt chúng tro n g protoplast cd nguồn gốc từ mô sẹo hay trụ mầm Việc tách tố bào dị nh án tiến hành micropipet

2) G albraỉth (1978) Redenbaugh (1981) đS phương pháp nhận diện sản phẩm dung hợp cách nhuộm huỳnh quang với chất rhodam in isothiocyanat protoplast trước lúc cho dung hợp

3) Các sản phẩm dung hợp tách bàng phương pháp kốt hợp tìí trường với gen thị kháng ehẵt khấHg ẫÌRh Nguyên tấc nhu ẫãu; protoplast dạng A gán phân tử nhỏ cố lực tỉí tính mạnh; protoplast dạng B có gán gen kháng chất kháng sinh (ví dụ kanamycin) Sau thí nghiệm dung hợp, protoplast cho qua cột phàn ly ctí từ tính mạnh; protoplast dạng A protoplast lai gỉữ lại cột, cịn proplast dạng B thỉ tách khỏi cột Hỗn hợp protoplast lai dạng A nuổi căy tro n g mổi trường có kanamycin để tách tế bào lai

4) Các tượng bổ sung di truyền trinh dinh dưỡng dùng r ấ t rộng rãi cđ hiệu để nhận biết sản phắm dung hợp, sử dụng đột biến bạch tạn g hay thiếu h ụ t diệp lục, đột biến sinh hoá thiếu enzym n itra t reductase - NR (Melchers, 1974; Glỉmelius, 1978 ) gen đánh dấu (ctí phương pháp chuyển gen) có liên quan đến tỉnh kháng chát kháng sinh (Hamil, 1984) kháng chất diệt cỏ (Evola, 1983)

- C hẳng hạn, cđ trưịng hợp, ni cấy tro n g môi trư n g thiếu hoocmon ngoại sinh thi tế bào lai có khả nãng cho mỏ sẹo tái sinh cây, tế bào từ n g dạng bó mẹ lại khơng có khả (Power (1977) Shenck (1982))

- Trong nghiên cứu Cocking (1977), dung hợp protoplast dạn g đột

biến thuộc hai ioài Petunia hybrida p parodii, tro n g đổ protoplast từ dạng đột biến albỉno p hybrida cho md sẹo m àu trá n g trê n mối trư òng m d đd protopỉast p. parodii khống cho mữ sẹo, tế bào lai cho mỗ sẹo m àu xanh

• Masson (1989) Thomas (1990) đ a sử dụng phương pháp biến nạp cho hai dạng bố m ẹ : m ột dạng g&Đ gen kháng k an am y d n dạng gán gen kháng hygrom ydn; việc chọn lọc tế bào lai tifo hàn h mữi trường chứa hai loại kháng sinh đđ

N ếu m ột hai dạng bổ mẹ kiểu đột biến sinh dưỡng, ví dụ, kiốu thiếu enz}an N R nén khống th ể sổng tr6n trư ng N O ^d o khống có khả khử N O ^ -*■ N 0J" -* NH3, dạng chuyển gen kiểm sốt m ột tính trạ n g trội - kiểu kháng chất diệt cỏ kháng sinh - th i ta cổ th ế chọn lọc trực tiếp tế bào lai trê n trường tổi thiểu cổ bổ sung chãt kháng sinh chất diệt cỏ (các tế bào bổ mẹ khổng thổ sỔBg binh thườhg được) D ạng lai đ a đa sử dụng d thuổc ỉá cải d&u

5.6 CON LAI DO DUNG Hộp NHẢN

Nhiều dạng lai soma kết hợp nhấib nhân (nuclear hybrid) đa tạo thành cống ỉoài trồng vỗi lồi hoang dại d chi cải dầu; ví dụ, loài

B nigra chứa gen (B) vói ỉồi B napua chúa gen (ÁC) Bàng phương pháp dung hợp protoplast hai loỉd ây, người ta tạo dạng lai chứa gen (ABC) H oặc dung hợp protoplast E n ica sativa vói B napus người ta chuyển gen kháng cỏn trù n g chịu khô <x5 d Eruca vào lai

ỏ khoai t&y (S tuberosum), khả nàn g sử dụng kỹ thuẠt dung hợp protoplast rđt lớn Khi dung hợp protoplast s tuberosum (4n) với ỉoàỉ s brevidena (2n) khống cho củ, người ta đa th u nhẠn m ột dạng OOIÍ lai khác lồi (6n) cho củ, hữu th ụ lại cd khả n&ng lai với tuberosum. M ặt khác, dạng lai lại nhận gen q từ lồi hoang dại gen kháng v irut thường gây bệnh xoăn d khoai tAy trồng gen kháng bệnh vi khuẩn củ

c&n lưu ý'ỉà, mặc dàu dung hợp protoplast cáy thuộc ỉồỉ, chí các khác có xảy binh thường, vỉộc tái sinh cáy có thể khống xảy ra, lai cd sức sổng thãp hoậc b át thụ 'Trong nhỉdu trưdng hợp, g&n toàn m ột phần nhiễm sấc th ể m ột tro n g hai dạng bổ mẹ bị m ất .T\iy nhiên, diồu lại dán đến m ột hiộu ứng lý thú khác-, lai n h ận m ột số nhiễm 8ấc th ế hay m ột đoạn nhiễm sác th ể m ột tro n g hai dạng bố mẹ, chứng lại chứa gen cd ích cliị mục đích chọn giổng Bàng phương pháp xử lý phdng zạ, người ta làm đ ú t nhiễm sác th ế th ành đoạn nhô chúng chuyển vào genom th ế nhận sau trìn h dung hợp protoplast Ch&ng hạn, hoạt tín h gen N R d c&y thuốc đột biến N R ~ khdi phục sau protoplast nđ dung hợp với protoplast lúa mỉ chiếu xộ Theo cách nhu vậy, người ta- đă chuyển nhiều gen kháng bệnh từ loài sang loẳứ khác thuộc chi cải dầu

5.7 CON LAI DO DUNG Hộp TẾ BÀO CHẤT

l y lạp th ể chứa gen tương đối bé nhỏ 80 vâi hệ gen nh&n Chúng chứa lượng ADN m ã hoá cho khoảng 10% poỈ3rpeptit đảm bảo cho chức n an g

quan tử, phàn 90% lại gen n h ãn m ã hoá chuyển qua m àng

cơ q u an tử Các quan tử phân bố m ột cách n g ỉu nhiỗn vào tế bào qua th ế hệ tế bào Trong sinh sản hữu tính, quan tử chung chuyển qua giao tử Trong đổ, nhờ dung hợp protoplast mà ta cđ tượng góp quan tử có tro n g tế bào chất từ hai dạng bố mẹ Sản phẩm dung hựp có th ể chứa nh&n, ty th ể lạp th ể tù hai dạng bố mẹ Nhưng, có th ể chi chúa nhân dạng bố mẹ tế bào chát thi lại hai D ạng lai ctí tên gọi con lai tế bào chất hay cybrid.

ỗ.7.1 Dung hợp protoplast trao dổi tế bào chát

Trong trường hợp mục đích thí nghiệm phối hợp nhân dạng bố mẹ với to àn tế bào chất dạng bố mẹ như, khả kết hợp nhân hai d ạn g cao, người ta có th ể chiếu xạ dạng bđ mẹ cho tế bào chát (cytoplasmic donor) tia X hay tia gamma Bằng cách xử lý vậy, tia phổng xạ khồng g&y hiệu đột biến đến hệ gen quan tử, vỉ nđ cổ nhiều tế bào Còn đổi với dạng bố mẹ nhận nh&n (nuclear recipient) thỉ ngưòi ta loại bỏ quan tử tro n g t ế bào ch ất cách sử dụng chất ức chế trao đổi chât, iodoacetat hay iodoacetamid

5.7.2 Dung hợp protoplast tạo tái tổ hệ gen lạp thể

Trong sản phẩm dung hợp, lạp th ể phân ly ngẫu nhiẻn vào th ế hệ tế bào k ế tiếp Cũng cd tượng, tro n g m ột cụm tế bào chi tồn lạp th ể m ột hai dạng bổ mẹ iai nhân hay lai tế bào chất

Các nghiên cứu lai som a hai ioài thuổc thuốc với họ cà cho th cd tượng tái tổ hợp genom ỉạp th ể (Thanh & Medgyesy,19ỗ9) Thí nghiệm nối trê n sử dụng c&y đột biến lạp th ể kháng chăt kháng sinh bạch tạng Theo phân tích Fẹjes (1990) trẻ n thuốc iá thỉ, tái tổ hợp xuát trao đổi chéo

Lạp th ể Lạp thổ

N tabacum N plum onoinitoba

ch' str'' (+ ) ch'*' stĩ*

ị

Cụm tế bào p h át triể n môi trường cđ streptom ycin

i

Chọn lọc cụm xanh ị

l ầ i sinh m ang lạp th ể tái tổ hợp

5.7.3 Dung hợp protoplast tái tổ hợp hộ gen ty thể

T ính b ấ t thụ đực tế bào chất cổ ở nhiều loài thực vật tỉn h trạ n g di truyền kiểm soát hệ gen ty th ể (Lonsdale, 1987) N hững phân tích v6 tính đa hinh chiều dài phân đoạn cát giới hạn (RFLP) đổi vối ty th ể lai soma hay cybrid

ở Petunia hay Brassica (Rothenberg, 1985; Vedel, 1986) cho thấy có tượng tái

tổ hợp genom ty thể

ỏ cfly thuốc lá, đem dung hợp protoplast m ột ỉoài hữu thụ với m ột lồi băt th ụ đực tái tổ hợp xảy ty th ể đâ dẫn đến chỗ làm cho hỉnh thái hoa cAy ỉai khác so với hai dạng bổ mẹ ban đầu (Kofer, 1990) Hiện tương tái tổ hỢp xảy hệ gen ty th ể đâ tìm thấy nhiều lồi thực vật Diều mở khả cố th ể tạo trao đổi gen ty th ể ỉoài

5.7.4 ÍÁp dụng dung hợp tế bào soma dể cải tiến giống trồng qua hệ thống quan tử

Từ sơ đ& trê n hinh ỗ l ta thấy, m ặt lý thuyết cố th ể cố sản phẩm sau trin h dung hợp protoplast hai dạng bổ mẹ khác vS hộ gen lạp th ể (dạng trõ n )v ty th ể (dạng sao), ta xem xét đến khả năng: việc loại trừ hệ gen ty lạp th ể m ột hai dạng bố mẹ kiểu tái tổ hợp khác xảy hai dạng bố N hìn chung, tái tổ hợp xảy trường hợp phổ biến

Các hệ gen lạp th ể khác tbn chung m ột tế bào thường xảy tá i tổ hợp, nhđt ỉà trường hạp khổng có cạnh tra n h chúng Ngược iạỉ, hệ gen ty th ể thường hay xảy tái tổ hợp Hệ gen tái tổ hỢp trl cybrid tá i sinh ở hậu Vi thế, cấu trú c hay gập cybrid cố m ặt tế b&o tái tổ hợp ty th ể genom lạp th ể tro n g hai dạng bố mẹ ( trường hợp số sơ d& trẽn)

Chuyển tẽ bào chất bất thụ đực vào căy trầng

B àng phương pháp dung hợp protoplast ta cđ th ể chuyển tế bào chăt bất thụ đực vào giống cáy trSng hữu thụ Uiảc nhau, điều mầ bàng phương phặp lai trở lại thống thường ta phải tiến hành qua - lần la i.ỏ cfly lúa, ngưòi ta tá i sinh cybrid chúa nhân giổng hữu th ụ ty th ể tái tổ hợp từ hai dạng bố mẹ nhứng cổ tính băt thụ đực tế bào chất dạng bất thụ đực (Kyozuka, 1989) Cũng thố, G upta (1996) chuyển tố bào ch ất b ấ t thụ từ dòng CMS m ang ký hiệu V20A sang dịng trì phục hồi hữu th ụ RCPL1-2C, V20B IR36, thuộc nhdm ỉúa Indica. Bằng phương pháp tương tự r.hư vậy, người ta th àn h cổng tro n g việc chuyển tế bào chất b át th ụ đực vào giổng hữu thụ ở báp CÂÌ, cà rốt củ cải đường (Prim ard, 1988; 'Iknno- Suenaga, 1988; Krens, 1990) thuổc lá, K um ashiro (1988) tạo m ột kiểu b t th ụ đực tế bào chất nhờ việc dung hợp protoplast loài N tabacum với protoplast đă chiếu xạ loài N. africana. Đối với c&y cam quít, tính bất th ụ đực d giống có khỗng h ạt có ý ng^ĩa kinh tế lón Vardi (1989) tạo r a cybrid bất thụ đực cho khống h t ở nhdm

Cái tiên hệ thống bđt thụ đực tế bào chất Brassica

Các trống thuộc chi Braasica có nhiều lồi rau cho dầu, báp cải cải dầu Cải dầu ỉà loại cho dầu quan trọ n g thứ ba, sau đậu tương cọ

co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GlốNG THựC VẬT 105 dàu Đế sản x u í t ỉai Fj thường ngưịi ta sử dụng tính khổng hợp chúng N hưng đidu khòng cho phép áp dụng ở qui mô lớn Vỉ thế, c&n cổ m ột hộ thống kiểm soát cổ hiệu th ụ phân thống qua tín h b t thụ Tính bất thụ đực tế bào chất củ cải cd th ể chuyển qua c&y báp cải nhờ phương pháp lai hữu tính khác lồi; lai th u m ặc dầu cố tín h bất th ụ đực cỡ quan sinh sản lại cố tín h hữu thụ Bằng phương pháp dung hợp protoplast ngưòỉ ta đa tạo tta o đổi lục lạp tái tổ hợp ty th ể củ cải báp cải TVong trin h chọn lọc cybrid, người ta đă tách b ấ t th ụ h t phấn quan sinh sản p h t triể n binh thường cổ khả n in g k í t hợp cao

( + )

ị

6

N hững kết nghiên cứu báp cải củ cải cho thấy, chl cđ phàn nhỏ genom ỉạ càn đưa vào trồng, phàn đtí kiểm sốt tính trạng kiểu bất th ụ đực t ế bào chát Điều chứng tỏ rằng, tượng tái tổ hợp ty th ể cho phép loại bỏ nhữ ng tính trạn g khững tốt m ặt chọn giống

5.8 MỘT s ó THÀNH T ự u CỦA KÝ THUẬT LAI TẾ BÀO SOMA

Trong hai thập kỷ qua người ta đă đạt nhiều tiến kỹ th u ật dung hợp pĩX)toplast, từ việc tách, dung hợp protoplast đến tái sinh nhiều loài trùng D ung hợp protoplast đường có hiệu để khác phục nhiều khó khăn gặp phỉd trìn h lai hữu tính khác lồi khác chi Kỹ thuật cho phép tạo th ể có tái tổ hợp gen lồi đa bội hoậc có quan sinh sản hữu tín h p h át triể n

Sau m ột số thành tựu việc ứng dụng kỹ thuật dung hợp protoplast việc cải tiến giống cày trồng

- ở chi cải Brassica, nhờ dung họp protopỉast mà người ta tái tổng hợp loài

Brassica napus từ hai loài B oleracea B campestris.

-ở thuốc lá, loài N.tabacum dễ nhiễm vi khuấn gây bệnh đốm lửa nấm đen; đó, ỉồi N rustica chống bệith Con lai hữu tính hai loài bát thụ N hưng lai soma chúng lại hữu thụ cổ khả nâng kháng bệnh kể trôn

- ỏ c&y họ cà, nhờ kỹ thuật dung hợp protoplast mà người ta tạo lai som a khoai t&y với loài khác chi Solanum, vốn khổng lai với phương pháp hữu tính, mà lại cố tính kháng bệnh cao

- ỏ họ đậu, kỹ thuật dung hợp protopỉast người ta tạo lai soma cỏ ba {Trifolium repens) với Međi (Medicago sativa) sử dụng việc sản xuất chđt tanin tit Tương tự vậy, lai soma đậu tuang trồng với lồi hoang dại - ví Glycine max với G tom m tella • tạo

- ở lOa, tròng chựợRg trinh hợp tốG nghiên eđy giSa IIQII với TVưbng DH Tổng hợp N o ttỉn ỉ^ a m (Anh), nhờ sử dụng kỹ th u ật dung hợp protopỉast Dgười ta tạo m ột sđ giống lúa cổ tính bát thụ đực tế bào chất lại cđ khả chổng chịu s&u bệnh nhiệt độ thấp

- Riêng lúa mi, mậc dầu người ta đâ bỏ rấ t nhiều công sức để nghiên cúu nổ, ng kết thu lỉnh vực rấ t hạn chế

107

Chương 6

KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ TRONG CHỌN GIỐNG THựC VẬT

6.1 Mỏ ĐẦU

6.1.1 Khái niệm chung

Xét cà góc độ kỹ th u ật di truyền thực vật sinh học thực vật ndi chung, kỹ th u ậ t chuyển gen m ột cơng cụ có tiềm viêc giải m ột số vấn đề đại sinh lý học, sinh hoá học, sinh học phát triển di truyền học Rố ràn g kỹ th u ậ t chuyển gen thực vật sỗ tác động mạnh đến phát triển kỹ th u ậ t tách dòng gen, giúp cho việc làm sáng tỏ mối liên hệ kiểu gen với kỉểũ hinb; tạo thành tựu to lớn việc xác định gen có lợi nghiên cứu lý thuyết ứng dụng

N hững bước phát triể n kỹ thuật chuyển gen thực vật đả bát nguồn từ th àn h công hệ thổng chuyển gen động vật cđ vú nấm men 'I\iy nhiên, khác với động vật, kỹ thuẠt chuyển gen thực vật trở nên phức tạp sổ lượng lớn lồi tính đa dạng chúng Mặt khác, thân qúa trỉnh gập nhiều trở ngại lớn, thành tế bào thực vật hàng rào ngàn chặn rá t hiệu xâm nhập phân từ ADN Cịn đối vói tế bào sinh dục hay hợp tử th ỉ ADN khổng cổ khả lọt vào Phữi non thi rấ t bé bao bọc lớp m àng cứng Các t ế bào mữ ph&n sinh không cho phép gen hoạt động cổ th ể tới Hơn nữa, kỷ th u ậ t thụ tinh in vitro sử dụng cho thao tác đổi với noãn, hợp tử tiền phôi ỏ thực vật chưa phải dễ dàng ỏ động vật

108 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ỦNG DỤNG CỦA NÓ

t ế bào som a cđ khả n&ng đđ

Kế từ 1984, lức người ta b t đầu gẫy tạo cAy chuyển gen, đến kỹ th u ật đa có bước tiến rẩ t lớn Những th àn h cống nổ khững chi giới hạn m ang tính chất mỗ thuổc họ cà, m đ t kết ÚDg dụng d số c&y trống quan trọng (xem bảng 6.1) vì thế, có sở để hy vọng rầng, tương ỉai kỹ th u ậ t gen trd thành cống cụ hỗ trợ khỏng th ể thiếu chọn giổng thực vật

6.1.2 Các c&y chuyển gen

N hững cáy chuyển gen, m đổ gen di truyền theo kiểu Mendel, khống giới hạn d c&y ” mố hình * thuổc lá, Petunia, Arabidopsia m bao gồm r ấ t nhiều loỀũ c&y khác, danh sách bảng 6.1 đ&y

Bảng 6.1. Các loài trỒDg đă đirọx chuytn gen

Cây trồng Tãt Uệu tham kbảo

Lúa (Oryza sattva ) Shimamoto et aL(ỉ989X Datta et (1990 )

Ngô (Zea mạys) Donn et al<1990), F t a ^ et (19^>

Lùa mì Ợriticum aestivum) VasO and Vasll (»92)

Đậu tucmg (Glycừư mac ) Htachee ct al (1988), Chístou (1992>

Bâng (Goísyplum hừsutum) Flroazabada et aL (1987),Periak et al (1990> *

Khoai tây (Solamm tuberoam) DeGrecí et aL (1989), Lavraon et al (1990> Cà chua (LyccỊỉersiccn esculerưum) Timier et aL (1987), Smlth ct aL (»88, 19W> Cải d&i (Brassica napus) Gucrchc ct al (1987), Radke ct àl (1988>

Đậu Hà Lan {Pừum ỉotịvum) Puonti-Kaerias èt aL ((1990>

Bắp cảl (Broĩstca oleraexđ) Toríyama et aL (1991>

Đu đủ (Carlca papi^a) F its^ et aL (19%>

Tão tỉy {Aíabir panulà) Jatncs et íà. (]989> Lambert (1991>

Cỏ đufll bâu Ợestuca anmdinacea) >Afang et aL (Ỉ992)

Cỏ nốn ựìactylừ glomerata) Horn et aL (1988>

Linh Bng {Medicago sattva) Shahin et aL (B86XH10 et al (1991>

Rau d íp {Lactuca sattva) Chupcau et aL (1989)

Nho {ỵuis rupestrừ : V vừiựera) Mullins et aL(1990>

Mận (Prumis domatica) Maite et aL(&91>

Dương (Pepulus dba X grandidenma) I^tỉxxid et aL (1987>

Ĩc chố ựugìans regia) McGranahan et al (1988)

câm ciiuớng (Dianlhuỉ cayophyưus) Lu ct aL(1991>

Dă yên (Peĩunia hybrtda) Van dcr Ktoí et aL (1988>

6.2 MỘT SÓ NGUYÊN TẤC SINH HỌC CỦA VIÊC CHUYỂN GEN

c<5 m ột số yếu tố sinh học ảnh hưởng đến trỉnh chuyển gen Biết điều ta th iết kế thí n ^ iệ m cho thích hợp Khống phải tấ t tế bào

cơ th ể cd tính tồn thế; khác cổ phản ứng khổng giống với xâm nhập m ột gen lạ Một loại nâo đđ cđ th ể biến nạp cđ khả nâng tái sinh chấp nhận biến nạp Mữ t ế bào tập hạp nhiều tế bào cổ phản ứng khác gặp m ột yếu tổ tá c động tới Một sổ tế bào có khả tái sinh tiếp nhận biến nạp N hững tế bào khác chi có hai khả Một số lượng lớn tế bào tro n g th ể có th ể điều chỉnh khả nảng đtí, m ột số khác, ngược lại không làm điều Tương quan quằn th ể tế bào kiểu tuỳ thuộc vào loài, kiểu gen, cớ quan, chí tùy vùng quan Một chế có th ể chuyển tế bào từ trạ n g thái tiềm ẩn sang trạ n g thái thực cđ khả n àn g tái sinh xuất thương tổn thể Phản ứng với thương tổn có lẽ sở sinh học cho tăn g sinh tái sinh tế bào soma Tuy nhiên, phản ứng khác loài cây, nhóm tế bào m ột Ntíi chung, hồ thảo ctí th ể họ đậu nữa, phản ứng rấ t yếu Thành tế bào ngăn cản xâm nhập ADN thế, gen có th ể đưa vào tế bào thông qua Agrobacterium, virut, phương pháp vi tiêm hay súng bán gen Và, việc chuyển gen th àn h công đưa gen vào nhdm tế bào có khả n ăn g tái sinh tiếp nhận gen lạ TViy nhiên, khả biến nạp khống cổ liỗn quan chặt chẽ đốn khả n ă n g biểu gen biến nạp ADN v in it cđ th ể liên kết với hệ gen vật chủ khững di chuyển từ tế bào qua tế bào khác TVong thỉ, ADN virut lại khống liên kết với hệ gen vật chủ, chí nổ có rấ t nhiều tế bào vật chủ ADN, ARN kiểu virut di chuyển từ tế bào qua tế bào khác cd th ể lan truyền kháp cây, trừ vùng mỡ ph&n sinh

Phản ứng cùa loại tẽ bào thực vật với trình chuyển gen

Mục đích qui trìn h chuyển gen đưa cách ổn định đoạn ADN vào hệ gen nhân tế bào có khả phát triể n thành m ột biến nạp Nếu biến nạp xảy mà khỏnịg có tái sinh kèm theo, tái sinh diễn mà khơng kèm theo biến nạp thí nghiệm biến nạp chưa thành cơng, rấ t nhiều lồi thục vật điều khd khăn ỉà phải xác định cho kiểu tế bào c&y có khả tiếp nhận biến nạp H t phấn hay t ế bào trú n g sau biến nạp cd th ể dùng để tạo biến nạp hồn tồn, thơng qua q trìn h thụ tin h bình thường H ạt phán thường coi đối tượng lý tưởng để gây biến nạp Trong đd, việc biến nạp gen vào hỢp tử in vivo hay in vitro lại gập nhiều khó khăn TVong trường hợp này, người ta thường phải kết hợp với kỹ th u ậ t cứu phôi Việc biến nạp gen đổi với tế bào đơn mô phức tạp phôi hay mỗ phân sinh thường cho khảm

Từ nhiều th ập kỷ qua người ta biết rằng, tính tồn th ế tế bào thực vật đă tạo điêu kiện cho tái sinh hoàn chinh in vitro qua trin h phát sinh quan (hỉnh thành chồi) hay phát sinh phôi Các chồi b ất định hay phôi hình thành từ tế bào đơn hoạt hoá phận dễ dàng tiếp nhận biến nạp có khả cho biến nạp hồn chỉnh (khỏng có tính khảm) Bảng 6.2 nêu lên khả sử

110 KỸ THUẬT CHUYỂN QEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ d ụ n g c c l o i t ế b o k h c n h a u v c c h p h t h iỘ D c c cAy b i ế n n p

Bàng 6.2. Phưvng pháp thu nhận biến nạp từ kỉều tế bào khác

Kiều tế bào Phiibng {diáp thu nhận cãỵ uến liạp

1/ T í bào nuồi cấy

2/ Pbũt chưa chín hỉ^ tế bào phân sinh cơ quan

3/ Các tế bào pbũi chưa chín mơ phân sinh hoa

4/ Hạt phấn

5/ Hợp tử

Sự phát sinh quan hay phát sinh phối qua pha cailus Tái sinh cậy in vitro từ dòng tế bào biĩn nạp

Sự phát triền tỉếp tục pbâl, chãi hay hca cho niột ktaảm Hạt pìứia cố ngn gốc từ dịng t£ bào biến nạp sử dụng chũ việc tạo hạt đuợc biến nạp nhờ uình ưiụ tinh bình thường

Tạo biến nạp trực uếp qua đường thụ tinh V Ớ I hạt phấn

nảy mầm hạy hạt phấn chín phát tilèn mà ADN nố đầ b| xử lý bềến Ịiíp

Phát triền trực tlỉp biến nạp

6 KHÁI NIỆM CHUNG VỀ CÁC VECTỮ s DỤNG TRONG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN

Cáp vectơ sử dụng biến lịạp di truyỄn t ế bào Eukaryote chung hay t ế bào thực vật riông cổ sổ dặc điếm chung (hinh 6.1.A) P h ần ỉớn vectơ đdu cố chứa thành phán sau; l)_gữn khdỉ động (promotor) thường có nguốn gổc liốn quan trực tiếp với thực vật, CaMV-SSS-promotor, 2) m ột đồạn kết thúc (term in ato r), thưỜDg dùng phổ biến 1& noa-terminator hay CaMV-35S-term inator, đoạn kết phải cd trậ t tự tín hiộu polyadenin hố AATTÂÂ ÂÂCCÂ, giúp cho mARN bền vững hơn; 3) đoạn chịu trách nhiệm cho

B

GcnkhánB kháng sinh VK

Promotor oA aryote ^

V ù n » 'c h a tín hiệu poầyademnhố

Gcn cUtlii chọn lọc

r

r

ĐoạnmAhoAgen kháng kháng slidi

vi khuẩn

quá trỉn h tái bàn, có nguồn gốc từ vi khuẩn, CoỉEl; 4) đoạn chứa m ột số tr ậ t tự nucleotit đặc trư ng cho nhận biết enzỵm giới hạn MCS (muỉticloning sites); 5) gen thị, cho phép nhận biết tố bào biốn nạp nhờ trìn h chọn lọc t ế bào vi khuắn sàng lọc d mô tái sinh Các gen cổ tính trội cổ nguốn gốc từ vi khuẩn, m hoạt động chúng chịu kiểm soát prom otor kiểu

Eukaryote, thường từ v init khảm thực vật (hỉnh 6.1.B) Người ta thường dùng gen thị kiểm sốt tính kháng chất kháng sinh kanamycin, m ethotrexat hay ch ất diệt cỏ, glyphosat bialaphos Để cho việc chọn iọc cổ kết thi t ế bào xử lý biến nạp phảỉ m ẫn cảm với chất trê n nòng độ tương đối thấp Còn gen thị dùng để sàng lọc thường gen vi khuẩn m ã hoá cho enzỵm dễ p h át chloramphenicol acetyl transferase, ^-glucuronidase, luciĩerase, nospalỉn sy n th ase octopine sy n th ase.' Thông thường, người ta hay sử dụng tín h kháng kanam ycin để làm kiểu hình thị cho việc chọn lọc ctí m ặt ^-glucuronidase để làm thị cho sàng lọc tế bào thực vật biến nạp

Các plasm id m ang yếu tố chung lại có thêm gen thị đặc biệt cho phép xác định biểu gen cần đựơc chuyển ỏ tế bào thực vật cổ th ế dùng để chuyển gen trực tiếp vào hệ gen nhân thực vật

Một m ặt khác, người ta lại thiết kế kiểu vectơ đặc biệt, đó có sử dụng thêm m ột ph&n plasm id vi ỵhnẳn AgrobacỀerium y k thực hiộn trỉnb biến nạp tự nhiôn thống qua hoạt động loại vi khuẩn Loại vectơ cổ chúc chuyển gen phổ tá i rộng, cho phép tiếp hợp E x o li với Agrobacterium trỉ plasm id hai loại vật chủ đổ

K.4 CÁC PHUữNG PHÁP CHUYỂN GEN

Hiện nay, cổ n h iỉu tài liệu đs cập tdi phương pháp chuyển gen khác thực vật Tuy nhiên, ctí thể nẽu M n phương pháp đa đựơc áp dụng th àn h công ở m ực vật :

1- Biến nạp gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium (Binns, 1990) 2- Biến nạp trực tiếp qua protoplast (Paszkowski, 1989)

3- Biến nạp bàng súng bắn gen - gene gun hay biolỉqtics (Sanford,1988) 4- Biến nạp bàng vi tiêm - microinjection ( Schnorí e t al.,ỉ991 )

6 ỉ C h u y é n g e n n h iAgmbacterium

Vào đầu thố kỷ XX ngưòi ta biết đỂa hai loài vi khuẩn sống đSt Agrobacterium tumefaciens A rhừogenea gây bộith kh(fi u hỉnh chđp lổng td d phần cổ rS nhiều hai m&m v s sau, người ta đ& xác định ràng, hai ỉoại vi khtiẩn chứa hai loại plastnid cổ kích thước Idn Tí-plasmỉd , gây kh<fi u (tumour indudng = Tỉ ) Ri-plasmid, gây lông tơ (root indudng = R i ) Dđ vectơ od khả chuyển sổ gen chúng sang tế bỄUỉ thực vật Quá trình cổ tương tác vi khuẩn chủ TVong nhiều thập ^ qua, khía cạnh sinh học tượng đa ns^iên cứu kỹ I k đề cập tới nổ phần sau

• 'Ti-plasmid nhân tế gây biẽn nạp tự nhiên thực vậí

P h àn lớn loại Ti-plasmid cđ kích thước khoảng 200kb gòm bốn vùng A, B, c

112 KỸ THỤẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ D

Vùng B cổ liỆn quan đến tái sinh Vùng c cd liéa quan đến tiếp hợp

Vùng A luốn iudn truyền sang tẽ bào thực vật nên cd tên T-ADN (transĩerred ADN) - hlnh 6.2.1 l ỵ ctí hai hộ gen : 1) hệ gen gây khối u onc (oncogenic), ntí chứa n h ất gen chịu-^ách nhiệm tổng hợp phytohormon auxin cytokỉnin (hỉnh 6.2C) đổ cd liốn qnan đến việc sản sinh trỉ phân chia tế bào liên tục; 2) hệ

A

■ ■ M T - A P N :

V t e « d Ị Ị « c c h u ] r i v o d k ỹ đ ỉs« y k M lo

VàngtwmgdAiitctai« chomviTI-planM

VừDgslV<4c (Ỹlr)

B

vàosaAỵ kbỐlD(Oiic)

Phtagiii

TKphop plasnM

yừttgOnc

I I

"shooty" "rooly" locus locus í— ^ - M -1

tnu ỉms I tmr

TOOCCCATATATATCTGCTCTAAÀC TCACAGCATATATTGCCCCGTAAAC

tryptopluB ị ^ ị ladoi-3acctamkl

Ii^nt

amteohydrolase

tms 2 Ị ị

ị

lAA (AUHN)

dlMthylallyipyroplHMplul

(DMA)^AMP

tnir

mmiMmt

DMA*tnMfcr»M 5* moDOphosphat

noors

ị

bopenienyladeoasln (CYTOKIHIM)-^SHỎOTS

co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 113 gen m ã hố cho số enzym điều khiển q trình tổng hợp dẫn xuất axit am in hay đưòng, gọi opine. Hai loại enzym nghiỗn cứu kỹ n h ấ t octopine synthase nopaline synthase

Vùng D ctí tên gọi vùng độc (virulence region), chứa gen vir, giữ vai trò quan trọng tro n g việc chuyển T-ÂDN vào hộ gen nhAn tế bào thực vật

Ngoài ra, Ti- plasmid cịn chứa gen'nầm ngồi vùng T-ADN m ã hoá cho enzym phân giải opine dế làm nguốn dinh dưỡng cacbon nitơ cho vi khuấn Dưới đfty ta xem xét tiết cáu tạo chức vùng T-ÁDN vùng vir

• T-ADN trật tự biên 25bp

Vùng T-ÁDN cố kỉch thưỏc từ lOkb đến 20kb, Đ ằ m kẹp hai trẠt tự 25bp lặp iại khỗng hoàn chỉnh gọi biên trái ( Ieft border ==LB) biên phải (right border sR B ) 'Ibàn phần giới hạn hai đoạn biên chuyển sang t ế bào thực vật LB RB yếu tổ c&n thiết để định hướng cho chuyển ÂDN Viộc m ất 6bp đàu tiên lObp cuổi sổ 25 bp ngăn cản chuyến T-ÂDN Quá trìn h chuyển T-ADN b át đầu từ vị trí RB kết thúc vị trí LB Sự định hướng r ấ t quan trộng, khổng việc chuyển sỗ hiệu IVong gen m ã hoá ở

vùng T-ÂDN cố gen rấ t quan trọng việc phát triển khổi u : gen m ã hoá cho enzym AMP- isopentenyl trạnsferase gen m ã hoá cho enzjrm tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane-2mono oxygenase acetam ỉd hydrolase ) Sự hoạt động gen tạo điều kiện cho phát triể n củĩi t ế bào thực vật cổ phụ thuộc vào auxin cytokinin Dặc điểm đựợc sử dụng để chọn lọc tế bào biến nạp từ phần lớn tế bào khống biến nạp Cần lưu ý là, khống cổ gen tro n g vùng cần th iết cho việc chuyển T-ADN Việc chuyển vùng m aog tính th ụ động IXiy nhiẽn, T-ADN khổi u thực vật thưịng có kích thưóc ổn định Ti- plaamid Vì th ế cd thể coi T-ADN đơn vị gấn vào hệ gen thực vật

114 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ m khống c&n cổ biến đổi

• Vùng vir

Chính hoạt động vùng vir đđng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-ADN sang tố bào thực vật Nó lớn khoảng 40kb bao gồm operon (hinh 6.3): virA, B, D G hoàn to àn cần thiết cho việc tạo độc tính; cịn virC £ thi liên quan đến việc hỉnh th ành khối u Trừ virG Â operon khác đa cistron Nói chung, gen virÁ biểu điều kiện; gen virC biểu thấp tế bào sinh dưỡng th ể hiộn r t m ạnh dịch chiết từ mô bị thương ưỉn H oạt động operon cổ li6n quan ch ặt chẽ đến có m ặt hợp ch ất phenol tiết r a từ vết thương Từ vốt thương thuốc iá người ta đă tinh chế xác định hợp chất acetosyringon aỉpha hydroxyacetosyringon

• Q trình chuyển T-AĐN

Doạn T-ADN muốn chuyển, trưốc tiên nd cần phải hoạt hố Chính hoạt động gen vir đdng vai trò Hiện tượng xảy Agrobacterium bát dầu tiếp xúc với hạp chát chứa phenol tiết tỉí vết thương họăc từ tế bào nuôi cấy hay protoplast Đàu tiẽn hoạt động sản phẩm tạo từ gen

Tế bào vùng b| thuơi^ tổn

0 o

acetoseríngon

chemotaxis

Hình 6.4 Những kiện xảy gen vir cùa Ti-plasmừi cảm ứng hạp chất chứa phenoỉ -aceiosyringon dược tiết từ vếi íhương cảa cây.

G õ Sỏ DI TRUYEN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 115 vir (protein virÂ) Protein nằm m àng tế bào Agrobacteriurh, đdng vai trò m ột chát thụ cảm acetosyringon cd mữi trường Tín hiộu sỗ truyền dẫn qua hoạt hoá (cđ lẽ việc phosphoryl hoá) gen virG P rotein virG sau đố lại gán vào gen huy nằm sá t gen khởi động thuộc gen vir khác Bầng cách vậy, protein gen virG hoạt hoá ỉàm tãn g trinh phỉèn m& chinh nó, đồng thời làm giảm trỉn h operon B, c, D E (Zambryski, 1988) - hinh 6.4

Trong tiến trin h chuyển T-ADN, d giai đoạn đầu xuát vết cát Ti-plasmid trậ t tự biên 25bp, vị trí bazơ nitơ thứ ba thứ tư mạch đơn nằm phía dưói (hỉnh 6.5) Từ đố mạch đơn T-ADN giải phổng khỏi Ti-plasmid thay th ế vào mạch đơn tổng hợp theo hướng 5’- 3’, bất đầu tií chỗ đứt tr ậ t tự biên phải (RB) Diều giải thích tạ i trậ t tự biên phải lại cần thiết cho chuyến T-ADN Operon D chủ yếu m â hoá m ột loại endonuclease tạo vết cát trôn hai trậ t tự biên Sự hỉnh th ành m ạch đơn T-ADN tă n g cường nhờ tương tác protein virD2 với protein gen virC mâ hố Cịn protein gen virE2 thl gấn vào mạch đơn T-ADN sau cắt ra, để làm cho nd ổn định trìn h chuyến vào nhân tế bào thực vật Phức hỢp protein- mạch đơn T-ADN cấu trúc cần th iết cho việc chuyển T-ADN sang tế bào thực v ật phải sản sinh từ Agrobacterium.

Còn gen virB m ã hố cho n h ấ t 11 protein để hỉnh thành nên cầu nối, cho phức hợp chuyểri từ Agrịbactèrìum sahg tế bàố thực vật

116 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NĨ . • Các h i vectơ đựa trẽn Tĩ-pìasmid

Ti-plasmid khổ dùng trự c tiếp th í n ^ i ộ m chuyến gen, vỉ nd cổ kích thưốc lớn m a ĩ^ gen gây khối u; ADN Ti-plasmid cố nhiều chỗ đ ế enzym giới hạn cổ th ế cát, đđ người ta cần m ột số vị trí m thdỉ

l\iy nhiên, Ti-plasmid cổ th ể cung cáp cho ta nhữ ng y íu tổ cán th iết để th iết kế vectơ hữu ích cho kỹ th u ậ t chuyển gen Thường người ta hay sử dụng

Ti-VIR

RES

C o l EI

B

MSC

RK2

VIR

o riT

Hình 6.6 Sơ đ ĩ kệ lầổi^ vecta tiÌH hợp (A) nhị thê (B):

Vlr vùng gậy độc; HCM : vùng tuxmg đ&ng, mà phạm vi tái t& hợp (trao đối chéo) cố tbề xảy d&i (fên S»Ị hợp lãi piasmid; RB L& đoạn trật tự bi£n pbải u â 2Sbp d á T-AE^ (

LB boặc RB hai có thề cố vectơ tnng glan^ MCS: đoạn mang tr^ tự nudeodt đề enzym giối hạn nhận béỄt; PTM: gcn chi th| sàng lọc biến t í bào Uiực vật; RES: gen chi thi Mỉ^g chất kháng sinh đề

co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 117 plasmid, mà đó vùng T-ADN gây khối u bị tách bỏ thay th ế vào đđ gen trội thị cho chọn lọc - thường gen vi khuẩn kháng chất kháng sinh, kanamycin Trước đây, người ta hay dùng gen thị kiểm sốt prom otor tín hiệu polyadenin hoá tách từ gen vùng T-ADN octopine synthase hay nopaline synthase Gàn đây, người ta hay sừ dụng prom otor m ạnh tách từ virut khảm báp cải, CaMV35S CaMV19S Tuy nhiên, kích thước lớn Ti- plasmid rấ t khó khăn cho việc gán trực tiếp m ột phân đoạn ADN vào vùng

Vectơ liên hợp

A pGV3850

Vectơ trung gian

P G V 1

Vỉr region

pBR322 BOB-ODCOgemic

GenctóthỊ chọntọcỗ TB thục vật

nos

iCm'

^ịịBSSSBĩP ^

Genchỉ thi chọn lọc ôvk

LB

A p '

B

à '

Tái tổ hợp các

d o n tư n g đồng

Vectơ liên hợp kấông gây khối u

Tí p lasm ld pGV3850::1103

D—tSBSỀ— fc - ' » '

nos-npl II gcn

Btếnnạp

pGVlỉ03

I Tiếp hợp

^ ^ L Tiếp hợp

Tái l ổ hợp c c đ o n tương đỏng

'N I

r bO " "■

POV1103

pCVSáso >

Agrobacterỉum