GIÁO TRÌNH cơ sở DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG vật NUÔI

Chương Khái niệm Giống Cây trồng Khoa học Chọn giống Chọn giống trồng hay thực vật nói chung (plant breeding) lĩnh vực quan trọng sản xuất nông nghiệp; mục đích tạo ngày nhiều giống trồng có suất cao, chất lượng tốt, chống chịu điều kiện bất thuận (như sâu bệnh, hạn, úng, nóng, rét ) Về thực chất, tiến hoá thực vật người điều khiển, hình thành từ thực tiễn trồng trọt qua hàng ngàn năm kể từ người bắt đầu mò mẫm "thuần hoá" trồng dựa theo kinh nghiệm Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật, đặc biệt phát triển di truyền học suốt 100 năm nay, công tác chọn tạo giống trồng xây dựng tảng khoa học vững không ngừng hoàn thiện Nhờ tạo hàng loạt giống trồng mới, giống ngũ cốc, góp phần xoá đói giảm nghèo mang lại sống ấm no cải thiện sức khoẻ cho người Trong chương tìm hiểu vấn đề sau: (i) Khái niệm phân loại giống trồng; (ii) Các hướng nghiên cứu công tác chọn tạo giống trồng; (iii) Bản chất nhiệm vụ ngành khoa học chọn giống I Khái niệm phân loại giống trồng Khái niệm giống Thuật ngữ giống (tiếng Latin: varietas; tiếng Anh: variety) dùng để quần thể sinh vật loài người chọn tạo có đặc điểm di truyền xác định Tất cá thể giống có tính trạng hay thường gọi đặc tính hình thái-giải phẫu, sinh lý-sinh hoá, suất v.v giống ổn định điều kiện sinh thái kỹ thuật sản xuất phù hợp Từ khái niệm giống vậy, ta hình dung giống trồng (crop variety; cultivar) nhóm thực vật có đặc trưng sau: - Có nguồn gốc chung với tính trạng hay đặc điểm giống - Mang tính di truyền đồng (nghĩa có ổn định, phân ly) tính trạng hình thái số đặc tính nông sinh học khác như: chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, khả chống chịu sâu bệnh v.v - Mang tính khu vực hoá, nghĩa tất đặc điểm hay tính trạng giống biểu điều kiện ngoại cảnh (như đất đai, khí hậu, biện pháp kỹ thuật sản xuất) định Từ xuất khái niệm giống chịu hạn, chịu mặn, chịu úng v.v - Do người tạo nhằm thoả mãn một vài nhu cầu thị hiếu định, như: suất cao, chất lượng tốt, giá trị thương phẩm cao Các giống vật nuôi trồng xem phương tiện sống sản xuất nông nghiệp cụ thể (Hình 1.1) Cải bắp Cải hoa lơ Cải chồi Brussels Su hào Cải Chọn lấy chồi đỉnh Chọn lấy chồi bên Chọn lấy thân Chọn lấy cụm hoa Chọn lấy thân hoa Cải xoăn Chọn lấy Brassica oleracea (cây cải dại phổ biến) Hình 1.1 Từ cải dại phổ biến ban đầu (Brassica oleracea), qua trình hoá chọn lọc lâu dài theo hướng khác nhau, người tạo nhiều giống cải trồng khác ngày Mỗi giống có tên riêng, ví dụ: cải hoa lơ (B oleracea var botrytis); su hào (B oleracea var caulorapa) v.v Khi đề cập đến khái niệm "giống", thông thường người ta muốn đề cập tới tính trạng đặc tính giống (Hình 1.2) - Tính trạng (characters): Đó đặc điểm hình thái cấu tạo quan sát giống giúp ta phân biệt với giống khác loài Để nhận biết tính trạng vậy, thường người ta chia nhóm sau đây: + Các đặc điểm hình thái, như: chiều cao cây, chiều dài bông, số hạt bông, số khóm, kích thước v.v Nói chung tính trạng số lượng (quantitative characters), nghĩa "cân-đongđo-đếm" được; chúng thường nhiều gene kiểm soát chịu ảnh hưởng lớn điều kiện môi trường + Các đặc điểm cấu tạo, như: độ dày bông, màu sắc hình dạng thân, lá, hoa Đây tính trạng chất lượng (qualitative characters), thường gene kiểm soát, chịu tác động 10 điều kiện ngoại cảnh quan sát mắt thường + Diễn biến trình sinh học, như: hô hấp, quang hợp, phản ứng quang chu kỳ v.v thường tỏ mẫn cảm với điều kiện sinh thái môi trường nhiệt độ, ánh sáng, độ dài ngày Tất yếu tố tác động trực tiếp gián tiếp lên hoạt động enzyme kiểm soát trình sinh học cụ thể, qua ảnh hưởng đến tính trạng chất lượng - Đặc tính (characteristics): Đó tính chất hay đặc điểm sinh lý, sinh hoá đặc trưng có liên quan đến đặc tính chống chịu thực vật (như chịu mặn, hạn, rét, úng v.v.) đặc điểm kỹ thuật canh tác (a) (b) Hình 1.2 Một số tính trạng hình thái giống lúa trồng (Oryza sativa): (a) màu sắc vỏ trấu, tính có râu - không râu mỏ hạt, mật độ xếp hạt bông; (b) màu sắc vỏ cám, độ bạc bụng kích thước hạt gạo Vấn đề phân loại giống Theo Dennis (1982), tiến hoá giống phải đặt bối cảnh quan hệ sinh vật, môi trường người, chia thành ba thời kỳ: Giống ban đầu hình thành nối tiếp từ chọn lọc tự nhiên, hoàn thiện dần tác động môi trường sinh thái, lao động người, mang đậm dấu ấn đặc tính quần thể hoang dại Một số giống địa phương tình trạng giống ban đầu Giống cải tiến có tiêu chuẩn (về ngoại hình, suất ) người đặt theo nhu cầu để chọn lọc cải tiến khả sinh vật 11 Giống cao sản giống có suất cao hẳn giống cải tiến, phổ biến giới Từ kết hợp đặc điểm địa lý suất sinh vật với nhu cầu người, người ta chia thành: - Giống địa phương giống tồn phổ biến vùng địa lý định quốc gia hay khu vực rộng lớn giới, có suất so với trung bình giống cao sản giới - Giống cao sản giống phổ biến khắp giới, phát triển nhiều vĩ tuyến khác nhau, với suất cao giống địa phương - Giống chuyên dụng giống tạo nhằm thu nhận loại sản phẩm xác định phổ biến giới giao lưu thương mại Về mặt phân loại học, "giống" đơn vị phân loại loài, có tính chất quy ước dùng để quần thể khác loài người chọn tạo Về mặt sinh học, cá thể giống có kiểu gene kiểu hình nói chung giống nhau; mặt thực tiễn, điều quan tâm dạng hình tính sản xuất giống có đáp ứng nhu cầu định hướng việc sử dụng hay không (Hình 1.1 1.2) Đối với việc phân loại lúa trồng chẳng hạn, nhiều lỗ lực tiến hành tập trung chủ yếu vào loài lúa trồng châu Á (Oryza sativa), nguồn lương thực nửa dân số giới Đây loại lương thực có lịch sử trồng trọt lâu đời châu Á Ngày loài trồng rộng rãi nhiều vùng trái đất; kể Bắc Nam Mỹ, châu Âu châu Phi, trải rộng từ vùng xích đạo vùng thuộc vĩ tuyến 500 Bắc xa Nó trồng chí vùng có độ cao tới 2.600m Chính điều kiện môi trường tự nhiên khác biệt với phương thức trồng trọt khác góp phần tạo kiểu sinh thái giống lúa có khả thích nghi khác Dựa đặc điểm bất thụ lai F1 đặc điểm hình thái, sinh thái sinh lý, loài lúa trồng châu Á (O sativa) chia thành ba loài phụ: Indica, Japonica Javanica đặc trưng cho ba vùng địa lý tương ứng Ấn Độ, Trung Quốc-Nhật Bản Indonesia (xem chương 2) Trong trình chọn giống lúa, nhiều giống đặc sản tiếng đời gắn liền với địa danh như: Tám xoan Hải Dương, Tám thơm Hải Hậu, v.v Các giống lúa Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI, đặt Manila Philippines) lai tạo với ký hiệu IR- góp phần tạo cách mạng xanh tiếng như: IR-8, IR-36, IR-64, ; từ Viện di truyền nông nghiệp nước ta như: DT-11, DT-14, DT-17, 12 II Các hướng chọn giống trồng Nói chung, phát triển chọn giống trồng diễn theo hướng sau: (i) Hướng chọn lọc dựa lai hữu tính (còn gọi chọn giống truyền thống); (ii) Hướng chọn tạo giống dựa kỹ thuật gây đột biến phóng xạ hoá chất; (iii) Hướng chọn giống dựa ứng dụng kỹ thuật công nghệ sinh học như: nuôi cấy mô-tế bào, lai tế bào soma, kỹ thuật di truyền công nghệ DNA tái tổ hợp Thế giới ngày phải đối mặt với hàng loạt thách thức việc phát triển công nghệ nhằm đáp ứng lương thực trước việc dân số tăng nhanh nguồn tài nguyên thiên nhiên lại có hạn; có nhiều nguy dẫn tới phá vỡ cân hệ sinh thái nông nghiệp môi sinh toàn cầu Vì cần phải: Xây dựng ngân hàng gene hay quỹ gene nhằm góp phần bảo tồn đa dạng sinh học phục vụ cho việc cải tiến đặc tính mong muốn giống loài cụ thể chương trình chọn giống thực vật Ưu tiên công tác chọn tạo giống tạo giống trồng có tiềm năng suất cao ổn định suất, đặc biệt giải phóng tiềm di truyền bị bắt giữ Áp dụng phối hợp kỹ thuật chọn giống đột biến phương pháp sinh học phân tử với chương trình chọn giống thông thường (để cải tiến tạo giống trồng mới) phát triển hệ thống chọn giống Hướng tới sản xuất nông nghiệp phát triển bền vững, cân sinh thái quan tâm mức, theo hướng sản xuất ngày nhiều sản phẩm giảm thiểu nguy phá hoại thiên nhiên Dưới số nhận định có tính chất định hướng công tác chọn giống trồng nêu số hội nghị quốc tế gần đây: y Hội nghị Quốc tế IAEA FAO phối hợp tổ chức Vienna (IAEA 1995) nhấn mạnh khả phối hợp sử dụng kỹ thuật đột biến sinh học phân tử để cải tiến trồng đường hiệu cần áp dụng chương trình chọn giống, đặc biệt nước phát triển, để đạt tới nông nghiệp phát triển bền vững S Machi nhận định: "Các kỹ thuật đột biến cung cấp hội tạo biến dị quỹ gene vốn không sẵn có với phương pháp khác Di truyền học phân tử cho phép định vị gene quan tâm đồ giúp nhà chọn giống thực vật tiến hành chọn lọc marker tính trạng bước hướng tới việc phân lập gene để đưa trở lại vào loài loài khác Sự tổ hợp kỹ thuật đột biến 13 phương pháp sinh học phân tử dẫn tới gia tăng hiểu biết di truyền học sở sinh lý học thực vật nhiều tính trạng quan trọng cho việc tăng sản lượng thực vật Chúng ta đừng quên công nghệ công cụ công cụ, để thành công chúng phải sử dụng phối hợp rộng rãi với chương trình chọn giống thực vật thông thường." (tlđd) y Trong phiên khai mạc Hội nghị Di truyền học Quốc tế lần thứ XVIII Bắc Kinh (10-15/8/1998), C.C.Tan (1998) nói rằng: "Chọn giống hay cải thiện di truyền cho giống trồng với suất cao chất lượng tốt mục tiêu trọng tâm Đó cách thức hiệu để giữ cho việc sản xuất lương thực theo kịp đà tăng dân số Tuy nhiên để tăng suất đơn vị diện tích, kỹ thuật chọn giống phải thực công nghệ khác Di truyền học sở khoa học cho phát triển hệ thống chọn giống." Theo G.S Khush (1998): "Trong khứ việc sản xuất lương thực gia tăng kết gia tăng tiềm năng suất giống tăng diện tích trồng trọt Trong tương lai, gia tăng chủ yếu diện tích trồng trọt Bằng cách đó, phải sản xuất nhiều lương thực từ đất đai hơn, với thuốc trừ sâu, lao động nước Vì vậy, phải cần đến giống trồng có tiềm năng suất cao ổn định suất Tiềm năng suất giống trồng tăng lên thông qua quy trình lai chọn lọc thông thường, cải biến ideotype (kiểu gene cá thể) thực vật, khai thác ưu lai cách làm giàu thêm quỹ gene trồng thông qua lai rộng rãi Sự ổn định suất tăng cường thông qua kết hợp gene kháng sâu bệnh chống chịu stress vô sinh " III Khoa học chọn giống Khái niệm nhiệm vụ khoa học chọn giống 1.1 Chọn giống trồng gì? Chọn giống trồng (plant breeding) khoa học dựa nguyên lý di truyền học di truyền tế bào học (và đặc biệt là, di truyền học phân tử - bổ sung tác giả); bao gồm nguyên lý phương pháp cần cho việc cải tiến chất di truyền trồng Và kết thường tạo giống trồng phù hợp giống có nhiều phương diện (Singh 1986) Vậy chất chọn giống thực vật gì? Liệu chọn giống trồng nghệ thuật hay khoa học, vấn đề khó khăn cho thích tranh cãi Khoa học tri thức thu thông qua phương 14 pháp khoa học Phương pháp khoa học bao gồm quan sát, xây dựng giả thuyết, thí nghiệm kiểm tra kết luận chấp nhận hay bác bỏ giả thuyết (Hình 1.3) Như khoa học khách quan cách tiếp cận (đối tượng), nghệ thuật có tính chủ quan cao Tiến hành Quan sát Hình thành Giả thuyết Phát triển khung khái niệm: Dự đoán Đề xuất Giả thuyết Thiết kế Thí nghiệm (Kiểm tra giả thuyết) Nếu chấp nhận, Nếu chối bỏ, Đề xuất Giả thuyết dựa nhiều quan sát Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu khoa học Từ lâu, người phụ thuộc vào kỹ chọn lọc tốt Với kiến thức thực vật hạn chế, người chưa biết di truyền tính trạng, vai trò môi trường sản xuất sở xuất biến dị Các phương pháp chọn lọc thiết kế mà không chút hiểu biết nguyên lý di truyền Vì vậy, chọn giống trồng lúc chủ yếu nghệ thuật Nhưng phương pháp chọn giống trồng ngày dựa nguyên lý khoa học khoa học thực vật hẳn hòi, đặc biệt di truyền học di truyền học phân tử Như vậy, phần lớn công việc chọn giống tuý khoa học với nghệ thuật can dự vào Tuy nhiên, việc chọn mong muốn phần nhiều mang tính nghệ thuật tuỳ thuộc chủ yếu vào khả quan sát tinh tế nhà chọn giống để xác định biến dị có lợi, tốt mang lại nguồn giá trị kinh tế cao Như vậy, chọn giống trồng ngày chủ yếu khoa học Một nhà chọn giống trồng đại phải biết tất biết đối tượng mình, tham dự vào kiến thức nhiều môn học có liên quan 1.2 Lịch sử chọn giống thực vật 15 y Thật hợp lý giả định chọn giống trồng khởi thuỷ bắt đầu người lần chọn hoang dại đem trồng trọt Quá trình gọi hoá (domestication) Trong hoá có chọn lọc đó; điều cho kiểu tốt kiểu hoang dại Như vậy, hoá xem phương pháp chọn giống trồng, Sự hoá tiếp diễn nay, có lẽ tiếp tục thời gian tương lai Điều đặc biệt trường hợp gỗ, thuốc y Trong thời kỳ dài lịch sử trồng trọt trước đó, chọn lọc tự nhiên tác động định loài hoá Có thể người áp dụng chọn lọc đó, cách có chủ ý không chủ ý Sự di chuyển người từ vùng sang vùng khác kéo theo chuyển chỗ loài trồng Việc đưa vào khu vực loài giống trồng từ vùng khác giới phần thiếu chọn giống ngày y Các người Babylon Assyrian thụ phấn nhân tạo chà sớm vào khoảng năm 700 trước công nguyên Năm 1717, Thomas Fairchild tạo lai nhân tạo Vào khoảng năm 1760 1766, Joseph Koelreuter (người Đức) tiến hành phép lai rộng rãi thuốc Andrew Knight (1759-1835) có lẽ người sử dụng lai nhân tạo để phát triển số giống ăn Vào khoảng năm 1840, Le Couter Shireff sử dụng chọn lọc cá thể thực vật (individual plant selection) thử nghiệm đời (progeny test) để tạo số giống ngũ cốc có ích Vilmorin (1856) phát triển xa việc thử nghiệm đời sử dụng thành công phương pháp việc cải tiến giống củ cải đường (Beta vulgaris) Phương pháp chọn lọc cá thể thực vật phát triển chi tiết Nilsson-Ehle đồng Svalof (Thuỵ Điển) khoảng năm 1900 Đến 1903, Johannsen (Hình 1.4) đưa thuyết dòng cung cấp sở di truyền cho chọn lọc cá thể thực vật Hình 1.4 R.C.Darwin, G.Mendel, H.De Vries, W.Johannsen G.H.Shull (từ trái sang) 16 Chúng ta nhớ rằng, sách vĩ đại mình, Nguồn gốc loài (Origin of Species), Charles Darwin (Hình 1.4) không bắt đầu việc giải thích chọn lọc tự nhiên ta kỳ vọng Thay thế, chương sách dành phần dài để giải thích cách trồng vật nuôi phát sinh thông qua chọn lọc nhân tạo người Các nguyên lý phát triển trồng chọn lọc nhân tạo dùng làm mô hình cho hiểu biết nguồn gốc loài chọn lọc tự nhiên y Thông qua công trình Gregor Mendel (Hình 1.4), Hugo Marie de Vries (Hình 1.4), nhiều người khác, phát triển di truyền học vào đầu kỷ XX thiết lập móng khoa học vững cho chọn giống thực vật Ở giai đoạn di truyền học cổ điển, quy luật di truyền Mendel cung cấp sở ban đầu cho việc xác định phương thức di truyền khác Nhờ nhà nghiên cứu đóng góp cho phát triển hiểu biết chọn giống thực vật Chẳng hạn, từ kết nghiên cứu H.G Shull (Hình 1.4) chọn giống ngô (Zea mays), ông phát nội phối (inbreeding) làm giảm đáng kể ưu sức sống sức sản xuất Nhưng lai dòng nội phối với nhau, lai thu lại có ưu lai cao hẳn giống ban đầu Các quan sát dẫn tới việc tạo giống lai phổ biến ngô nhiều trồng khác Chẳng hạn, vào kỷ XIX, suất kỷ lục ngô đạt tấn/ha, suất bình quân Mỹ châu Âu đạt khoảng 10-15 tấn/ha, kỷ lục vượt 20 tấn/ha; v.v Cho đến nay, với chương trình chọn giống thông thường, việc sử dụng kỹ thuật đột biến chọn giống thực vật tạo hàng loạt giống trồng mới; việc áp dụng kỹ thuật di truyền gần cho phép tạo giống trồng biến đổi gene độc đáo chưa có trước Nhiều giống lúa lai siêu cao sản (super hybrid rice) có ưu lai vượt trội với suất cực cao tạo từ chương trình chọn giống lúa lai Trung Quốc [L.P.Yuan (1998) dự kiến đến năm 2000 suất hạt đạt 100 kg/ha ngày, thực tế đến 2001 suất hạt đạt mức kỷ lục 150-160 kg/ha ngày.] 1.3 Các nhiệm vụ mục tiêu chọn giống thực vật y Các nhiệm vụ chọn giống thực vật: - Nghiên cứu phân bố, bảo quản sử dụng nguồn gene thực vật mà cụ thể đa dạng giống loài đối tượng cần cho chọn giống - Nghiên cứu hệ thống sinh sản sở di truyền chọn giống trồng thuộc phương thức sinh sản khác xây 200 mồi ủ hỗn hợp này, sợi bổ sung tổng hợp Sau đun nóng hỗn hợp 940C sợi tạo nên tách từ sợi khuôn làm nguội chúng trở lại phân tử mồi gắn vào vị trí nó, sợi tạo thành Điện di sản phẩm PCR gel agarose Lượng DNA tạo nên đủ để nhận vạch sau nhuộm ethidiumbromide Người ta gắn sản phẩm PCR với vector plasmid phage để tạo dòng nghiên cứu ví dụ xác định trình tự DNA 1.1 Nguyên tắc PCR Taq polymerase loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus loại deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) primer, , nhờ đủ số lượng 3’ 5’ (reverse primer-ký hiệu R) Nguyên tắc PCR trình bày hình 9.10 9.11 Theo đó, từ chu kỳ thứ Taq polymerase bắt đ (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide Nếu biết trình tự đoạn gene cần khuếch đại tổng hợp nhân tạo primer tương ứng đ 25-35 chu kỳ, qua từ 10-6 g DNA ban đầu khuếch đại (amplification) lên tới g (khoảng kb) Mỗi chu kỳ PCR bao gồm giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: - Gây biến tính 90-95oC vài giây vài phút Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu dạng xoắn kép tách thành sợi đơn (single strands) dùng làm khuôn cho đoạn mồi bám enzyme RNA polymerase xúc tác tổng hợp Tất phản ứng enzyme giai đoạn bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó) - Ủ với mồi (annealing) 50-55oC Trong giai đoạn primer gắn vào vị trí có trình tự tương đồng DNA khuôn mẫu Các primer bị lắc nhẹ chung quanh chuyển động Brown liên kết ion tạo thành bị đứt gãy liên tục primer sợi đơn DNA khuôn mẫu sợi đơn Các liên kết ion ổn định t đoạn nhỏ (các primer lắp ráp xác) đoạn nhỏ DNA sợi đôi (khuôn mẫu primer) enzyme polymerase bắt đầu trình chép khuôn mẫu - Tổng hợp (synthesis) 70-72oC vài chục giây 201 vài chục phút Đây khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA vị trí có primer theo chiều 5’ 3’ Các primer t gãy Các primer vị trí không bắt cặp xác lại bị rời (do nhiệt đ Enzyme Taq polymerase bổ sung dNTP từ 5’ 3’ Hình 9.10 Sơ đ phản ứng trùng hợp DNA polymerase (PCR) Hình 9.11 Các chu kỳ phản ứng PCR Phản ứng PCR nguyên tắc đơn giản, để đạt kết tốt cần phải thực cẩn thận Trình tự đoạn mồi kết thí nghiệm quan trọng đảm bảo nhiệt độ giai đoạn chu kỳ phản ứng Cuối vấn đề quan trọng sau sử dụng sản phẩm khuếch đại PCR - Cấu trúc mồi oligonucleotide cho phản ứng PCR Mồi định thành công hay thất bại thí nghiệm PCR Khi thiết kế xảy khuếch đại đoạn DNA mong muốn Nếu đoạn mồi thiết kế sai không xảy phản ứng không xảy tổng hợp tổng hợp đoạn không mong muốn, chí nhiều đoạn 202 DNA khuếch đại (Hình 9.12) Hình 9.12 Kết PCR với cặp primer khác Giếng thể đoạn gene khuếch đại với độ lớn mong muốn Ở giếng sản phẩm khuếch đại primer không lai với DNA khuôn Giếng chứa sản phẩm có độ lớn sai hỗn hợp phân tử (1 vạch vạch sai), kết primer gắn sai vị trí DNA khuôn Trình tự đoạn mồi phải tương ứng với trình tự hai đầu đoạn DNA mong muốn đoạn mồi phải bổ sung với sợi khuôn xảy phản ứng lai Hình 9.13 Độ dài primer đinh tính chất đặc biệt PCR - Kích thước đoạn DNA Đoạn DNA muốn khuếch đại không nên dài kb, trường hợp lý tưởng độ lớn nên nhỏ kb Bằng kỷ thuật PCR thông 203 thường người ta khuếch đại đoạn có độ lớn 10 kb độ dài lớn hiệu phản ứng thấp khó khăn để thu kết Có thể khuếch đại đoạn dài (cho đến 40 kb) người ta phải sử dụng phương pháp đặc biệt - Kích thước primer Đoạn mồi nên dài bao nhiêu? Nếu đoạn mồi ngắn thi gắn vào vị trí không mong muốn, nhu đoạn không mong muốn khuếch đại lên Chẳng hạn, DNA tổng số người sử dụng với hai mồi có độ dài nucleotide Kết hình 9.13 Nhiều đoạn khác khuếch đại, người ta tính toán trung bình 65 536 bp (= 84) có ví trí gắn cho mồi Tổng số có khoảng 46 000 vị trí hệ gen người có 000 000 kb Vì khó tin cặp mồi tạo nên sản phẩm PCR đồng với khuôn mẫu DNA người Hình 9.14 Nhiệt độ có tác dụng quan trọng lên phản ứng lai primer DNA khuôn Khi sử dụng mồi có 17 nucleotide, với trình tự 17 179 869 184 bp có vị trí gắn (= 417) Số lớn lần base tổng số hệ gen người, người ta chờ đợi nhiều có vị trí gắn Với cặp mồi có độ dài 17 nucleotide sản phẩm khuếch đại xuất (Hình 9.13) 204 Độ dài mồi ảnh hưởng đến gắn với DNA khuôn nhanh hay chậm, mồi dài trình chậm Hiệu phản ứng PCR số lượng tạo thí nghiệm, giảm mồi dài, với thời gian cho phép chu kỳ phản ứng không xảy phản ứng lai đầy đủ Trong thực tế mồi dài 30 nucleotide sử dụng Quan trọng nhiệt độ gắn ảnh hưởng đến tính đặc hiệu phản ứng Nếu nhiệt độ cao quá, không xảy gắn kết, mồi khuôn đứng riêng lẽ (Hình 9.14a) Nếu nhiệt độ thấp thể lai không đặc hiệu bền vững, tất cặp base bắt cặp xác (Hình 9.14b) Trong trường hợp ý độ dài mồi ý nghĩa, từ xuất thể lai xác mồi khuôn Khi base bắt cặp không tương ứng số lượng vị trí lai với mồi tăng lên nhiều dẫn đến nhân lên đoạn không mong muốn Nhiệt độ lai lý tưởng mặt phải thấp để xảy phản ứng lai mồi sợi khuôn, mặt khác phải cao để không tạo nên thể lai không đặc hiệu Người ta xác định nhiệt độ dựa nhiệt độ phân ly (Tm) thể lai mồi khuôn Ở nhiệt độ Tm thể lai hoàn toàn phân ly, nhiệt độ thấp Tm 1-2 độ tạo nên thể lai xác mồi khuôn, không tồn thể lai không đặc hiệu Người ta biết Tm thực nghiệm, phần lớn tính theo công thức: Tm = (4 x G + C ) + (2 x A + T ) 0C Trong G + C số lượng nucleotide G C trình tự mồi A + T số lượng A T Để xác định nhiệt độ lai cho phản ứng PCR người ta tính Tm cho hai mồi để nhiệt độ thấp Tm 1-2 độ Các mồi nên thiết kế để hai có Tm Nếu không nhiệt độ lai mồi cao với mồi thấp Cách tính Tm cho primer 1.2 Phân tích sản phẩm PCR Sau tiến hành PCR, có nhiều phương pháp để phân tích sản phẩm PCR, quan trọng phương pháp sau - Điện di - Phân tích trình tự sản phẩm PCR - Phân tích tạo dòng sản phẩm PCR 205 Phần lớn việc kiểm tra kết thí nghiệm PCR thực cách lấy phần sản phẩm PCR cho chạy điện di Sau nhuộm màu với ethidiumbromide nhận vạch Nếu sản phẩm thu chứng minh phản ứng lai Southern blot Nếu thiếu vạch mong đợi xuất nhiều vạch khác thí nghiệm phải làm lại Trong số trường hợp, điện di khẳng định phản ứng PCR đạt kết hay không mà từ thu thông tin khác Ví dụ khẳng định, đoạn DNA khuếch đại có tồn vị trí cắt enzym giới hạn hay không Nhằm mục đích sản phẩm PCR xử lý enzym giới hạn sau cho chạy điện di Và người ta khẳng định dựa độ dài sản phẩm PCR, DNA khuôn vùng khuếch đại có chứa đoạn chèn loại bỏ đoạn không (hình 9.15) Trong hai trường hợp đề cập đến dạng biến đổi phân tích RFLP phản ứng PCR So với với phương pháp nguyên thuỷ có ưu điểm cần nguyên liệu ban đầu Hình 9.15 Thông qua điện di sản phẩm PCR, thu thông tin phân tử DNA khuôn Giếng Chỉ sản phẩm PCR không cắt Giếng Sản phẩm cắt enzyme vị trí R Giếng DNA khuôn vùng nhân có chứa đoạn DNA đưa vào Khi địện di không cung cấp đủ thông tin bước xác định trình tự sản phẩm PCR Nhằm mục đích người ta tạo dòng sản phẩm PCR sau sử dụng phương pháp xác định trình tự thông thường xác định trực tiếp trình tự sản phẩm PCR Ứng dụng PCR tách dòng đoạn DNA Khi muốn có thêm thông tin sản phẩm PCR người ta gắn 206 đoạn vào vector nghiên cứu phương pháp tiêu chuẩn ưa thích để phân tích DNA tạo dòng Tuy nhiên có khó khăn Vấn đề gặp phải đầu cuối sản phẩm PCR Những đoạn xuất phản ứng PCR có đầu gắn đầu vào vector nối thêm linker adapter để tạo đầu dính Hình 9.16 Khuếch đại DNA tạo dòng vector Trong thực tế, Taq polymerase gắn với đầu cuối sợi tạo thành thường nucleotide bổ sung thêm, phần lớn adenosin Sản phẩm PCR mạch kép đầu dính, mà đầu cuối 3’ có nucleotide (Hình 9.17) Người ta cắt nucleotide bổ sung exonuclease tạo phân tử có đầu Phương pháp hạn chế cắt tiếp tục exonuclease đầu cuối bị ảnh hưởng Hình 9.17 Polynucleotide tổng hợp từ Taq polymerase thường mang đầu cuối 3’ adenosine Để giải khó khăn người ta sử dụng vector tạo dòng đặc biệt với nucleotide T đứng đối diện, gắn kết với DNA khuếch đại (Hình 9.18) Để tạo vector thông thường người ta 207 tạo vector với đầu cuối cắt enzyme giới hạn sau xử lý với Taq polymerase bổ sung thêm ATP Vì hỗn hợp không chứa mồi, nên Taq polymerase gắn nucleotide T vào đầu vector cắt Một vector có đầu cuối T gắn với sản phẩm PCR Hình 9.18 Tạo dòng sản phẩm PCR vector với nucleotide đầu cuối Phương pháp thứ hai sử dụng nhiều thiết kế mồi có chứa vị trí cắt giới hạn Sau phản ứng PCR người ta xử lý phân tử tạo enzyme giới hạn DNA trình tự mồi cắt xuất đầu dính, đưa chúng có hiệu vào vector tạo dòng bình thường (Hình 9.19) Phương pháp không hạn chế trường hợp, đoạn mồi trùm lên vị trí cắt giới hạn có DNA khuôn Người ta gắn trình tự nhận biết enzyme đoạn ngắn vào đầu 5’ mồi (Hinh 9.20) Những đoạn không lai với khuôn chép phản ứng PCR, sản phẩm PCR mang đầu cuối vị trí cắt enzyme giới hạn Những khó khăn khiếm khuyết Taq polymerase: Tất DNA polymerase có lỗi tổng hợp, nghĩa gắn nucleotide sai vào sợi DNA tổng hợp Tuy nhiên phần lớn DNA-polymerase sửa chữa lỗi này, 208 quay lại để cắt nucleotide gắn vào sai gắn vào nucleotide Đặc tính có “chức sửa chữa” phụ thuộc vào hoạt tính exonuclease theo hướng 3’ 5’ polymerase Hình 9.19 Tạo sản phẩm PCR có đầu dính nhờ sử dụng primer, có vị trí enzyme cắt giới hạn Hình 9.20 Primer PCR với vị trí cắt đầu 5’ kéo dài Taq polymerase thiếu chức sửa chữa này, nghĩa chúng sửa lỗi DNA tổng hợp từ enzyme luôn xác phân tử khuôn Lỗi gặp phải theo ước đoán khoảng nucleotide 9000, thể lỗi ít, sau 30 chu kỳ phản ứng lỗi lên đến 300 bp Vì phản ứng PCR nhiều thường xuyên xuất từ nên lỗi PCR-polymerase gây tăng dần xuất cuối PCR mang nucleotide gắn vào sai từ chu kỳ trước lỗi thêm vào chu kỳ tổng hợp cuối 209 Hình 9.21 Tần suất lỗi cao Taq polymerase tạo dòng sản phẩm PCR Trong nhiều lĩnh vực ứng dụng lỗi tổng hợp vấn đề lớn Đặc biệt phân tích trình tự trực tiếp sản phẩm PCR cung cấp trình tự xác có lỗi Taq polymerase gây ra, theo phân bố thống kê base gắn sai nhiều phân tử khác xuất đoạn với lỗi vị trí định có trình tự vị trí xác Trong trường hợp mắc lỗi ý nghĩa Mặt khác sản phẩm PCR tạo dòng Mỗi dòng chứa nhiều đoạn khuếch đại phản ứng PCR DNA tạo dòng không thiết có trình tự phân tử khuôn mà người ta cho vào để khuếch đại (Hình 9.21) Điều dẫn đến không chắn tất thí nghiệm với sản phẩm PCR tạo dòng Vì nghiên cứu DNA khuếch đại trực tiếp không tạo dòng 210 PCR vào lập đồ di truyền PCR (random amplified polymorphic DNA analysis-RAPD) Trong phương pháp RAPD, PCR thực với primer chọ triển đa hình đoạn cắt giới hạn (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), vi vệ tinh (microsatellite) hay gọi lặp lại đoạn nucleotid (amplified fragment lenght polymorphism, AFLP) Các kỹ thuật xây dựng sở PCR có triển vọng lớn nghiên cứu da dạng di truyền (genetic diversity), địn Nguyên tắc sở di truyền phương pháp chọn lọc nhờ thị (MAS-marker aided-selection) dựa vào PCR Một thị di truyền cần có hai yêu cầu bản: thứ phải có khác biệt thể bố thể mẹ thứ hai phải truyền lại xác cho thể hệ sau Người ta phân kiểu thị di truyền sau: 4.1 Chỉ thị hình thái Về mặt nguyên tắc, tính trạng locus kiểm soát mà biểu không bị ảnh hưởng tác động môi trường, dùng làm thị hình thái cho trình chọn lọc 4.2 Chỉ thị phân tử: Chỉ thị phân tử đặc điểm khía cạnh hóa học hay cấu trúc phân tử di truyền lại cho hệ sau giống nhân tố di truyền Mendel lại định lượng Có hai loại thị phân tử bản: Chỉ thị isozyme: isozyme dạng enzyme có phản ứng hóa học lại bị ức chế phân tử khác Về mặt di truyền chia isozyme làm hai dạng: isozyme đơn gene isozyme đa gene Chỉ thị phân tử DNA: Chỉ thị phân tử DNA phong phú, đa dạng DNA, tính ổn định không lệ thuộc chúng vào yếu tố môi trường Các thị di truyền phân tử sử dụng để xác định mối quan hệ cá thể loài loài, sở cho việc phân loại loài, phát loài mối quan hệ tiến hóa loài Chúng dùng để chọn tổ hợp lai Kiểu thị sử dụng có hiệu để lập đồ phân tử cho 211 trồng có phương thức sinh sản sinh dưỡng hay sinh sản vô tính khó khăn Chỉ thị phân tử chia làm hai nhóm lớn: - Chỉ thị dựa sở lai DNA hay thị RFLP - Chỉ thị dựa sở nhân DNA kỹ thuật PCR Cho đến có nhiều thị phân tử phát triển dựa sở nhân DNA kỹ thuật PCR như: AFLP (Amplified fragment length polymorphism), RAPD (Random amplified polymorphism DNA), SSR (Simple sequence repeats), STS (sequence tagged site) … Chọn lọc nhờ thị dựa vào PCR Tính biến dị di truyền giống loài phát sai khác chiều dài đoạn DNA đích nhân nhờ PCR sử dụng cặp primer Đó thay base điểm liên kết primer xếp lại trật tự DNA vùng chứa điểm Những thay đổi phản ảnh tính đa dạng chiều dài đoạn DNA nhân (amplicon length polymorphism) – ALP Các primer dùng phương pháp chọn lọc nhờ thị dựa PCR thường vào điểm có trật tự nucleotide xác định, gọi thị điểm trật tự đánh dấu - STS (sequence tagged site) Chỉ thị STS sử dụng phổ biến lập đồ geneome STS đoạn DNA ngắn khoảng 60-1000 bp phát kỹ thuật PCR Nó cho phép xác định vị trí đánh dấu cách sử dụng trình tự nucleotide biết trước DNA geneome Hai đoạn mồi thiết kế dựa trình tự nucleotide biết giúp ta xác định vùng DNA cần tìm Các đoạn mồi STS thường chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR Một lượng lớn STS tạo nhờ sử dụng kỹ thuật RFLP dòng cDNA làm mẫu dò Mỗi STS xác định điểm đồ mốc genome Dựa kết phân tích thị STS, RAPD, xây dựng đồ di truyền liên kết giống trồng Nhờ việc tìm kiếm gene kiểm soát liên quan chặt chẽ đến tính trạng di truyền tiến hành cách dễ dàng - Chỉ thị AFLP cho phép phát tính đa dạng chiều dài đoạn DNA nhân chọn lọc Kỹ thuật đánh giá nhanh chóng có hiệu việc xác định tính đa dạng trồng lúa, lạc, … - Chỉ thị SSR: SSR đoạn DNA có lặp lại trật tự nucleotide đơn giản Do khác số lượng nucleotide đơn vị lặp lại số đơn vị lặp lại mà độ dài SSR nhân phát sau trình điện di Chỉ thị SSR dùng để chọn lọc tính kháng bệnh khảm virus đậu tương, số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với suất lúa xác lập mối quan hệ thân thuộc 212 giống trồng cà chua, lúa, đậu tương, mía, … - Chỉ thị RAPD cho phép phát tính đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên việc dùng mồi đơn (thường chứa 1012 nucleotide, tối thiểu bp) chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên Chỉ thị RADP thường dùng để phân tích xác định mối quan hệ thân thuộc thứ trồng hay cá thể phục vụ cho công tác lai tạo phân loại Chúng sử dụng để xác định gene kiểm soát có liên quan đến tính trạng trồng tính trạng chất lượng, tính kháng virus, … V Một số kỹ thuật khác ứng dụng chúng chọn giống thực vật giới Việt Nam Trong năm qua, phương pháp biến nạp gene thực vật bậc cao có nhiều tiến Hiện phòng thí nghiệm công nghệ gene bắt tay vào việc cải thiện có ý nghĩa cho số loại trồng nhờ công cụ sinh học tế bào sinh học phân tử Trong vài trường hợp đặc biệt (đậu tương, lúa, ngô bông) phương pháp biến nạp gene bị giới hạn genotype Một số trồng quan trọng cần thiết cho nhu cầu sử dụng người dân nước phát triển ý Một số trồng quan trọng biến nạp gene, vài vấn đề kỹ thuật tồn tại, chúng giải Để có kết cần phải thay đổi sang phạm vi khác, phát tạo dòng gene mang tính trạng đa gene (multigeneic traits) Một điều quên vấn đề nhận thức xã hội dự báo nguy tác động xấu đến môi trường sản phẩm có nguồn gốc từ công nghệ tái tổ hợp DNA mang lại Hiện công nghệ biến nạp gene quan tâm thông qua quỹ tài trợ quan quốc tế chương trình Rockefeller Foundation (Mỹ), vấn đề thảo luận nhiều cần thiết xác định phương thức tốt để chuyển lợi ích công nghệ biến nạp gene mang lại đến nước phát triển 1983 Điều cho phép nhận xét hai thập niên, công cụ công nghệ DNA tái tổ hợp sinh học tế bào giúp ích nhiều cho nhà tạo giống thực vật Việc lựa chọn phương thức sử dụng trồng thu từ công nghệ DNA tái tổ hợp cung cấp thêm nguồn tài nguyên cho công nghiệp người tiêu dùng, mở rộng sở kinh tế nước công nghiệp lẫn nước phát triển 213 Câu hỏi ôn tập Nêu nguyên tắc chung kỹ thuật chuyển gene Trình bày phương pháp chuyển gene vào trồng Ứng dụng kỹ thuật RFLP chọn giống thực vật PCR gì? Các giai đoạn phản ứng PCR Ứng dụng PCR tách dòng đoạn DNA Tài liệu tham khảo Nguyễn Hoàng Lộc 1998 Bài giảng Công nghệ gene thực vật Đại học Khoa học Huế Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1989) Molecular Cloning (A laboratory manual) Cold Spring Habor Laboratory USA Newton CR and Graham A 1994 PCR BIOS Scientific Publishers Limited Lê Duy Thành 2000 Cơ sở di truyền chọn giống thực vật NXB Khoa học Kỹ thuật Wiser MF 2002 Lecture notes for method in cell Spring TRANG WEB : http://www.appliedplantsciences.umn.edu/Plant_Breeding_Molec ular_Genetics.html http://www.irri.org/irrc/hybridrice/Marker.asp http://www.plantsciences.ucdavis.edu/plantsciences/ http://alpinmack.wordpress.com/2008/08/21/geneticllyengineered-food/ http://www.irri.org/rg5/Cooperative.htm http://www.sciencedaily.com/articles/g/genetically_modified_foo d.htm http://rgp.dna.affrc.go.jp/IRGSP/index.html http://www3.interscience.wiley.com/cgibin/abstract/112506342/ABSTRACT (Giải mã Bộ gen lúa) http://www.aphis.usda_gov/biotechnology/ http://www.agbioworld.org TỪ KHOÁ : 214 Kỹ thuật di truyền : Genetic engineering Gen thị : Marker gene / Chỉ thị phân tử : Molecular maker (phương pháp) Vi tiêm : Microinjection Công nghệ tế bào thực vật : Plant cell biotechnology Đa hình độ dài phân đoạn cắt hạn chế : Restriction fragment length polymorphism (RFLP) - Phản ứng dây chuyền polymerase : Polymerase chain reaction (PCR) - Công nghệ sinh học nông nghiệp : Agricultural Biotechnology - Thực vật biến đổi gene : Genetically modified organisms (GMO plants) -