Nghiên cứu thu nhận nattokinase tái tổ hợp từ chủng bacillus subtilis r0h1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu thu nhận Nattokinase tái tổ hợp từ chủng Bacillus subtilis R0H1 Nguyễn Thị Thùy Ngân Ngan.nttcb190015@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Lan Hương Chữ ký GVHD Viện: Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 10/2021 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thùy Ngân Đề tài luận văn: Nghiên cứu thu nhận Nattokinase tái tổ hợp từ chủng Bacillus subtilis R0H1 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học (KH) Mã số SV: CB190015 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày… .………… với nội dung sau: Ý kiến hội đồng Chỉnh sửa Đề cập chủng tái tổ hợp nước Đã thêm mục 1.2.3 (trang 10) Phương pháp nghiên cứu Đã sửa mục 2.2.2, 2.2.3, 2.3.2, 2.3.3, 2.3.4 (trang 22,23) Tên đồ thị Đã sửa tên đồ thị 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 Phương pháp đo mật độ quang Đã thêm mục 2.2.1 (trang 22) Danh mục viết tắt Đã thêm danh mục viết tắt (trang4) Kết luận Đã sửa phần độ bền nhiệt độ pH (trang 41) Hoạt lực Hoạt độ Số liệu phần động học phản ứng Đã thêm bảng số liệu vào phần phụ lục enzyme (trang 49) Ngày Giáo viên hướng dẫn tháng năm Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Độc lập - Tự - Hạnh phúc - - ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Thùy Ngân Khóa: 2019B Mã số học viên: CB190015 Viện: Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm Ngành: Công nghệ sinh học (KH) Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu thu nhận Nattokinase tái tổ hợp từ chủng Bacillus subtilis R0H1 Nội dung: - Lên men theo mẻ bán liên tục thiết bị lên men 2L - Thu hồi nattokinase - Khảo sát số đặc tính nattokinase Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Lan Hương Ngày giao nhiệm vụ làm luận văn: 05.11.2019 Ngày hoàn thành luận văn: Ngày tháng năm Cán hướng dẫn ( Ký, ghi rõ họ, tên) LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Lan Hương - Trưởng môn công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho em tham gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn tốt nghiệp Và em xin cảm ơn thầy TS Lê Tuân giúp đỡ cho em suốt thời gian làm thí nghiệm Em xin cảm ơn đến tập thể lab D2A bên cạnh giúp đỡ em nhiều, đặc biệt nhóm enzyme Nattokiase Em xin cảm ơn tập thể lab 309-B1 giúp đỡ em q trình em thực thí nghiệm lên men Cuối em xin cảm ơn gia đình bạn bè ln ủng hộ em TĨM TẮT NỘI DUNG Nattokinase (NK) loại enzyme tiêu sợi huyết có khả phòng ngừa hỗ trợ bệnh tim mạch (CVD), nhờ tác dụng tan huyết khối, hạ huyết áp, chống đông máu, chống xơ vữa động mạch bảo vệ thần kinh Trong nghiên cứu này, chủng Bacillus subtilis R0H1 lên men theo mẻ thiết bị 2L với thể tích lên men 1L sau sử dụng kỹ thuật lên men có cấp dưỡng theo hàm số mũ dịch lên men thu có hoạt độ tăng gấp 2,25 lần so với lên men theo mẻ NK từ Bacillus subtilis R0H1 thu nhận qua hai bước lọc màng Kết cho thấy hoạt độ riêng tăng 3,2 lần với hiệu suất thu hồi đạt 80 % Enzyme có trọng lượng phân tử ước tính khoảng 28 kDa có khả phân hủy fibrinogen dựa kết điện di SDS-PAGE Enzyme có pH nhiệt độ tối ưu 8,5 55 oC Enzyme tăng hoạt độ có mặt ion Mg2 +, Ca2 + bị ức chế Co2 +, Zn+2, Fe2 + SDS Giá trị Km Vmax enzyme sử dụng chất fibrin 3,08 mM 6,71 nmol/phút HỌC VIÊN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC VIẾT TẮT CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nattokinase 1.1.1 Giới thiệu nattokinase 1.1.2 Cơ chế làm tan huyết khối 1.1.3 Ứng dụng nattokinase 1.2 Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase 1.2.1 Chủng tự nhiên 1.2.2 Chủng tái tổ hợp 1.2.3 Chủng tái tổ hợp nước 1.3 Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp nattokinase 1.3.1 Lên men theo mẻ 1.3.2 Lên men bán liên tục 10 1.4 Các nghiên cứu thu nhận nattokinase 14 1.5 Một số đặc tính nattokinase 15 1.5.1 Ảnh hưởng pH, nhiệt độ, chất ức chế, ion kim loại 15 1.5.2 Quá trình thủy phân fibrinogen 16 1.5.3 Động học phản ứng enzyme 17 CHƯƠNG - VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Chủng giống 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Thiết bị 20 2.1.4 Môi trường 21 2.2 Phương pháp phân tích 21 2.2.1 Đo mật độ quang 21 2.2.2 Đo hoạt độ enzyme 21 2.2.3 Điện di SDS-Page 22 2.2.4 Đo nồng độ protein 23 2.2.5 Xác định mật độ tế bào 23 2.2.6 Phương pháp sai số 23 2.3 Phương pháp thí nghiệm 24 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 24 2.3.2 Hoạt hóa nhân giống chủng R0H1 24 2.3.3 Lên men theo mẻ 24 2.3.4 Lên men có cấp dưỡng 25 2.3.5 Thu hồi nattokinase 26 2.3.6 Một số đặc tính nattokinase 26 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Lên men theo mẻ 28 3.2 Lên men có cấp dưỡng 30 3.3 Thu hồi nattokinase 32 3.4 Một số đặc tính nattokinase 34 3.4.1 Nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt độ 34 3.4.2 pH tối ưu độ bền pH 36 3.4.3 Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế đến hoạt độ enzyme 37 3.4.4 Một số thông số động học phản ứng enzyme 38 KẾT LUẬN 40 KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 46 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Nguồn gốc chất chủng sinh tổng hợp NK [35] Bảng 1.2 Một số nghiên cứu lên men sinh tổng hợp NK 12 Bảng 1.3 Các kỹ thuật thu hồi NK sử dụng 14 Bảng 1.4 Một số đặc tính NK từ nghiên cứu công bố 16 Bảng 1.5 Hoạt động thủy phân fibrinogen NK từ nguồn khác 17 Bảng 1.6 Động học phản ứng enzyme 18 Bảng 3.1 Hiệu suất thu nhận NK từ chủng B.subtilis R0H1 33 Bảng 3.2 Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế đến hoạt độ NK 37 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc Nattokinase Hình 1.2 Cơ chế hình thành tan huyết khối Nattokinase Hình 1.3 Sản phẩm NSK-SDTM xuất xứ từ Nhật Bản Hình 1.4 Cấu tạo vector biểu NK Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu 24 Hình 3.1: Sinh trưởng chủng R0H1 bình tam giác 500 ml 28 Hình 3.2: Sinh trưởng chủng R0H1 thiết bị lên men L 29 Hình 3.3: Tốc độ sinh trưởng chủng R0H1 pha tăng trưởng 30 Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng chủng R0H1 theo phương án cấp dưỡng 30 Hình 3.5 Mật độ tế bào CFU/ml theo phương án cấp dưỡng 31 Hình 3.6: Hoạt độ NK từ chủng R0H1 theo phương án cấp dưỡng 32 Hình 3.7 A giếng - enzyme thô, giếng - enzyme qua màng 0,2 µm giếng - enzyme kỹ thuật, giếng - marker, B Điện di sản phẩn NK fibrinogen giếng - Marker, giếng - fibrinogen, giếng - sản phẩm phản ứng fibrinogen với NK sau - 10 - 30 giây - 10 - 60 phút 34 Hình 3.8 Nhiệt độ tối ưu enzyme nattokinase 35 Hình 3.9 Độ bền nhiệt độ enzyme nattokinase 35 Hình 3.10 pH tối ưu enzyme nattokinase 36 Hình 3.11 Độ bền pH enzyme nattokiase 37 Hình 3.12 Mơ hình Lineweaver-Bur nattokinase 39 DANH MỤC VIẾT TẮT NK: Nattokinase APS: Ammonium sulfate precipitateness GFC: Gel filtration chromatography column QHP: QHP anion exchange chromatography column SDS: Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis kDa: kilodalton R0H1: Bacillus subtilis R0H1 CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nattokinase 1.1.1 Giới thiệu nattokinase Nattokinase (NK) có nguồn gốc từ ăn truyền thống Nhật Bản gọi “Natto” Người Nhật thường sử dụng natto thực phẩm ăn kèm hầu hết bữa ăn ngày thường vào bữa sáng Natto chế biến đơn giản trình lên men đậu nành hấp chín việc bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis natto, thời gian lên men từ 18 - 20 40oC Sản phẩm bảo quản 10oC - ngày để gia tăng độ chín Sau lên men, Natto thường có độ nhớt cao, xuất Poly-ᵞ-glutamic axit (PGA), có mùi đặc trưng pyrazine tạo nên Nhà nghiên cứu Hiroyuki Sumi chứng minh nattokinase enzyme có khả làm tan huyết khối (nguyên nhân gây đau tim, tắc mạch máu) [9] https://vi.wikipedia.org/wiki/Nattokinase Hình 1.1 Cấu trúc Nattokinase Kể từ nattokinase phát Sumi cộng (1987), số lượng nghiên cứu NK ngày tăng quan tâm phải kể đến nhóm nghiên cứu từ nước Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc Hoa Kỳ [10] Nattokinase (E.C.3.4.21.62) thuộc nhóm serine protease gồm 275 acid amin, có khối lượng phân tử 27,7 kDa Trung tâm hoạt động nattokinase gồm Serine 221, Histidine 64 Aspartate 32, nhóm -OH acid amin serine tác nhân làm đứt gẫy liên kết peptid [11] Nghiên cứu mô cấu trúc 3D NK trung tâm hoạt động NK mang điện tích âm [11] Điều cho thấy NK cắt hiệu vị trí gốc axit amin mang điện tích dương Bốn gốc axit amin Serine 33, Aspartate 60, Serine 62 Threomine 220 có khả tạo nhiều liên kết hydrogen giúp làm bền trạng thái chuyển tiếp trình xúc tác Trong tương tự kích thước enzyme kỹ thuật giếng Kích thước NK từ chủng R0H1 tương tự kích thước NK tái tổ hợp 28 kDa phân bố Weng cộng (2009) [52], Trần Quốc Tuấn cộng (2015) [53], Tian cộng (2019) [57], Purwaeni cộng (2020) [59] với nhóm Zhang cộng (2020) [7] A B Hình 3.7 A giếng - enzyme thơ, giếng - enzyme qua màng 0,2 µm giếng - enzyme kỹ thuật, giếng - marker, B Điện di sản phẩn NK fibrinogen giếng - Marker, giếng - fibrinogen, giếng - sản phẩm phản ứng fibrinogen với NK sau - 10 - 30 giây - 10 - 60 phút Fibrinogen protein huyết tương hịa tan có kích thước 340 kDa Fibrinogen cấu tạo từ chuỗi α, β γ cầu nối disulfiel [75] Các chuỗi fibrinogen từ huyết tương bị có kích thước tương ứng 63,5 kDa, 56 kDa 47 kDa (https://www.sigmaaldrich.com) Thời gian phản ứng NK fibrinogen định phổ sản phẩm sinh Kết chạy điện di SDS - PAGE theo dõi phổ sản phẩm trình NK thủy phân fibrinogen thể Hình 3.7 B Từ kết thấy sau giây phản ứng, kích thước phân tử protein có thay đổi, chuỗi α β có kích thước 63,5 56 kDa gần bị phân hủy hồn tồn phổ sản phẩm có kích thước nằm khoảng 11- 48 kDa Như NK từ chủng R0H1 thủy phân chuỗi α, β sau γ, thời gian để thủy phân hoàn toàn chuỗi α, β γ giây, 10 phút 60 phút Kết nhóm nghiên cứu phù hợp với báo công bố phân hủy fibrinogen từ chủng B subtilis BD104 [53] B subtilis [76] 3.4 Một số đặc tính nattokinase 3.4.1 Nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt độ Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ NK từ chủng R0H1 biểu diễn Hình 3.8 34 Hình 3.8 Nhiệt độ tối ưu enzyme nattokinase Kết từ Hình 3.8 cho thấy hoạt độ enzyme tăng đáng kể nhiệt độ tăng từ 30oC đến 55oC Phản ứng nhiệt độ 55oC đem lại hoạt độ cao cho NK hồn tồn hoạt tính nhiệt độ 75oC Nhiệt độ tối ưu NK từ chủng R0H1 tương tự NK tái tổ hợp nhóm nghiên cứu Trần Quốc Tuấn cộng (2015) [53], NK từ chủng B subtilis IMR-NK1 [64] Ngoài nhiệt độ tối ưu NK từ chủng R0H1 cao so với NK từ số chủng như: Bacillus cereus SRM-001(37oC) [63]; Bacillus subtilis natto B-12 [61], Bacillus subtilis TKU007 [62] (40oC); Rhizopus chinensis 12 [65], Bacillus subtilis DC27 [56] (45oC) Bên cạnh thấp so với nhiệt độ tối ưu 60oC NK từ chủng Bacillus sp B24 [77] Độ bền NK nhiệt độ khác từ 30 - 80oC hiển thị Hình 3.9 Hình 3.9 Độ bền nhiệt độ enzyme nattokinase 35 Kết Hình 3.9 cho thấy nhiệt độ 60oC NK từ chủng R0H1 hoạt độ ổn định 80% sau Khi nhiệt độ tăng lên dẫn đến hoạt độ NK giảm dần Tại nhiệt độ 70oC, hoạt độ enzyme lại 40% sau NK từ chủng R0H1 hoàn toàn bất hoạt nhiệt độ 80oC sau Nhóm Lin cộng (2015) NK từ chủng B subtilis N1 giữ hoạt độ tương đối 40% sau ủ nhiệt độ 55oC [78] Trong NK từ chủng B subtilis natto B-12 gần bị bất hoạt 60oC sau 60 phút ủ [61] Bên cạnh đó, NK từ chủng B subtilis BSN1 giữ 52% hoạt độ so với ban đầu nhiệt độ 70oC sau 30 phút [62] Các kết thu cho thấy NK từ chủng R0H1 coi protease ưa nhiệt 3.4.2 pH tối ưu độ bền pH pH đóng vai trị quan trọng điều kiện hoạt động enzyme NK Trong thí nghiệm pH khảo sát từ đến 10 Kết biểu diễn Hình 3.10 Hình 3.10 pH tối ưu enzyme nattokinase Hình 3.10 biểu diễn pH tối ưu cho phản ứng enzyme NK với chất fibrin Từ đồ thị cho thấy pH 8,5 enzyme hoạt động tốt Trong khoảng pH từ 7-10, hoạt độ enzyme đạt 60% so với hoạt độ đo pH 8,5 Kết gần với kết pH tối ưu NK tái tổ hợp từ chủng B subtilis BD104 [53] NK từ chủng tự nhiên B subtilis natto B-12 [61], B subtilis TKU007 [62] Bacillus sp B24 [79] 36 Hình 3.11 Độ bền pH enzyme nattokiase Để khảo sát khả hoạt động NK điều trị bệnh CVD, NK đánh giá độ ổn định pH khác pH dày (2,5), pH máu (7,4) pH ruột (8,5) Kết biểu diễn Hình 3.11 cho thấy bất hoạt nhanh chóng NK từ chủng R0H1 sau 30 phút pH 2,5 Sự hoàn toàn hoạt độ NK pH thấp từ - báo cáo với NK từ Rhizopus chinensis 12 [65], B subtilis natto B-12 [61], B subtilis natto [80] Tuy nhiên hoạt tính NK giảm không đáng kể pH 7,4 8,5 sau ủ 37oC 3.4.3 Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế đến hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme có mặt ion kim loại chất ức chết thể Bảng 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế đến hoạt độ NK Ion kim loại and chất kìm hãm None Hoạt độ tương đối (%) Nồng độ mM Nồng độ 5mM 100 ± 100 ± Na+ 109 ± 98 ± Mg2+ 116 ± 103 ± Mn2+ 100 ± 53 ± K+ 100 ± 95 ± Zn2+ 74 ± 38 ± Co2+ 73 ± 0±0 Fe2+ 46 ± 0±0 Ca2+ 115 ± 113 ± Cu2+ 87 ± 85 ± EDTA 101 ± 88 ± SDS 49 ± 22 ± 37 Kết Bảng 3.2 cho thấy hoạt độ enzym tăng lên tới 109 %, 115 % 116 % có mặt Na+, Ca2+ Mg2+ tương ứng mM Tuy nhiên, việc tăng thêm nồng độ ion lên 5mM không cải thiện hoạt độ enzyme Các tác nhân khác Mn2+ (1mM), K+ (1 - mM), EDTA (1 - mM) Na+ (1 - mM) không ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động nattokinase Ngồi ra, enzyme cịn bị ức chế Co2+, Zn2+, Cu2+ SDS Sự diện ion chất ức chế dẫn đến hoạt tính enzym, hoạt độ enzyme đạt từ 13 78 % tùy thuộc vào nồng độ ion/chất ức chế Tác động ion kim loại chất ức chế lên hoạt độ NK phần phù hợp với số kết công bố trước Nhóm Xin cộng (2018) báo cáo hoạt độ NK từ chủng Bacillus tequilensis (No 11462) đạt 86 % có mặt mM Cu2+ [54] Chang cộng (2012) công bố khơng có ảnh hưởng ion kim loại K+, Na+, Ca2+, Mg2+ and Zn2+ lên hoạt độ NK từ đậu đỏ lên men chủng B subtilis [80] Trong kết công bố, ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt độ NK chưa thống Ví dụ ion Fe2+ nồng độ mM chứng minh ion làm tăng hoạt độ NK từ chủng B subtilis TKU007 [62], kết luận ngược lại công bố NK từ chủng B subtilis Natto B-12 [61] chủng B subtilis DC27 [56] Tương tự, công bố mâu thuẫn ảnh hưởng Zn2+ Cu2+ hoạt độ NK báo cáo Grap cộng (2014) nhận thấy hoạt độ NK từ chủng Bacillus natto (NRRL B3666) tăng thêm % có mặt mM Zn2+ Cu2+ [69] Mặt khác, hoạt độ NK từ chủng Bacillus tequilensis (No 11462) bị giảm 15 % so với hoạt độ khơng có mặt ion [54] Ngoài NK tư chủng B subtilis BD104 tăng hoạt độ gấp 1,72 lần có mặt mM Zn2+, có mặt mM Cu2+ làm giảm hoạt độ 20 % [53] 3.4.4 Một số thông số động học phản ứng enzyme Các thông số động học NK từ chủng B subtilis R0H1 xác định từ tốc độ phản ứng nồng độ chất khác Biểu đồ Lineweaver - Bur Hình 3.12 cho thấy điểm chặn y vị trí 1/V 148,96 (phút/µmol) điểm chặn x vị trí 1/S -0,33 (L/mmol) Các giá trị Km Vmax tính tốn từ liệu thu tương ứng 3,08 mM 6,70 nmol/phút Khi Km thu giá trị thấp, điều cho thấy NK có độ với fibrin cao Grap cộng (2014) báo cáo giá trị Km Vmax NK từ chủng Bacillus natto NRRL B - 366 với chất sử dụng N - Succinyl - Ala - Ala - Pro - Phe - p - nitro - anilide (S - 7388) đạt tương ứng 3,50 mM 1250 nmol/phút 38 Hình 3.12 Mơ hình Lineweaver-Bur nattokinase Nhóm nghiên cứu Kim cộng (2020) tách chiết enzyme fibrinolytic từ thực phẩm lên men Jotgal Hàn Quốc có tên gọi JP - I JP - II [81] Hai enzyme có thơng số động học Km chất fibrin 2,96 mM 4,76 mM Từ thông liệu nhân thấy chất fibrin NK từ chủng R0H1 có hệ số Km xấp xỉ với enzyme JP - I thấp enzyme JP - II Như kết luận độ NK từ chủng R0H1 tương tự enzyme JP - I cao enzyme JP - II Ngồi NK từ chủng R0H1 có độ với fibrin tốt so với NK từ chủng Bacillus sp KDO - 13 (Km = 110,50 mM) [68] 39 KẾT LUẬN Hoạt độ NK từ dịch lên men chủng R0H1 thiết bị L đạt 158,00 FU/ml sau 13 lên men Phương án cấp dưỡng khoảng thời gian đem lại hiệu tốt nhất: OD 600nm đạt 37,60 mật độ tế bào 7,90 x 109 CFU/ml thời điểm 16 giờ; hoạt độ NK đạt 351,43 + 8,57 FU/ml sau 22 lên men - tăng 2,22 lần 2,60 lần so với hoạt độ NK lên men theo mẻ thiết bị bình tam giác Thu hồi enzyme phương pháp lọc dòng ngang đạt hiệu suất 89,70 ± 8,00 % hoạt độ riêng đạt 2082,23 ± 36,42 FU/mg, enzyme có kích thước khoảng 28 kDa Enzyme thu hồi có đặc tính sau: - Nhiệt độ pH tối ưu 55oC 8,50 - Enzyme ổn định khoảng 30 - 60oC - Enzyme tương đối bền pH 7,40 8,50 - Sự có mặt ion kim loại Ca2+ Mg2+ làm tăng hoạt độ enzyme - Enzyme có km = 3,08 mM Vmax = 6,71 nmol/min chất fibrin KIẾN NGHỊ - Nghiên cứu phương pháp cấp dưỡng kéo dài pha cân để trình lên men đạt hiệu cao 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Unrean, P., et al., Improvement of nattokinase production by Bacillus subtilis using an optimal feed strategy in fed-batch fermentation AsiaPacific Journal of Science and Technology, 2012 17(5): p 769-777 Chen, P.T., C.-J Chiang, and Y.-P Chao, Medium Optimization for the Production of Recombinant Nattokinase by Bacillus subtilis Using Response Surface Methodology Biotechnology Progress, 2007 23(6): p 1327-1332 Berenjian, A., et al., Nattokinase production: Medium components and feeding strategy studies Chemical Industry & Chemical Engineering Quarterly, 2014 20(4): p 541-547 Cho, Y.-H., et al., Production of nattokinase by batch and fed-batch culture of Bacillus subtilis New Biotechnology, 2010 27(4): p 341-346 Liu, Z., et al., High-level extracellular production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis WB800 by multiple tandem promoters BMC Microbiology 2019 19: p 89 Venkataraman, D., et al., Medium optimization and immobilization of purified fibrinolytic URAK from Bacillus cereus NK1 on PHB nanoparticles Enzyme and Microbial Technology 2010 47: p 297-304 Zhang, J., et al., High cell density cultivation of a recombinant Bacillus Subtilis for nattokinase production Authorea Preprints, 2020 Kwon, E.-Y., et al., Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis Bioprocess and Biosystems Engineering, 2011 34(7): p 789-793 Sumi, H., et al., A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet Experientia, 1987 43(10): p 1110-1111 Chen, H., et al., Nattokinase: A Promising Alternative in Prevention and Treatment of Cardiovascular Diseases Biomarker insights, 2018 13: p 18 Zheng, Z.L., et al., Construction of a 3D model of nattokinase, a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus natto A novel nucleophilic catalytic mechanism for nattokinase J Mol Graph Model, 2005 23(4): p 370-380 Weng, Y., et al., Nattokinase: An oral antithrombotic agent for the prevention of cardiovascular disease International journal of molecular sciences, 2017 18(3): p 523 Dabbagh, F., et al., Nattokinase: production and application Applied Microbiology and Biotechnology, 2014 98(22): p 9199-9206 Nagata, C., et al., Dietary soy and natto intake and cardiovascular disease mortality in Japanese adults: the Takayama study The American Journal of Clinical Nutrition, 2017 105(2): p 426-431 Huang, Y., et al., Ultra-small and anionic starch nanospheres: Formation and vitro thrombolytic behavior study Carbohydrate Polymers, 2013 96(2): p 426-434 Fujita, M., et al., Antihypertensive Effects of Continuous Oral Administration of Nattokinase and Its Fragments in Spontaneously Hypertensive Rats Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2011 34(11): p 1696-1701 Sumi, H., et al., Enhancement of the Fibrinolytic Activity in Plasma by Oral Administration of Nattokinase Acta Haematologica, 1990 84(3): p 139143 Fujita, M., et al., Transport of Nattokinase across the Rat Intestinal Tract Biological & Pharmaceutical Bulletin, 1995 18(9): p 1194-1196 Kou, Y., et al., Development of a nattokinase–polysialic acid complex for advanced tumor treatment European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2020 145: p 105241 41 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Wu, H., et al., Acute toxicity and genotoxicity evaluations of Nattokinase, a promising agent for cardiovascular diseases prevention Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2019 103: p 205-209 Huang, Z., et al., Nattokinase Attenuates Retinal Neovascularization Via Modulation of Nrf2/HO-1 and Glial Activation Investigative ophthalmology & visual science, 2021 62(6): p 25-25 Lampe, B.J and J.C English, Toxicological assessment of nattokinase derived from Bacillus subtilis var natto Food and Chemical Toxicology, 2016 88: p 87-99 Jensen, G.S., et al., Consumption of nattokinase is associated with reduced blood pressure and von Willebrand factor, a cardiovascular risk marker: results from a randomized, double-blind, placebo-controlled, multicenter North American clinical trial Integr Blood Press Control, 2016 9: p 95104 Kurosawa, Y., et al., A single-dose of oral nattokinase potentiates thrombolysis and anti-coagulation profiles Scientific reports, 2015 5: p 11601 Kim, M.-h., K.-m Kwon, and K.-s Kim, Efficacy and Safety of Ultra Nattokinase as a Fibrinolytic Agent: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Study Korean Journal of Family Practice, 2017 7(2): p 264-270 Maslarov, D and D Drenska, Use of Nattokinase in patients with ischemic stroke and transient ischemic attacks Neurology and Neuroscience, 2020 1(2) Fujita, M., et al., Characterization of nattokinase-degraded products from human fibrinogen or cross-linked fibrin Fibrinolysis, 1995 9(3): p 157164 Ali, A.M.M and S.C.B Bavisetty, Purification, physicochemical properties, and statistical optimization of fibrinolytic enzymes especially from fermented foods: A comprehensive review International Journal of Biological Macromolecules, 2020 Yatagai, C., et al., Nattokinase-promoted tissue plasminogen activator release from human cells Pathophysiol Haemost Thromb, 2007 36(5): p 227-232 Feng, R., et al., Preparation and toxicity evaluation of a novel nattokinasetauroursodeoxycholate complex Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018 13(2): p 173-182 Bhatt, P.C., et al., Development of surface-engineered PLGA nanoparticulate-delivery system of Tet1-conjugated nattokinase enzyme for inhibition of Aβ(40) plaques in Alzheimer's disease International journal of nanomedicine, 2017 12: p 8749-8768 Liu, S., et al., Synthesis of sustained release/controlled release nanoparticles carrying nattokinase and their application in thrombolysis Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 2021 76(4): p 145-149 Huang, M., et al., A nano polymer conjugate for dual drugs sequential release and combined treatment of colon cancer and thrombotic complications Materials Science and Engineering: C, 2020 110: p 110697 Gallelli, G., et al., Data Recorded in Real Life Support the Safety of Nattokinase in Patients with Vascular Diseases Nutrients, 2021 13(6) Cai, D., C Zhu, and S Chen, Microbial production of nattokinase: current progress, challenge and prospect World J Microbiol Biotechnol 2017 33(5) Inatsu, Y., et al., Characterization of Bacillus subtilis strains in Thua nao, a traditional fermented soybean food in northern Thailand Letters in Applied Microbiology 2006 43(3): p 237-242 Wang, S.-L., et al., A novel nattokinase produced by Pseudomonas sp TKU015 using shrimp shells as substrate Process Biochemistry, 2009 44(1): p 70-76 42 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 Kim, W., et al., Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang Applied and Environmental Microbiology, 1996 62(7): p 2482 Liu, J., et al., Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods Process Biochemistry, 2005 40(8): p 2757-2762 Park, C.-S., et al., Identification of fibrinogen-induced nattokinase WRL101 from Bacillus subtilis WRL101 isolated from Doenjang African Journal of Microbiology Research, 2013 7(19): p 1983-1992 Nie, G., et al., Co-Production of Nattokinase and Poly (³-Glutamic Acid) Under Solid-State Fermentation Using Soybean and Rice Husk Brazilian Archives of Biology and Technology, 2015 58: p 718-724 Kada, S., et al., Identification of two major ammonia-releasing reactions involved in secondary natto fermentation Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2008 72(7): p 1869-1876 Ni, H., et al., Expression of nattokinase in Escherichia coli and renaturation of its inclusion body Journal of Biotechnology, 2016 231: p 65-71 Liang, X., et al., Secretory expression of a heterologous nattokinase in Lactococcus lactis Applied Microbiology and Biotechnology, 2007 75(1): p 95-101 Chen, P.T., Y.-P Chiang Cj Fau - Chao, and Y.P Chao, Strategy to approach stable production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis Biotechnol Prog, 2007 23: p 803-813 Nguyen, T.T., T.D Quyen, and H.T Le, Cloning and enhancing production of a detergent- and organic-solvent-resistant nattokinase from Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 by using an eight-protease-gene-deficient Bacillus subtilis WB800 Microbial cell factories, 2013 12: p 79-79 Reuß, D.R., et al., Complete Genome Sequence of Bacillus subtilis subsp subtilis Strain 3NA Genome announcements, 2015 3(2) Ravichandran, S and V R, Solid state and submerged fermentation for the production of bioactive substances: a comparative study International Journal of Science and Nature, 2012 3: p 480-486 T, P., et al., Glucose-limited fed-batch cultivation of Escherichia coli with computer-controlled Biotechnol Bioeng 22(5): p 341-346 Yee, L and H Blanch, Recombinant protein expression in high cell density fed-batch cultures of Escherichia coli Nature Biotechnology, 1992 10(12): p 1550-1556 Ting, T.E., et al., A simple substrate feeding strategy using a pH control trigger in fed-batch fermentation 2007(0273-2289 (Print)) M, W., et al., Enhancement of oxidative stability of the subtilisin nattokinase by site-directed Biochim Biophys Acta, 2009 1794(11): p 1566-1572 Quoc Tuan, T., et al., Purification and characterization of recombinant nattokinase from Bacillus subtilis Tạp chí sinh học, 2015 37: p 75-84 Xin, X., et al., Purification and characterization of fibrinolytic enzyme from a bacterium isolated from soil Biotech, 2018 8(2): p 90 Bora, B., et al., The N-terminal-truncated recombinant fibrin(ogen)olytic serine protease improves its functional property, demonstrates in vivo anticoagulant and plasma defibrinogenation activity as well as pre-clinical safety in rodent model International Journal of Biological Macromolecules, 2018 111: p 462-474 Hu, Y., et al., Purification and characterization of a novel, highly potent fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis DC27 screened from Douchi, a traditional Chinese fermented soybean food Scientific Reports, 2019 9(1): p 9235 Tian, L., W Zhou, and Y Zhang, Construction of a genetically engineered strain of nattokinase and assessment of its fibrinolytic activity African Journal of Microbiology Research, 2019 13(27): p 488-499 Yang, H., et al., Genome sequencing, purification, and biochemical characterization of a strongly fibrinolytic enzyme from Bacillus 43 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 amyloliquefaciens Jxnuwx-1 isolated from Chinese traditional douchi The Journal of General and Applied Microbiology, 2019 66(3): p 153-162 Purwaeni, E., C Riani, and D.S Retnoningrum, Molecular Characterization of Bacterial Fibrinolytic Proteins from Indonesian Traditional Fermented Foods The Protein Journal, 2020 39: p 258-267 Liang, X., et al., Secretory expression of nattokinase from Bacillus subtilis YF38 in Escherichia coli Molecular Biotechnology, 2007 37(3): p 187194 Wang, C., et al., Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis Natto B-12 Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009 57(20): p 9722-9729 Wang, S.-L., Y.-Y Wu, and T.-W Liang, Purification and biochemical characterization of a nattokinase by conversion of shrimp shell with Bacillus subtilis TKU007 New Biotechnology, 2011 28(2): p 196-202 Narasimhan, M.K., et al., Purification, biochemical, and thermal properties of fibrinolytic enzyme secreted by Bacillus cereus SRM-001 Preparative Biochemistry & Biotechnology, 2018 48(1): p 34-42 Chang, C.-T., et al., Potent Fibrinolytic Enzyme from a Mutant of Bacillus subtilis IMR-NK1 Journal of agricultural and food chemistry, 2000 48(8): p 3210-3216 Xiao-lan, L., et al., Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis 12 Applied Microbiology and Biotechnology, 2005 67(2): p 209-214 Jo, H.-D., et al., Purification and characterization of a major fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41 isolated from Meju J Microbiol Biotechnol, 2011 21(11): p 1166-73 L, M and M M, Kinetik der Invertinwirkung Biochem Z, 1913(49): p 333369 Lee, A., et al., Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus sp KDO-13 isolated from soybean paste Journal of Microbiology and Biotechnology, 2001 11: p 845-852 Garg, R and B.N Thorat, Nattokinase purification by three phase partitioning and impact of t-butanol on freeze drying Separation and Purification Technology, 2014 131: p 19-26 Avhad, D.N and V.K Rathod, Application of mixed modal resin for purification of a fibrinolytic enzyme Preparative Biochemistry & Biotechnology, 2016 46(3): p 222-228 Mesapogu, S., C.M Jillepalli, and D.K Arora, Agarose Gel Electrophoresis and Polyacrylamide Gel Electrophoresis: Methods and Principles, in Analyzing Microbes: Manual of Molecular Biology Techniques 2013, Springer Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg p 7391 Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Analytical Biochemistry, 1976 72(1): p 248-254 d'Anjou, M.C and A.J Daugulis, Mixed-feed exponential feeding for fedbatch culture of recombinant methylotrophic yeast Biotechnology Letters, 2000 22(5): p 341-346 Xin, X., et al., Development of universal purification protocols for fibrinolytic enzyme-producing bacilli CyTA - Journal of Food, 2019 17(1): p 112-120 Walker, J.B and M.E Nesheim, The molecular weights, mass distribution, chain composition, and structure of soluble fibrin degradation products released from a fibrin clot perfused with plasmin Journal of Biological Chemistry, 1999 274(8): p 5201-5212 Ren, Y., et al., Biochemical characterization of a fibrinolytic enzyme composed of multiple fragments Acta Biochim Biophys Sin, 2018 50(2): p 227-229 44 77 78 79 80 81 Sumaya Ali Hmood*, G.M.A., Optimum conditions for fibrinolytic enzyme (Nattokinase) production by Bacillus sp B24 using solid state fermentation Iraqi Journal of Science, 2016 57: p 1391-1401 Lin, H.T.V., et al., Purification and characterization of nattokinase from cultural filtrate of red alga porphyra dentata fermented by Bacillus subtilis N1 Journal of Marine Science and Technology (Taiwan), 2015 23: p 240248 Sumaya Ali Hmood, G.M.A., Purification and characterization of nattokinase produced by local isolate of Bacillus sp B24 Iraqi Journal of Biotechnology, 2016 15(2): p 93-108 Chang, C.-T., et al., Purification and biochemical properties of a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis-fermented red bean Food Chemistry, 2012 133: p 1611–1617 Kim, C., K Ri, and S Choe, A novel fibrinolytic enzymes from the Korean traditional fermented food—Jotgal: Purification and characterization Journal of Food Biochemistry, 2020 45 PHỤ LỤC Pha hóa chất đo hoạt độ NK Chuẩn bị chất: Cơ Fibrin pha 70 mL NaOH 0,1 N Sử dụng khuấy từ khuấy đến tan hết (4 – giờ), chỉnh pH 7,4 HCl đậm đặc sau định mức lên 100 ml nước cất Phần không tan loại bỏ nhờ ly tâm 10000 rpm, 10 phút; thu dịch Fibrin sau pha bảo quản tủ -20ᵒC (bảo quản thời gian dài) C (thường xuyên sử dụng) o Đệm: Đệm Tris-HCl: 0,1M có bổ sung CaCl2 0,01M Cân 2,42 g Tris – base hòa tan vào 80 ml nước cất Chỉnh pH 7,4 Định mức lên 100 ml nước cất Cân 0,222 g CaCl2 hòa tan vào 80 ml nước cất Chỉnh pH 7,4 Định mức lên 100 ml nước cất Khi sử dụng trộn dung dịch với tỉ lệ 1:1 Chất dừng phản ứng: Chất vô hoạt (dừng phản ứng) Trichloroacetic acid (TCA) 1,5 M tương đương 245,07 g/L Đường chuẩn tyrosine Phương pháp tiến hành: Cân 0,001 g Tyrosine pha 50 mL HCl 0,2 N, dung dịch gốc Từ pha lỗng nồng độ từ - 200 µg/mL Tiến hành so màu bước sóng 275 nm xây dựng đường chuẩn Theo đường chuẩn tính độ tăng độ hấp thụ bước sóng 275 nm ứng với tăng nồng độ tyrosine 1µg/mL hệ số a Dựng đường chuẩn tyrosine Tyrosine (µg/ml) 10 25 50 100 150 200 OD 275 nm 0,081 0,151 0,2 0,51 1,101 1,523 1,919 46 Tính tốn tốc độ cấp dưỡng Các thông số : Xo = 9,26 Vo = L YX/S = 0,37 (g/OD) (giả thiết lượng tryptone bị tiêu thụ pha sinh trưởng 30 g ) T thực t - fed Si Pump% (g/L) F (mL/h) g/L thực V fed (ml) 9,5 200 30,8 6,2 6,2 6,2 0,2 10,0 200 32,3 6,5 6,5 6,4 0,4 10,5 200 33,9 6,8 6,8 6,6 0,6 11,0 200 35,5 7,1 7,1 6,8 0,8 11,5 200 37,3 7,5 7,5 12,1 200 39,1 7,8 7,8 7,2 1,2 12,6 200 41,0 8,2 8,2 7,4 1,4 13,2 200 43,1 8,6 8,6 7,6 1,6 13,9 200 45,2 9,0 9,0 7,8 1,8 14,6 200 47,4 9,5 9,5 15,3 200 49,7 9,9 9,9 8,2 2,2 16,0 200 52,2 10,4 10,4 8,4 2,4 16,8 200 54,7 10,9 10,9 8,6 2,6 17,6 200 57,4 11,5 11,5 47 8,8 2,8 18,4 200 60,3 12,1 12,1 9,8 400 31,6 12,6 6,3 9,2 3,2 10,3 400 33,2 13,3 6,6 9,4 3,4 10,8 400 34,8 13,9 7,0 9,6 3,6 11,3 400 36,5 14,6 7,3 9,8 3,8 11,8 400 38,3 15,3 7,7 10 12,4 400 40,2 16,1 8,0 10,2 4,2 13,0 400 42,2 16,9 8,4 10,4 4,4 13,6 400 44,2 17,7 8,8 10,6 4,6 14,3 400 46,4 18,6 9,3 10,8 4,8 14,9 400 48,7 19,5 9,7 11 15,7 400 51,1 20,4 10,2 11,2 5,2 16,4 400 53,6 21,4 10,7 11,4 5,4 17,2 400 56,2 22,5 11,2 11,6 5,6 18,0 400 59,0 23,6 11,8 11,8 5,8 18,9 400 61,9 24,8 12,4 12 19,8 400 64,9 26,0 13,0 12,2 6,2 20,8 400 68,1 27,3 13,6 12,4 6,4 21,8 400 71,5 28,6 14,3 12,6 6,6 22,9 400 75,0 30,0 15,0 12,8 6,8 24,0 400 78,7 31,5 15,7 13 25,1 400 82,6 33,0 16,5 Động học phản ứng enzyme S (mM) 3,45 6,90 13,79 20,69 27,59 1/S 1/mM 0,29 0,15 0,07 0,05 0,04 V nmol/min 3,50 4,80 5,50 5,80 5,90 1/V min/µmol 285,79 207,25 181,00 171,84 170,75 48 ... học (KH) Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu thu nhận Nattokinase tái tổ hợp từ chủng Bacillus subtilis R0H1 Nội dung: - Lên men theo mẻ bán liên tục thiết bị lên men 2L - Thu hồi nattokinase - Khảo... phẩm nattokinase sản xuất từ chủng B subtilis natto kén người sử dụng chức tốt Chính lý mà hướng nghiên cứu nattokinase tái tổ hợp nhà nghiên cứu quan tâm 1.2.2 Chủng tái tổ hợp Các enzyme từ vi... Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase 1.2.1 Chủng tự nhiên 1.2.2 Chủng tái tổ hợp 1.2.3 Chủng tái tổ hợp nước 1.3 Kỹ thu? ??t lên men sinh tổng hợp nattokinase