Các bước sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp từ chủng Bacillus sp Việt Nam biết trên genbank có một số trình tự mã hóa cho protein của một số loài trong chi Bacillus.

Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung Thế kỷ 21 được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học, được coi là thời điểm lịch sử mà con tầu vũ trụ mang tên “công nghệ sinh học” đã rời khỏi bệ phóng để bay đến tầm cao mới

Đối với Việt Nam, theo xếp hạng của Biotechnologi Atlas, công nghệ sinh học (CNSH) Việt Nam đứng ở nhóm giữa trong khu vực ASEAN nhưng vẫn lạc hậu so với các nước Singapore, Thái Lan trong việc ứng dụng nghiên cứu vào sản xuất, tạo ra các sản phẩm chủ lực… Rõ ràng, Việt Nam còn rất nhiều việc phải làm để đưa các kết quả nghiên cứu “vượt” ra ngoài phòng thí nghiệm Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của sinh vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn gen trong tự nhiên và nguồn nguyên liệu để phát triển ngành công nghệ sinh học nước nhà

Công nghệ sinh học Việt Nam đang được coi là một hướng phát triển mũi nhọn của đất nước Trong đó có sự chú trọng đầu tư cho lĩnh vực công nghệ enzyme Trong đó công nghệ enzyme tái tổ hợp là một hướng đi mới

Có rất nhiều loại enzyme tái tổ hợp đã được nghiên cứu để đưa vào ứng trong thực tiễn Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực, trong đó, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm Protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ, nâng cao đời sống của con người Vì vậy nhu cầu cải tiến tạo ra enzyme Protease tái tổ hợp mang những đặc tính ưu việt hơn rất được quan tâm

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm hiểu

“ Các bước sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp từ chủng Bacillus sp Việt Nam biết trên genbank có một số trình tự mã hóa cho protein của một số loài trong chi Bacillus ”.

Chương I Tổng quan về enzyme Protease và vi

khuẩn Bacillus.

1.1 Tổng quan về enzyme Protease [2]

1.1.1 Giới thiệu chung

- Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự

Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyểnacid amin

Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ:

- Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit

- Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase

- Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit

- Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức

độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) [12] Trong cơ thể, các Protease đảm nhiệm nhiều chức nǎng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptide

các tiền chất, vận chuyển protein qua màng [8] Ngoài ra, các Protease có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tǎng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN [2] So với Protease động vật và thực vật, Protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ Protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng

1.1.2 Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật [5]

Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về

nhiều tính chất Căn cứ vào cơ

chất phản ứng, pH hoạt động

thích hợp,… các nhà khoa học đã

phân loại các Protease vi sinh vật

thành bốn nhóm như sau:

P-xerin; P-thiol; P-kim loại;

(1 Protease xerin tiêu biểu)

Hình 1.2 Cấu trúc không gian enzyme Protease

Một số tác giả khác chia Protease ra ba nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao gồm: Protease-acid; Protease trung tính; Protease kiềm

Trong bốn Protease kể trên, các Protease-xerin và Protease-thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của aa Ngược lại các Protease kim loại, Protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn suất của aa Nhiều Protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và

cơ chế tác dụng Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin

Các P-xerin có trọng lượng phân tử thấp vào khoảng 20.000 – 27.000 Dalton Tuy nhiên, cũng có một số P-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn

như các enzyme của Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp, oryzae OUT

5038 (52.000) Trọng lượng phân tử của các Protease kim loại lớn hơn so với P-xerin (vào khoảng 33.800 - 48.400) Protease tiol và nhiều Protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000-40.000 Dalton

Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật

Nhóm Nguồn E Chất kìm

hãm

Đặc điểm TTHĐ

pH tối thích

P

Xerin

Bac.subtilis Bac.pumilus Str.griseus Str.fradiae Art hrobacter B22 Asp.oryzae

Asp.flavus Asp.sojae E.coli

P-tiol Streplococcus Indoaxeta-mit -SH 7,5

Clostridium histoly-ticum

Ps.cloromer-curbenzoat

7,0

P kim

loại

Bac.subtilus Bac.subtilus NRRL B3411 Bac Subtilisamy

Losaccarilicis Bac Megaterium Psuedomonasaeruginoa Atreptomeces naraensis Asp Oryzae

Acremonium kiliense Clostridiumhisttolytium

EDTA++

1,10octa-fenantrolin

Kim loại hóa trị hai

Trung tính

P Acid Asp.niger

Asp.Awamori Sailoi,penicillium Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pucillus Endothia parasilica

Dizoaxetil Dlnorlox-inmetil este

1.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [5]

Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác Các kết quả nghiên cứu chung

về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau:

- TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại

+ Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất

+ Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của

các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho

thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 200A Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc 35 và

Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.

- Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide

Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:

Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất, P1: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng

1.2 Nguồn thu nhận Protease [8]

- Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật

- Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống [8]

E + S enzyme – S enzyme – S + P1 enzyme + P2

Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enxyme

- Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống Nhưng hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme vi sinh vật enzyme thu nhận từ các nguồn này thường rất khó và hiệu quả kinh tế không cao Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau:

+ Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm

+ Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao

+ Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao

+ Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều

+ Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp:

Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được

+ Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp

rẽ tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trường sống vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne Chính vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme

từ các nguồn khác

+ vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau [5]

2.1 Tình hình nghiên cứu enzyme trong nước

Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enayme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế [8] Và gần đây nhất là những sáng tạo mới mẽ, mang tính ứng dụng lớn được sử dụng rộng rãi như:

+ Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa,

Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm Protease

từ ruột cá Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006 Nghiên cứu này

khảo sát quá trình trích ly và tinh sạch enzyme Protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti) Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ

lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút [14]

+ Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter

sp QN6 sinh tổng hợp Prơtease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị

Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật

biển Acinetobacter sp QN6 sinh tổng hợp Prơtease [15]

+ Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc

Gia TP Hồ Chí Minh đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các

Serine Protease từ Trùn Quế” ( 2007) Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease

từ trùn quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn các protease trong dịch

chiết enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độ trong khoảng 30-80% Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động trên cơ chất casein là 550C và pH trong khoảng kiềm 10 -12 [16], [7]

+ “Nghiên cứu ứng dụng Protease bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang Qua nghiên cứu cho thấy protease B subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá

mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy

phân Khi bổ sung protease B subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp

cơ thịt cá mối và thủy phân ở 500C

+ Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các

năm 1993-1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện

Công nghiệp thực phẩm Protease của Aps oryzae được dùng để thủy phân

protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn [1]

2.2 Vấn đề sản xuất enzyme Protease trên thế giới

Trong các Protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm

hơn cả Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là Protease đầu

tiên nhận được ở dạng chế phẩm Năm 1861 Brucke cũng đã tách được

Pepxin từ dịch dạ dày Chó ở dạng tương đối tinh khiết Ngoài các enzyme của

hệ tiêu hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các Protease trong máu [10]

Các Protease thực vật được phát hiện muộn hơn Năm 1879 Wurtz được xem là người đầu tiên tách được Protease thực vật Đến nay người ta đã nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều Protease như: papain, tripxin, kimotripxin, subtilizin… [10]

Các Protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm

1950, mặc dù từ năm 1918- 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân

giải Protein của Xạ khuẩn Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các Protease của động và thực vật Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chees pha enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế [10]

Trong CNTP, người ta sử dụng Protease để sản xuất phomat từ sửa (Mohanty et al.,1999), xản xuất bánh từ bột mì (Hozova et al., 2003) hay chế biến các sản phẩm giàu protein từ đậu tương (Ghazi et al., 2003; Ma et al., 2004); trong công nghiệp thuộc da, Protease được dùng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin (Gupta, Rammani, 2006); trong chất tẩy rửa, Protease là một trong những thành phần quan trọng của tất cả các loại chất tẩy rửa, từ các chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả, kem đánh răng (Rao et al., 1998) Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và Protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) (Rao et al., 1998) [13]

Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt Protease động vật, thực vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu Thời gian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về Protease vi sinh vật và đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này (Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996) [13]) Hiện nay, số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD Trong đó khoảng 600 tấn Protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng Protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ VSV